一类检测羧酸酯酶1的高特异性荧光探针的应用的制作方法

本发明涉及一类检测羧酸酯酶1(Carboxylesterase 1，CE1)的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。

背景技术：

羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CE1)，是一种广谱性丝氨酸蛋白酶，参与很多药物与有毒物质的代谢，并参与一些其他的生理过程。CE1主要在肝中表达，在小肠、肾、肺、睾丸、心脏中有少量分布，CE1与羧酸酯酶2(carboxylesterase 2；CE2)，具有47％序列同源性，但其组织分布以及偏好底物结构特征明显异于CE2。CE1催化三角包括Ser-221,Glu-353,以及His-467，涉及两步反应机理。第一步，在丝氨酸残基作用下形成一个共价的乙酰-酶中间体，同时释放出含有醇羟基部分产物。第二步，一分子水进攻乙酰-酶中间体，同时释放出羧基部分产物。如果是其他化合物进攻乙酰-酶中间体，将发生酰基转移反应，而不是水解反应。

CE1的主要功能是异生物质代谢，它能水解含有羧酸酯键、酰胺键、硫酯键等结构的化合物。并且，CE1能代谢一些临床药物，包括可卡因、吗啡、哌替啶、杜冷丁以及利多卡因。此外，CE1能将一些前药分子，比如洛伐他汀水解为其在体内具有活性的形式。CE1将R-可卡因中甲酯键连接部分水解，生成苯甲酰爱康宁(尿中能检测到的可卡因的主要代谢产物)。当可卡因与乙醇同时存在的时候，CE1能代谢可卡因生成有毒物质可卡因乙碱。

CE1的第二大生物功能是在代谢及运输肝脏及其周边的胆固醇以及脂肪酸过程中发挥重要作用。虽然有一些其他的酶参与这些过程，但是研究者发现，在单核细胞，巨噬细胞以及肝细胞中，CE1具有非胆-盐依赖性，也被称为胆固醇水解酶(cholesteryl ester hydrolase，CEH)，胆固醇从血管壁转运至肝脏的过程被称为―巨噬细胞反向胆固醇运输”，是复原动脉粥样硬化损伤的过程，而CHE催化的胆固醇酯的水解，是调节胆固醇转移出巨噬细胞过程的限速步骤。此外，CE1具有脂肪乙酰辅酶A水解功能，CE1催化脂肪酰辅酶A和乙醇生成的脂肪酰乙酯(FAEEs)与酗酒者肝脏坏死性损伤息息相关。

CE1的第三大生物功能是在内质网中被N联糖基化位点修饰后，具有交换和保留蛋白功能。在内质网中，CE1直接与C-反应蛋白结合(C-reactive protein，CRP)，直至CRP释放到血液中。CRP的释放与组织损伤相关，迄今为止，它是最灵敏的检测动脉粥样硬化的标志物。此外，CE1同样与内质网中的II相药物代谢酶β-葡萄糖醛酸酶结合，β-葡萄糖醛酸酶用于清除异性生物质、内源性物质，如有机磷酸酯类的化合物外的外排与之相关。

此外，CE1可作为早期肝癌肿瘤标志物。Na等通过对58例肝癌患者的肝组织样本进行研究发现，与正常肝组织相比，肝癌组织中CE1表达量明显降低，表明肝癌细胞的生长可能会抑制CE1的表达。最近还发现肝癌患者血清中CE1的含量明显升高，CE1可能成为一种潜在的肝癌早期诊断的血清标志物，对CE1的检测具有重要意义。

本发明提供了一类2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物的酯类衍生物及其作为CE1酶荧光探针底物的应用，其经羧酸酯酶CE1水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光荧光属性具有明显差异。利用该探针反应可对多种生物体系中CE1的分布和功能进行定量评价。

本发明的目的在于提供一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针及其应用，该底物的酯键在人源组织或细胞中可被CE1特异性水解为相应水解产物，且产物具有荧光；该底物是以2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物为原料，通过酯化反应获得相应2-羟基酯类衍生物，其结构通式如式(1)所示，其中，R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、(4-苯基)苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。

如当R为正丙基时，该底物为2-丁酰氧基3-烯丙基苯并噁唑。

本发明还提供了CE1的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为CE1的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中CE1的活性；具体测定方法为：

——体系中以2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；单点测定时底物浓度优选K_m。

——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；

——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；

——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶CE1活性的评价指标。

本发明提供的人羧酸酯酶1特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

本发明提供的人羧酸酯酶1特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长330nm，在450～600nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应CE1活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中CE1酶活的定量测定。

