人AQP10和SOX17基因甲基化位点的检测和应用的制作方法

本研究涉及人AQP10(aquaporin 10，水通道蛋白10)基因和SOX17(SRY(sex determining region Y)-box 17，性别决定区Y框蛋白17)基因特异性DNA(脱氧核糖核酸)甲基化位点在肝癌中的甲基化定量信息的改变，具体是指应用焦磷酸测序技术发现AQP10基因特异性DNA甲基化位点(cg20713492)在肝癌中甲基化程度降低；SOX17基因特异性DNA甲基化位点(cg02919422)在肝癌中甲基化程度升高。这些为探索肝癌的发病机理，找到与诊断或治疗相关的潜在标志物提供支持。

背景技术：

肝细胞癌是世界范围内的发病率为第六位的恶性肿瘤，而其致死率却高达第三位。肝细胞癌的危险因素包括酗酒、肝炎病毒感染、黄曲霉素摄入以及环境污染等。但由于致病因素复杂、发病机制不明，肝细胞癌的诊断和治疗都面临巨大的挑战。近年来的众多研究表明，表观遗传因素在肝癌的发生发展中起到重要作用。DNA甲基化作为主要的表观调控机制，是指DNA分子CpG二核苷酸上胞嘧啶环的5’碳原子由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine)作为甲基供体产生的一种可逆的共价修饰。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

AQP10基因位于1号染色体长臂2区1带，是水通道家族(Aquaporin，AQP)中的成员，编码蛋白位于细胞膜上，是上皮细胞吸收和排泄水、甘油、尿素等中性溶质的通道，与物质转运和代谢息息相关。AQP10在十二指肠、空肠、回肠大量表达，促进水和甘油的吸收。甘油是重新合成三酰基甘油和葡萄糖重要底物，作为控制甘油进出细胞的调节器，水通道蛋白家族的失调与代谢性疾病关系密切，如肥胖症、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病，而后者为肝癌 的风险因素之一。目前对AQP10的研究鲜有涉及肿瘤领域，Martens JH等人发现全反式维甲酸处理的急性早幼粒白血病细胞NB4细胞株中，AQP10蛋白表达上调，可能涉及组蛋白乙酰化的表观遗传学过程。

SOX17基因位于8号染色体长臂12区23带，已知参与胚胎发育调节，通过转录调控抑制Wnt信号通路。研究表明SOX17基因的广泛甲基化在大肠腺瘤到癌的恶变过程中显著增加；在乳腺癌血清中SOX17基因启动子区甲基化提示不良预后。此外，SOX17通过影响性腺发育，导致生殖细胞成熟障碍，被认是生殖细胞癌的候选诊断标志物。目前未见该基因在肝癌中的相关报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测人AQP10基因和SOX17基因特异性位点的甲基化水平及特异性引物，利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。

焦磷酸测序法定量检测人AQP10基因和SOX17基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶链式反应)引物和甲基化测序引物。其中，所述AQP10基因的PCR上游引物序列为：biotin-5′-ATTTGTTAGGATGGGGGAGGTTAG-3′，下游引物序列为：5′-TCCCTCTATCTACATAAACACACTATCAC-3′，甲基化测序引物序列为：5′-CTTTAAAACCATTAACTCAATTC-3′；SOX17基因的PCR上游引物序列为：5′-GTTATTAGGTAGGTTGGGGGTTT-3′，下游引物序列为：biotin-5′-ACCTACCCCCCTCCCCTCAA-3′，甲基化测序引物序列为：5′-TTTGGGTAAGTTGTAGATTAGAT-3′。

本发明利用Illumina infinium humanmethylation27beadchip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，AQP10基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg20713492)的甲基化水平明显低于癌旁组；而SOX17基因启动子区一个位点(cg02919422)的甲基化水平明显高于癌旁组。

为了避免甲基化芯片的筛测结果偏差，及保证筛测结果的准确性，本发明采用焦磷酸测序对两位点(cg20713492、cg02919422)的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

1.分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

2.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(cg20713492、cg02919422)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物。

3.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(cg20713492、cg02919422)位点的甲基化水平。

经检测，原发性肝细胞癌组中cg20713492位点的甲基化水平明显低于同一标本来源的癌旁组织，cg02919422位点的甲基化水平明显高于同一标本来源的癌旁组织，与甲基化芯片的筛测结果一致。表明cg20713492和cg02919422位点分别是AQP10和SOX17基因中的特异性位点。

与已有技术相比，本发明的有益效果为：本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关基因的特异性DNA甲基化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。

附图说明

图1为AQP10焦磷酸测序结果图，其中框线内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图2为SOX17基因焦磷酸测序结果图，其中框线内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1.特异性位点分析

用Infinium HumanMethylstion27 BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，AQP10基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg20713492)的甲基化水平明显低于癌旁组，SOX17基因启动子区一个位点(cg02919422)的甲基化水平明显低于癌旁组。

AQP10基因特异性位点所在的序列为(SEQ ID No.1)：

TGTGTTCATAGCCTGCTCCCAGACATTCTCTTGTTATCTCTCTGTTTCCTAGCCTACACA[CG]TGCACAGACACGTAGCTGCTGTTCAGGAACTGAGCTAATGGTTTTAAAGTCTGTTCCTTA

SOX17基因特异性位点所在的序列为(SEQ ID No.5)：

CAGGGGCGCCCGCAGTGTCACTAGGCCGGCTGGGGGCCCTGGGTACGCTGTAGACCAGAC[CG]CGACAGGCCAGAACACGGGCGGCGGCTTCGGGCCGGGAGACCCGCGCAGCCCTCGGGGCA

为检测该筛查结果的准确性，设计相关特异性引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。

2.人基因组DNA提取

1)采集42例原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组DNA，操作按照德国QIAGEN QIAamp DNA mini kit(Cat.No.51304)说明书进行。

2)对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3)重亚硫酸盐转化

使用德国QIAGEN公司转化试剂盒Epitect Bisulfite Kit(Cat.No.59104)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。

4.引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIAGEN公司PyroMark Assay Design2.0软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。

5.焦磷酸测序

1)PCR扩增

以重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，利用下列条件进行PCR反应，体系如下：

反应条件：94℃2min；

94℃30sec，60℃1min，68℃1min(50个循环)；

68℃10min.

反应完成后对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性。

2)焦磷酸测序

在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。

3)DNA甲基化检测结果

甲基化结果显示：cg20713492位点癌组的甲基化水平明显低于癌旁组，该位点癌组甲基化平均水平为23.08±14.82，癌旁组甲基化平均水平为59.72±6.57(p＜0.01)；cg02919422位点癌组的甲基化水平明显低于癌旁组，该位点癌组 甲基化平均水平为47.88±14.29，癌旁组甲基化平均水平为16.67±4.67(p＜0.01)。测序图分别见图1、2。

4)结论：研究结果发现原发性肝细胞癌中，AQP10基因cg20713492位点的甲基化水平明显低于癌旁组，SOX17基因cg02919422位点的甲基化水平明显高于癌旁组。因此，本发明针对位点cg20713492和cg02919422设计的焦磷酸测序PCR引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中两位点的甲基化水平进行定量检测。