DLOHi‑C染色体构象捕获方法与流程

技术特征：

1.一种DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：

1)将目的细胞离心，然后用EGS和甲醛水溶液对目的细胞进行双交联，终止交联反应，离心分离溶解得到两管细胞；

2)分别对步骤1)得到两管细胞进行裂解，提取得到基因组-蛋白复合物A和基因组-蛋白复合物B；

3)选取一种限制性内切酶分别对两管基因组-蛋白复合物A和基因组-蛋白复合物B进行酶切消化，得到酶切产物A和酶切产物B；

4)将酶切产物A和酶切产物B与对应的双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB连接，将LinkerA和LinkeB分别连到酶切产物A和酶切产物B的-内切酶粘性末端上；离心分离得到酶连产物A和酶连产物B；其中，双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB上均含有内切酶酶切位点，且内切酶酶切位点的识别位点和切割位点不在同一位点上；

5)将酶连产物A和酶连产物B离心沉淀混合悬浮于500μl的ddH₂O中，来回吹打溶解，得到DNA-蛋白复合物；

6)向DNA-蛋白复合物中加入T4DNA ligase buffer、Triton X-100、低熔点琼脂糖和T4DNA连接酶，待管内琼脂糖凝固后酶连反应8～10h，酶连反应结束后，将离心管置于水浴锅中将低熔点琼脂糖融化，再加入琼脂糖酶消化琼脂糖；浓缩至1ml，再加入SDS水溶液和蛋白酶K消化蛋白解交联，消化结束后酚仿抽提DNA，将提取的DNA溶于ddH₂O中，测定浓度，得到的DNA即为DLO Hi-C总DNA；

7)将DLO Hi-C总DNA用识别位点和切割位点不在同一位点的内切酶进行酶切；酶切反应结束后，点样于非变性page胶中跑胶分离酶切释放出来长度为70～90bp的DLO Hi-C DNA fragment；切胶回收得到跑胶结束后用gel-red染色，并在紫外下切胶回收长度为70～90bp的DLO Hi-C DNA fragment；

8)在DLO Hi-C DNA fragment片段上连接高通量测序的测序接头，得到DLO Hi-C PCR模板；

9)根据DLO Hi-C PCR模板设计高通量测序引物对，扩增回收即得到DLO Hi-C library；

10)将DLO Hi-C library进行高通量测序，分析目的细胞中基因组的三维结果。

2.根据权利要求1所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤1)中，甲醛水溶液的质量分数为1～3％，所述终止剂为甘氨酸，所述溶解所用的溶剂为1×的NEBuffer2.1，两管细胞的细胞数目均为3×10⁶～8×10⁶个。

3.根据权利要求1或2所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤2)中，加入终浓度为1％的SDS，室温裂解细胞及细胞核20min，待溶液变粘稠后，加入1×NEBuffer2.1致终体积为500μl，混合均匀，再加入终浓度为2％的Triton X-100中和SDS；

4.根据权利要求1或2所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤3)中，限制性内切酶为NotI、HindIII、BgII、ClaI、NheI、NdeI、MspI、MboI和XbaI中任意一种；酶切体系为：

基因组-蛋白复合物A或基因组-蛋白复合物B100-200μl酶切Buffer50μl限制性内切酶(NEB 100U/μl)15μl水补充至500μl

酶切条件为，震荡酶切6-8h。

5.根据权利要求4所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述双链核苷酸序列Linker A和双链核苷酸序列Linker B上均含有内切酶酶切位点为MmeI、Ecop15i、BseRI、BpuEI、BpmI、BsgI、EciI和NmeAIII中任意一种。

6.根据权利要求5所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB如下所述：

酶连体系如下：

酶切产物A/酶切产物B500μl酶切Buffer50μlDTT(1M)1.5μlATP(100mM)10μl限制性内切酶(NEB 100U/μl)10μlT7DNA连接酶5μlLinkerA/LinkerB(800ng/μl)200μlddH₂O补充至1ml合计1ml

酶连反应如下：20℃1.5h。

7.根据权利要求1所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤5)中，SDS水溶液的质量分数为10％，DNA-蛋白复合物中SDS质量分数为1％。

8.根据权利要求1所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤6)中，

酶连体系如下：

将上述含有酶切体系的离心管置于冰上20ml，待管内琼脂糖凝固后，将离心管置于20℃酶连反应8-10h。

9.根据权利要求1所述DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：所述步骤8)中，高通量测序的测序接头命名为Illumina sequence adapter，其序列为：

PE-adaPter1

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNN

TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA

PE-adapter2

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

NNCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTG

连接体系如下：

置于16℃酶连反应2～3h。