本发明涉及一种模拟脊髓组织结构和主要细胞成分的神经干细胞源性组织工程脊髓组织，应用生物组织工程技术和神经干细胞诱导分化技术在体外培养构建而成。组织工程脊髓组织的细胞由神经干细胞分化而来，含有白质样结构和灰质样结构；白质样结构由神经干细胞源性少突胶质细胞组成，灰质样结构由神经干细胞源性神经元组成；可用于移植到脊髓损伤处观察其修复效果，也可以作为神经药理和神经发育研究的体外模型。
背景技术：
：：在脊髓损伤修复的研究领域，联合利用干细胞、神经营养因子和生物材料已经展示了令人鼓舞的成果。然而，目前的联合治疗策略或单一地强调替代神经元的作用，或单一的强调移植的成髓鞘细胞的修复作用。这些对于脊髓损伤的功能修复而言都是不够的。我们的前期研究基于补充脊髓损伤后大量丢失的神经元和成髓鞘细胞。应用过表达神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)的施万细胞(Schwanncells，SCs)和过表达NT-3受体TrkC的神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)在三维明胶海绵支架中构建具有良好的突触形成潜能和髓鞘形成潜能的人工神经网络。该干细胞源性神经网络移植到大鼠脊髓全横断损伤处，不但能够提供丰富的神经营养因子促进宿主神经再生，移植的干细胞源性神经元还能与宿主神经网络良好地整合。成髓鞘细胞不仅能在体外包绕神经突起形成髓鞘，在体内也能形成大量髓鞘包绕移植神经元和宿主神经元的轴突，通过良好的成髓鞘潜能更进一步修复脊髓损伤[LaiBQ，etal.TheintegrationofNSC-derivedandhostneuralnetworksafterratspinalcordtransection.Biomaterials，2013，34：2888；LaiBQ，etal.Graftofatissueengineeredneuralscaffoldservesasapromisingstrategytorestoremyelinationafterratspinalcordtransection.StemCellsDev，2014，23：910]。睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor，CNTF)属神经调节细胞因子家族中的一员，但不属于神经生长因子家族成员。脊髓损伤后，内源性CNTF的来源严重不足。此时若补充外源性CNTF可改善神经再生的微环境[AbbaszadehHA，etal.Humanciliaryneurotrophicfactor-overexpressingstablebonemarrowstromalcellsinthetreatmentofaratmodeloftraumaticspinalcordinjury.Cytotherapy，2015，17：912]，促进损伤运动神经元存活，抑制运动神经元退变[SimonCM，etal.Ciliaryneurotrophicfactor-inducedsproutingpreservesmotorfunctioninamousemodelofmildspinalmuscularatrophy.Humanmoleculargenetics，2010，19：973]。脊髓损伤后，CNTF除了具有很强的促轴突生长作用，还能作为少突胶质细胞的保护因子，促进少突胶质细胞存活和在再生的轴突上形成髓鞘[CaoQ，etal.Transplantationofciliaryneurotrophicfactor-expressingadultoligodendrocyteprecursorcellspromotesremyelinationandfunctionalrecoveryafterspinalcordinjury.JNeuroscience，2010，30：2989]。目前我们仍面临着一些没有解决好的问题：即前期构建的干细胞源性神经网络中，神经元和髓鞘形成细胞的分布是随意和无序的，面临着宿主神经纤维无方向性的再生，分布混乱或相互缠绕，不能与移植的神经元有效地形成突触连接的问题；同时面临着成髓鞘细胞分布混乱，不能有效地包绕需要髓鞘化的神经元轴突的问题。基于国内外学者应用干细胞或组织工程技术修复脊髓损伤的启示，在我们前期成功构建神经网络修复脊髓损伤的基础上，我们设想：如果能够利用干细胞定向诱导分化与组织工程的先进技术，模拟正常脊髓的结构和主要细胞成分，在体外构建一种神经干细胞源性组织工程脊髓组织。将能引导宿主再生的神经纤维与移植的组织工程脊髓组织有序、高效地整合，更好地发挥组织工程脊髓组织的神经元中继器的作用，有效地修复脊髓的结构与功能。解决脊髓全横断损伤后自身神经通路难于重建的难题。技术实现要素：近年来，国际上针对心、肝、肾等重要脏器的体外模拟构建与移植应用相继取得突破性进展。在中枢神经组织的构建方面，也有类脑或三维大脑样组织报道。但尚未见有文献资料报道构建组织工程脊髓组织，尤其是模拟正常脊髓组织结构(周围含有白质样结构、中央含有灰质样结构)和主要细胞成分的神经干细胞源性组织工程脊髓组织的构建方法。本发明紧跟国际组织器官构建的前沿，应用干细胞与组织工程技术构建的神经干细胞源性组织工程脊髓组织，不但具备移植修复脊髓损伤的价值还能作为研究神经药理或神经发育的体外检测模型。发明方案这种组织工程脊髓组织以多孔隙明胶为主体支架，由周围的白质样结构和中央的灰质样结构装配而成。