本发明属于植物提取多糖的方法技术领域，具体涉及一种莼菜多糖的提取与分离纯化工艺。
背景技术：
莼菜(Brasenia schreber J.F.Gme1)系原始花被亚纲睡莲科(Nymphaeaceae)莼属多年生淡水水生草本植物，又名马蹄草、湖菜、水葵、露葵，原产于我国东南地区，生长于池塘、湖泊和沼泽中。莼菜具有丰富的营养价值和药用价值，，据《本草纲目》记载，莼菜具有消渴热痹、治热疸、厚肠胃、安下焦、逐水、解百毒等功效。研究表明，莼菜多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、消炎抑菌、改善便秘和增进食欲的作用，具有较高的保健价值。国外莼菜多糖价格昂贵，国际市场售价已达到3000美元/千克。
但目前关于莼菜多糖提取方面的研究极少，现阶段提取方法大致有超声波、微波和复合酶预处理后，再进行热水浸提；常温NaOH提取后用碱性蛋白酶去除蛋白。但由于莼菜多糖粘度大，难过滤、难浓缩、难纯化，故热水浸提法和NaOH提取法提取率较低，NaOH提取又存在强碱使用的安全性问题。并且这些方法提取产量低，利用率低，极大制约了莼菜产业的发展。
所以研究一种高效的莼菜多糖的提取与分离纯化技术对于莼菜产业的发展是至关重要的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种莼菜多糖的提取与分离纯化工艺。其提取率高，效果好，克服了热水浸提法和NaOH提取法提取率较低，NaOH提取又存在强碱使用的安全性问题。
为实现上述发明目的，具体提供了如下的技术方案：
一种莼菜多糖的提取与分离纯化工艺，包括如下步骤：
(1)莼菜多糖粗品的提取：
(1.1)将莼菜粉碎至100～200目，将粉碎后的莼菜放至超临界CO2萃取釜中，封釜，排除空气，通入携带剂进行萃取得提取液，萃取温度为44.0-45.5℃，萃取压力为20.5-21.5MPa，萃取二氧化碳流量为20-28L/h，携带剂为蒸馏水，用量为400-450ml/kg，萃取4-5h；
(1.2)向提取液中加入氯仿与正丁醇的混合液并摇匀，在3000～5000r/min离心5～10min，取上层清液I，所述混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1，所述提取液与混合液的的体积比为4～5:1；
(1.3)用NaOH调节上层清液至pH为7.5-8.5，然后向清液中加入活性炭进行脱色并抽滤得滤液；将滤液进一步使用蒸馏水透析36-48h得透析液；
(1.4)将透析液3000-5000r/min离心5-10min得上层清液II，将上层清液II在75℃-80℃水浴条件下浓缩至原体积的1/3-1/4，再加入3-4倍体积的95wt％乙醇，搅拌均匀后，3000-5000r/min离心5-10min得沉淀I，将沉淀I分别用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥得莼菜多糖粗品；
(2)莼菜多糖粗品的纯化
(2.1)以质量体积比1％-2％取莼菜多糖粗品及蒸馏水并混合均匀，3000-5000r/min离心5-10min除去不溶物，取上清液用1mol/L NaOH调pH至8.6-9.2，加入0.1wt％的碱性蛋白酶，46℃-50℃酶解4-5h除蛋白，8000-10000r/min离心8-10min得上层清液III；
(2.2)向上层清液III加十六烷基三甲基溴化铵至沉淀完全，静置5h，3000-5000r/min离心5-10min的沉淀II，将沉淀II用冰水洗涤三次，向沉淀II加NaCl溶液52-57℃解离3-4h，并在3000-5000r/min离心5-10min得上层清液IV；
(2.3)将上层清液IV通过处理好的312弱酸型阴离子交换树脂柱吸附，然后将树脂移入烧杯中，冰水洗至澄清止，再上柱，用0.5mol/L Na2HPO4-0.3mol/L Na2SO4洗脱液洗脱，流速1ml/min，得洗脱液；
(2.4)洗脱液使用蒸馏水透析12h，透析液80℃水浴浓缩，加三倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后，3000r/min离心10min，沉淀再分别用无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得莼菜多糖。
优选的，所述步骤(1.1)萃取温度45.2℃，萃取压力21.3MPa，携带剂为蒸馏水，用量为420.0ml/kg，萃取4.0h。
本发明的有益效果在于：
1、本发明利用超临界CO2萃取技术，克服了热水浸提法和NaOH提取法提取率较低的缺点，并且也不存在NaOH提取强碱使用的安全性问题。
2、本发明对莼菜多糖粗品纯化时，采用碱性蛋白酶处理除去蛋白质；十六烷基三甲基溴化铵能与莼菜多糖形成季胺盐络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶，在离子强度大时，络合物可以解离、溶解，分离纯化效果更好。
3、使用312弱酸型阴离子交换树脂层析，可以去除一些带正电的杂质，分离纯化效果更佳。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例所用试剂及器材：透析袋(Sigma)、312弱酸型阴离子交换树脂(罗门哈斯)，碱性蛋白酶(碧云天)、常规化学试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。
