一种微生物角蛋白酶的分离纯化及应用方法与流程

文档序号:12248867阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种微生物角蛋白酶的分离纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)种子培养:将2015年5月11号保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.10798,分类命名为副短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis进行划线活化,分离出单菌落;挑取单菌落接入LB种子培养基中,在37℃条件下培养12h;

(2)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中,摇床培养;发酵培养基按:角蛋白10g/L,可溶性淀粉10g/L,玉米粉10g/L,NaCl 1.5g/L,NH4Cl 0.5g/L,K2HPO4 0.3g/L,KH2PO4 0.4g/L,MgCl2·6H2O 0.1g/L;

(3)粗酶液的制备:在发酵培养基中定期取样检测酶活,在角蛋白酶活性达到最高值时取发酵液离心去除菌体,上清液采用真空抽滤,收集菌液;

(4)硫酸铵沉淀:向滤液中缓慢加硫酸铵粉末并搅拌至其硫酸铵浓度达到40%饱和度,于4℃静置过夜;4℃,10000rpm离心30min收集上清;向上清中加入硫酸铵粉末,至硫酸铵浓度达到70%,于4℃静置过夜;10000rpm离心30min收集沉淀;用10mM,pH 8.5的Tris-HCl缓冲液将沉淀复溶,然后用缓冲液进行透析,期间更换缓冲液3次直至透析完全;透析结束后,10000rpm离心30min去除不溶杂蛋白,收集上清液待纯化;

(5)阴离子交换层析:将步骤(4)得到的上清液上样到阴离子交换柱中,用10mM,pH 8.5的Tris-HCl缓冲液进行平衡,再用0.6M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱,并通过检测UV280nm收集第二个洗脱峰;

(6)将步骤(5)用10mM,pH 8.5的Tris-HCl缓冲液透析去盐后超滤浓缩,得到角蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的副短短芽孢杆菌角蛋白酶的分离纯化方法,其特征在于的所述的粗酶液的离心条件为4℃、10000rpm,离心30min。

3.根据权利要求1步骤所述的阴离子交换层析,其特征在于,操作的优选条件为:使用规格为a HiprepTM DEAE FF 16/10的层析柱,上样流速为1.0mL/min,检测波长为280nm。

4.根据权利要求1所获得的角蛋白酶纯酶,其酶学性质为:

(1)纯化酶的分子量为28kDa;

(2)副短短芽孢杆菌角蛋白酶纯化酶的最适反应pH和温度分别是8.0和60℃(以角蛋白酶为底物);

(3)纯化酶在pH 6.0-9.0条件下处理1h,残余酶活还有90%以上,20-40℃下,保留1h后,残余酶活还有80%以上;

(4)PMSF和EDTA可以抑制该角蛋白酶活性;

(5)金属离子Na+、K+、Ca2+对该角蛋白酶具有促进作用,Zn2+和Fe3+对该酶有抑制作用;

(5)Tween 80和Triton X-100对该酶的活性有促进作用;

(6)对该酶底物谱的研究结表明:该角蛋白酶对不同的蛋白底物催化效率由高到低的顺序是偶氮酪蛋白、羽毛粉、角蛋白和羊毛粉,而对I型胶原蛋白没有活性。

5.根据权利要求1所述的副短短芽孢杆菌角蛋白酶,其特征在于:所述的含角蛋白酶溶液可以在30-37℃条件下与羊皮共同孵育5-10h,可独立完成制革脱毛。

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