周围是一种圆环状的明胶支架(圆环外直径为3mm、圆环壁厚度为0.5mm、圆环高度为2mm)，种植有CNTF基因修饰的少突胶质前体细胞(OPCs)；中央部分是一种圆柱体的明胶支架(圆柱体直径为2mm、高度为2mm)，种植有NT-3基因及其受体TrkC基因修饰的的NSCs。应用时，将其移植到成年大鼠脊髓全横断损伤处。本发明的优点本研究构建的组织工程脊髓组织，其白质样结构主要由神经干细胞源性少突胶质细胞组成，灰质样结构主要由神经干细胞源性神经元组成，由周围部分的白质样结构和中央部分的灰质样结构组合在一起，形成类脊髓的组织结构。组织工程脊髓组织具有良好的细胞活力，能够分泌神经营养因子，促进受损伤的中枢神经元轴突再生；能够发挥少突胶质细胞和神经元相应功能，作为神经信息传递的中继器与再生的神经纤维形成突触连接，修复受损伤的神经环路。本发明将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。成功构建出具有自主知识产权的组织工程脊髓组织将能填补体外构建脊髓样组织的空白，使研究水平达到国际领先。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解生物材料、实验细胞和试剂作详尽的描述：1.主要仪器超净工作台(苏州净化电子设备厂)；普通离心机(久保田日本)；恒温水浴箱(北京医疗设备厂)；5％CO2培养箱(Queue美国)；倒置相差显微镜(Olympus日本)；荧光显微镜(Leica德国)；扫描电镜(Philips荷兰)；透射电镜(Philips荷兰)；激光共聚焦成像系统(CarlZeiss德国)；低温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高压消毒锅(江阴滨江医疗设备厂)；恒冷箱切片机(Shandon英国)；超纯水仪(Molsheim法国)；酶联免疫检测仪(Bio-Rad美国)；电泳仪电源(Bio-Rad美国)；垂直板电泳槽(Bio-Rad美国)；电转仪(Bio-Rad美国)；超高速低温离心机(Beckman美国)；-80℃超低温冰箱(RevcoTech美国)；JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EPC-10膜片钳信号放大器(Heka德国)；玻璃微电极(Sutter美国)；微电极拉制仪(Sutter美国)。2.可降解生物材料制备组织工程脊髓组织的多孔隙明胶支架材料是购自于南京金陵药业股份有限公司的产品---医用明胶海绵。3.实验细胞由中山大学实验动物中心提供SD大鼠，自行从其大脑海马中分离、培养获取NSCs。4.主要试剂DMEM-LG(Gibico)，优级胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，D-Hank’s平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma)，EDTA(Sangon)，0.01mol/lPBS(中杉金桥)，MTT(Ameresco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sangon)，Hoechst33342(Sigma)，DAPI(Sigma)，山羊血清(中杉金桥)，小鼠抗BrdU单克隆抗体(Sigma)，Cy3标记羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)，calcein-AM/EthD-IIILive/Deadkit(Biotium)，兔抗NT-3多克隆抗体(SantaCruz)，鼠抗人TrkC单克隆抗体(RD)，小鼠抗大鼠Nestin抗体(Sigma)，兔抗大鼠PSD95多克隆抗体(Abcam)，兔抗大鼠GFP多克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠NF单克隆抗体(Sigma)，小鼠抗大鼠NF单克隆抗体(Sigma)，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(Sigma)，小鼠抗大鼠synaptophysin(Sigma)，小鼠抗大鼠MBP单克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠ChAT多克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠GABA多克隆抗体(Boster)，兔抗大鼠glutamine多克隆抗体(Boster)，山羊抗小鼠FITC(JacksonImmunologicalResearch)，Cy3标记的羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)Cy3标记羊抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)，Dylight405标记的羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)，AMCA标记羊抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)，山羊抗兔HRP(JacksonImmunoResearch)，蛋白定量检测试剂盒(鼎国)，细胞裂解液(Boster)，蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)，ECL发光底物检测试剂盒(康为世纪)，Epon-812(TedPella)，考马斯亮蓝(Bio-rad)，30％聚丙烯酰胺溶液(康为世纪)，X感光胶片(Kodak)。