实施例1
(1)莼菜多糖粗品的提取：
(1.1)将莼菜粉碎至100～200目，将粉碎后的莼菜放至超临界CO2萃取釜中，封釜，排除空气，通入携带剂进行萃取得提取液，萃取温度为45.2℃，萃取压力为21.3MPa，萃取二氧化碳流量为25L/h，携带剂为蒸馏水，用量为420ml/kg，萃取4h；
(1.2)向提取液中加入氯仿与正丁醇的混合液并摇匀，在3000r/min离心10min，取上层清液I，所述混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1，所述提取液与混合液的的体积比为4:1；
(1.3)用NaOH调节上层清液至pH为8.0，然后向清液中加入活性炭进行脱色并抽滤得滤液；将滤液进一步使用蒸馏水透析48h得透析液；
(1.4)将透析液3000r/min离心10min得上层清液II，将上层清液II在80℃水浴条件下浓缩至原体积的1/3，再加入3倍体积的95wt％乙醇，搅拌均匀后，3000r/min离心10min得沉淀I，将沉淀I分别用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥得莼菜多糖粗品；
(2)莼菜多糖粗品的纯化
(2.1)以质量体积比1％取莼菜多糖粗品及蒸馏水并混合均匀，3000r/min离心10min除去不溶物，取上清液用1mol/L NaOH调pH至9.0，加入0.1wt％的碱性蛋白酶，50℃酶解5h除蛋白，8000r/min离心10min得上层清液III；
(2.2)向上层清液III加十六烷基三甲基溴化铵至沉淀完全，静置5h，3000r/min离心10min的沉淀II，将沉淀II用冰水洗涤三次，向沉淀II加100ml 2mol/L NaCl溶液55℃解离4h，3000r/min离心10min得上层清液IV；
(2.3)将上层清液IV通过处理好的312弱酸型阴离子交换树脂柱吸附，然后将树脂移入烧杯中，冰水洗至澄清止，再上柱，用0.5mol/L Na2HPO4-0.3mol/L Na2SO4洗脱液洗脱，流速1ml/min，得洗脱液；
(2.4)洗脱液使用蒸馏水透析12h，透析液80℃水浴浓缩，加三倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后，3000r/min离心10min，沉淀再分别用无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得莼菜多糖。
多糖含量的测定
多糖含量采用硫酸-苯酚法进行检测。多糖在浓硫酸的作用下，脱水生成糖醛及其衍生物，与苯酚结合后产生黄色物质，该物质在490nm有最大吸光值，吸光值的大小与多糖含量呈正比。
(1)葡萄糖标准曲线的制作：
称取一定量的葡萄糖于105℃烘干至恒重后，准确称取0.100g，纯水定容至100mL，即得葡萄糖标准储备液。分别准确吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL储备液，分别置于100mL容量瓶以纯水定容，配制成0，20，40，60，80，100μg/mL待测液。准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL 6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照。490nm处测吸光值，以吸光度对葡萄糖浓度进行回归，得到回归方程y＝0.0101x-0.0191，R2＝0.9841。式中：y为在波长490nm处的吸光值，x为葡萄糖的浓度.(μg/mL)。
以总糖浸出率来评价多糖得率，总糖含量按以下公式计算：
总糖含量％＝(m’×V×N)/(Vs×m×106)×100％，式中：
m’：标准曲线上查得的葡萄糖含量，μg；
V：样液体积，mL；
N：稀释倍数；
Vs：测定时吸取样液的体积，mL；
m：样品的质量，g。
将莼菜多糖提取液定容至250mL容量瓶，准确吸取1.0mL于10mL容量瓶中，以纯水定容。混匀后准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL新鲜配制的6％苯酚，5mL浓硫酸混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5ml浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照，于490nm处测定吸光值。
经含量测定，莼菜中的莼菜多糖提取率达到85.2％，纯度达到80.5％。
本发明利用超临界CO2萃取技术，克服了热水浸提法和NaOH提取法提取率较低的缺点，并且也不存在NaOH提取强碱使用的安全性问题。本发明对莼菜多糖粗品纯化时，采用碱性蛋白酶处理除去蛋白质；十六烷基三甲基溴化铵能与莼菜多糖形成季胺盐络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶，在离子强度大时，络合物可以解离、溶解，分离纯化效果更好。使用312弱酸型阴离子交换树脂层析，可以去除一些带正电的杂质，分离纯化效果更佳。并且使用本发明所述方法提取出来的莼菜多糖其提取效率高，纯度好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。