该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CE1酶活的定量测定，还可用于快速筛选CE1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。

采用重组羧酸酯酶CE1单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物可特异性的经羧酸酯酶CE1代谢，生成相应的水解产物。

作为高特异性的羧酸酯酶CE1的荧光探针底物，该化合物可以用来检测羧酸酯酶CE1的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的羧酸酯酶CE1重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中CE1的活性标定。

选用本发明所述羧酸酯酶CE1的特异性探针底物检测羧酸酯酶CE1酶体外活性具有以下突出优势：

(1)高特异性：2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物可被羧酸酯酶CE1高特异性地代谢成一个代谢产物，即2位酯键断裂的水解产物。

(2)廉价易得：2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。

(3)高灵敏度：具有2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450～600nm)，该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过绘制标准曲线进行定量测定。

附图说明

图1 单酶选择性。图中数字分别代表如下(1：碳酸苷酶、2：胃蛋白酶、3：胰蛋白酶、4：脂肪酶、5：a-糜蛋白酶(a-CT)6：蛋白酶K、7：视黄醇结合蛋白、8：溶菌酶(Lozyme)、9：酸性糖蛋白、10：乙酰胆碱酯酶、11：丁酰胆碱酯酶、12：人血清白蛋白、13：牛血清白蛋白、14：羧酸酯酶2、15：羧酸酯酶1、16：缓冲溶液)

图2 2-丁酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑与羧酸酯酶1浓度线性关系。

图3 羧酸酯酶1水解2-丁酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑速率与水解氯吡格雷速率相关性。

图4 2-丁酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑细胞毒性。

图5 2-丁酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑细胞双光子成像。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，并不因此而限制本发明。

实施例1 2-乙酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑(AABO)的合成

氮气保护下，将装有0.5mmol 2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑、0.6mmol三乙胺和10mL二氯甲烷的25mL两口瓶置于冰浴中，将0.75mmol乙酰氯溶于5mL二氯甲烷，在30min内，缓慢滴加到瓶中，冰浴下搅拌1h后，室温搅拌过夜。反应液采用柱层析法分离(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5，v∶v)，得到117.7mg无色透明液体(收率，80.3％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.16(1H,dd,J＝7.8,1.4),7.74(1H,dd,J＝6.1,3.0),7.59–7.49(1H,m),7.44(1H,d,J＝6.5),7.39–7.30(3H,m),6.07–5.81(1H,m),5.14(2H,dd,J＝12.3,5.8),3.42(2H,d,J＝6.6),2.49(3H,s).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ169.68,160.04,150.13,147.62,142.02,135.42,134.35,133.34,128.47,126.35,125.39,124.54,120.56,120.31,116.83,110.43,34.64,21.30.HRMS(ESI positive)[M+H]⁺理论值294.1125，实测值294.1128.

实施例2 2-丁酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑(BABO)的合成

氮气保护下，将装有0.5mmol 2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑、0.6mmol三乙胺和10mL二氯甲烷的25mL两口瓶置于冰浴中，将0.75mmol丁酰氯溶于5mL二氯甲烷，在30min内，缓慢滴加到瓶中，冰浴下搅拌1h后，室温搅拌过夜。反应液采用柱层析法分离(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5，v∶v)，得到109.7mg无色透明液体(收率，68.3％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(d,J＝7.7Hz,1H),7.83–7.74(m,2H),7.57(d,J＝7.4Hz,1H),7.50–7.39(m,3H),5.85–5.95(m,1H),5.10(t,J＝12.8Hz,2H),3.38(d,J＝6.5Hz,2H),2.75(t,J＝7.2Hz,2H),1.78–1.64(m,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ172.05,159.98,150.04,147.57,141.59,136.14,134.66,134.26,128.65,127.07,126.36,125.45,120.41,117.14,111.31,35.93,34.41,18.06,14.09.HRMS(ESI positive)[M+H]⁺理论值322.1438，实测值322.1430.