具体操作技术1.大鼠NSCs的体外分离培养及鉴定选用出生3～5天的SD乳鼠，在无菌条件下断头取脑，将脑置于冷的D-Hank’s液中，解剖显微镜下用器械分离出海马。采用机械吹打法培养NSCs：先用眼科剪将海马组织剪碎，再连同D-IIank’s液移入离心管中用细头玻璃吸管轻轻吹打数次，直至肉眼见不到明显的组织块，吹打时应慢速并用力适度，避免产生气泡，以1000rpm离心5min，去上清，重复操作一次，用NSCs培养液重新吹打悬浮细胞沉淀，计数并调整细胞密度约为1×105/ml，将此细胞悬液移入培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱中进行悬浮培养。当观察到大量的细胞克隆球开始形成时，隔天用细头玻璃吸管机械吹打分离NSCs克隆球进行传代。传代2周后，取第2代的NSCs漂浮法进行nestin免疫荧光细胞化学鉴定。2.NSCs定向诱导为少突胶质前体细胞(OPCs)取第2代培养的NSCs，轻轻吹打分散神经球后以5×105个细胞/ml密度接种于多聚赖氨酸包被培养瓶，在原有NSCs培养液的基础上加入30ng/ml的三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，T3)、10ng/ml的血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)及10％胎牛血清作为诱导培养液。待贴壁的细胞球大量迁出、并布满培养瓶的底部时用胰酶消化法进行传代。传2代后的OPCs用于后续的免疫荧光细胞化学鉴定或者基因修饰。3.三种基因修饰细胞的制备3.1NSCs和OPCs的腺病毒载体感染率的测定用不同感染复数(multiplicityofinfection，MOI)的Ad-GFP(报告基因重组腺病毒载体)在无血清培养液中分别感染NSCs和OPCs3小时，弃病毒残液，加入正常培养液继续培养12～24小时，然后用光镜观察GFP阳性细胞的百分比(感染率)，确定一个感染率在90％以上的病毒剂量。3.2TrkC基因或NT-3基因修饰NSCs的制备用一定剂量(按测定感染率的)Ad-TrkC或Ad-NT-3在无血清培养液中感染NSCs3小时，弃病毒残液，加入正常培养液继续培养24小时。取少量细胞用于免疫组织化学鉴定TrkC基因或NT-3基因修饰NSCs的比例，用Westernblot方法测定TrkC基因修饰NSCs中TrkC的表达量，用ELISA方法测定NT-3基因修饰NSCs培养液上清中NT-3的含量，并检测其生物活性。3.3CNTF基因修饰OPCs的制备方法基本同上(用ELISA方法测定CNTF基因修饰OPCs培养液上清中CNTF的含量，并检测其生物活性)。4.多孔隙明胶圆柱体支架的构建所述的组织工程脊髓组织的支架主体可分为两部分：周围部分的明胶结构是一种圆环状的支架(圆环外直径为3mm、圆环壁厚度为0.5mm、圆环高度为2mm)，中央部分的明胶结构是一种圆柱体的支架(圆柱体直径为2mm、高度为2mm)。这些支架材料是购自于南京金陵药业股份有限公司无菌医用明胶海绵，在超净工作台中将其剪裁制备成上述的形貌的周围和中央两部分。上述构建的周围部分的明胶结构用于种植CNTF基因修饰的OPCs，将形成组织工程脊髓组织的白质样结构；中央部分的明胶结构用于种植NT-3基因和TrkC基因修饰的NSCs，将形成组织工程脊髓组织的灰质样结构。5.组织工程脊髓组织的体外培养5.1白质样结构的培养(图1)将圆环状的多孔隙明胶支架固定在培养皿内，将CNTF基因修饰的OPCs按照2.5×105的细胞总量，缓慢悬滴到该结构的两端，加入常规培养液，于37℃、5％CO2在旋转式生物反应器内培养7天。5.2灰质样结构的培养(图1)将中央部分的圆柱形多孔隙明胶支架固定在培养皿内，将NT-3基因和TrkC基因分别修饰的NSCs，细胞总量为7.5×105，按照1∶1的比例，缓慢悬滴到该结构的两端，加入常规培养液，于37℃、5％CO2。在旋转式生物反应器内培养7天。5.3白质样结构和灰质样结构的共培养构建组织工程脊髓组织(图1)将培养构建的圆柱形灰质样结构安置入培养构建的白质样结构的圆环内，加入常规培养液，于37℃、5％CO2在旋转式生物反应器内培养7天。6.组织工程脊髓组织神经网络结构的检测用免疫组织化学、共聚焦荧光显微镜和免疫电镜等技术观察组织工程脊髓组织的灰质样结构内NSCs分化的神经元之间建立突触联系以及合成神经递质情况，验证其是否形成以神经元为主的神经网络，以及验证该神经网络是否有突触形成潜能。同时观察组织工程脊髓组织的白质样结构内髓鞘形成情况，验证其是否能够形成髓鞘包绕神经元轴突。附图说明：图1：组织工程脊髓组织的体外构建示意图。分3步，A：将CNTF-OPCs种植到环形的多孔隙明胶支架内，置于旋转式生物反应器内培养7天构建组织工程脊髓组织的白质样结构；B：将NT-3-NSCs和TrkC-NSCs种植到圆柱形的明胶支架内。置于旋转式生物反应器内培养7天构建组织工程脊髓组织的灰质样结构；C：将分别培养7天的灰质样结构装配到白质样结构的圆环内，再将初步构建的组织工程脊髓组织整体置于旋转式生物反应器内培养7天或14天，构建组织工程脊髓组织。当前第1页1 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