实施例3 2-苯甲酰氧基-3-烯丙基苯并噁唑(BZABO)的合成

氮气保护下，将装有0.5mmol 2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑、0.6mmol三乙胺和10mL二氯甲烷的25mL两口瓶置于冰浴中，将0.75mmol苯甲酰氯溶于5mL二氯甲烷，在30min内，缓慢滴加到瓶中，冰浴下搅拌1h后，室温搅拌过夜。反应液采用柱层析法分离(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5，v∶v)，得到77.4mg淡黄色液体(收率，43.6％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20–8.31(3H,m),7.69(1H,t,J＝7.2),7.63–7.46(4H,m),7.42(1H,dd,J＝14.6,7.0),7.33–7.16(3H,m),6.01(1H,m),5.22–5.03(2H,m),3.49(2H,d,J＝6.6).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ165.45,160.29,150.30,147.76,141.69,138.59,136.49,135.37,134.55,133.49,133.38,132.82,130.41,128.97,128.61,126.48,125.17,124.40,120.19,116.95,110.31,34.66.HRMS(ESI positive)[M+H]⁺理论值356.1281，实测值356.1290.

实施例4重组表达的人单酶中的选择性

反应在PBS(pH＝7.4,100mM)中进行，在终体积为200μL体系中分别加入下列水解酶或结合酶：碳酸苷酶(CA)、胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)、脂肪酶(Lipase)、a-糜蛋白酶(a-CT)、蛋白酶K(Proteinase k)、视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4,RBP4)、溶菌酶(Lozyme)、酸性糖蛋白(AAG)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BChE)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、羧酸酯酶2(CE2)和羧酸酯酶1(CE1)，分别加入AABO、BABO和BZABO(终浓度都为40μM)共孵育30min，然后加入200μL冰乙腈终止反应，混匀，20000×g离心5min，取150μL上清液，利用酶标仪进行检测。(见图1)

实施例5重组单酶中CE1催化线性反应的蛋白浓度

反应在PBS(pH＝7.4,100mM)中进行，在终体积为200μL体系中分别加入不同浓度羧酸酯酶1(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0μg/mL)，加入BABO(终浓度40μM)共孵育15min，然后加入200μL冰乙腈终止反应，混匀，20000×g离心5min，取150μL上清液，利用酶标仪进行检测。计算重组人CE1酶的线性蛋白浓度(见图2)。线性曲线方程为Y＝587.7*X+264.7(R²＝0.9960)，其中Y代表荧光强度，X代表羧酸酯酶1浓度。

实施例6探针BABO的化学抑制实验

反应在PBS(pH＝7.4,100mM)中进行，反应体系为200μL，BABO终浓度40μM，羧酸酯酶1以及人肝微粒体终浓度为1μg/mL，选用的4种抑制剂(BNPP、LPA、HA、EDTA)浓度均为100μM。抑制分数通过荧光强度值(I500)减少的百分比来表示。

实施例7羧酸酯酶1水解BABO与氯吡格雷速率相关性测试

选取12例人肝微粒体，考察其水解BABO速率与氯吡格雷速率的相关性。BABO反应条件为：反应在PBS(pH＝7.4,100mM)中进行，在终体积为200μL体系中加入不同人肝微粒体(终浓度1μg/mL)及BABO(终浓度40μM)共孵育15min，然后加入200μL冰乙腈终止反应，混匀，20000×g离心5min，取150μL上清液，利用酶标仪进行检测；氯吡格雷反应条件为：底物50μM，肝微粒体100μg/mL，反应30min；氯吡格雷及水解产物采用采用高效液相色谱-紫外联用法分析，检测波长为240nm。将BABO的水解速率与氯吡格雷的水解速率分别进行了相关性拟合，相关系数采用线性回归方程的系数R²表示，P<0.005具有统计学差异。(见图3)

实施例8探针BABO细胞毒性检测

采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定探针BABO的细胞毒性。选取处于对数生长期的A549细胞，将不同浓度的探针BABO加入到培养基中，孵育48h后，将培养基换为PBS，加入MTT溶液(终浓度0.5mg/L)，在含5％CO₂培养箱中37℃培养4h后加入DMSO溶解，测定在490nm处的吸光度。(见图4)

实施例9定量测定人肺腺癌A549细胞中CE1的活性

A549细胞用MEM/EBSS培育基(含10％FBS)培育，当细胞长满70％培养瓶时，消化处理，并以1×105个/孔的浓度种植到共聚焦小皿中，置于含5％CO₂的培养箱，37℃过夜培养。贴壁细胞用无FBS的培养基，冲洗2遍后加入探针BABO(20μM)37℃继续培养30min，其中抑制组提前加入抑制剂BNPP(100μM)预孵育30min，再加入探针培养。细胞经PBS冲洗3次后，置于双光子共聚焦显微镜下观察。激发波长700nm，荧光采集范围495-540nm(见图5)。