一种对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物及其制备方法，属于材料科学和生物分离工程领域。

背景技术：
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糖蛋白是寡糖链通过共价键连接到蛋白上的一类重要的后翻译蛋白。糖基化后的蛋白参与生命体中许多生理活动比如细胞的识别、信号的传递、免疫响应等。同时有大量的研究表明糖链结构的异常与许多疾病的发生有关，因此有些糖蛋白又可作为某些疾病的生物标志。因而对糖蛋白结构的研究以及对异常糖蛋白的检测有着重要的意义。然而对于实际的样品而言，糖蛋白的低丰度，以及电离效率较低，因而很难通过生物质谱直接对生物样品中糖蛋白进行有效的分析。因此对复杂的生物样品分析之前有必要对糖蛋白有选择的富集。然而目前制备对糖蛋白有富集作用的材料主要是在一些固相的纳米材料(磁性的四氧化三铁，介孔二氧化硅)上修饰与糖蛋白有相互作用的识别单元。一方面将识别单元固定在固体基质上的过程比较繁琐，同时识别单元的固定量往往也较低，另一方面由于固液界面传质困难使得该材料富集能力进一步较低，同时也延长了孵化时间，降低了工作效率。

智能型聚合物是指对外界刺激(温度、pH值、溶剂、盐浓度、电场以及化学物质)能产生敏感响应的一类高分子聚合物。其中聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)是一种温度响应型聚合物，当温度高温LCST(32℃)时，聚合物的构象会从无规线团转变为蜷曲球(coil-to-globule)，从而使聚合物从水中析出。然而糖蛋白是生物大分子，分子量较高，且构象复杂，虽然在温度响应型聚合物上引入识别单元可以实现糖蛋白的捕获，但是就单个分子链而言很难将糖蛋白从混合溶液中分离出来。

传统意义上的星型聚合物的中心核只是一个结点,中心核的尺寸和分子量在整个聚合物分子中所占的比例可忽略不计,聚合物所表现出来的性质主要由线形支链决定。但如果中心核的尺寸达到纳米级,聚合物的性质则将明显受到纳米核的制约,从而表现出与线形支链不一样的特性。人们称这种聚合物为核交联星型聚合物(core Cross-linked star Polymer,CCS Polymer)。制备CCS聚合物的方法有两种,一种是“臂优先”法,另一种是“核优先”法。CCS聚合物因结构上具有交联内核和向核外空间伸展的聚合物外臂，而具有独特的三维结构，在诸多领域有着重要的应用。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物及其制备方法。通过“先臂后核”的途径及RAFT聚合，制备出了对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物。其中富集过程只需改变溶液的温度便可实现。

为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:

(1)核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成

将链转移剂三硫代碳酸酯(DMP)、亲水单体丙烯酰胺(AM)、识别单元、油溶性引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，按照1:(0～100):50:0.1摩尔比加入到水和二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中，在惰性气氛下，60～80℃反应12～24h，聚合结束后,对聚合物提纯,得到能够特异性捕获糖蛋白的亲水外臂(PAA-DMP)；将上述的亲水外臂PAA-DMP作为大分子链转移剂、温敏单体、交联剂、疏水单体苯乙烯(St)、引发剂AIBN，按照(50～200):(150～300):(5～20):(10～50):1质量比加到水和DMF混合溶剂中，在惰性气氛下,60～80℃反应12～24h，聚合结束后,对聚合物提纯,得到纯净的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物(PNSB@PAA-DMP)。

(2)糖蛋白的富集

取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到PH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；将孵化之后的蛋白溶液加热至35℃，保温5min，这时可以看到有大量的沉淀析出；通过离心将络合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP聚合物从混合溶液中分离出来；多次洗涤非特异性吸附之后，降低溶液的pH使星型聚合物将络合的糖蛋白释放，完成糖蛋白的富集。

与现有技术相比，本分明具有如下优点：

1)当温度在LCST之下星型聚合物完全溶于水中，消除了固液界面所引起的物质传递困难，使得糖蛋白的富集时间缩短，富集容量提高；当温度高于LCST，此时亲水的交联内核变为疏水的内核，络合有糖蛋白的星型聚合物从溶液中析出，实现了糖蛋白的分离过程。

2)通过臂优先法固定识别单元方法相对简单，且固定量高，同时所形成的三维的柔性外臂与糖基位点的协同作用，将会进一步增加吸附容量。

3)本发明所合成的温度响应型核交联星型聚合物为样品中特定对象的选择分离提供了一种有效的分离方法，因为只需要改变外臂上的识别单元，就可以实现核交联星型聚合物对不同对象的特异性捕获，然后再通过改变温度，络合有目标分子的温度响应型聚合物便可以从混合溶液中析出，达到富集的目的。

附图说明

图1是本发明的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物的合成示意图；

图2是本发明的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物的核磁氢谱；

图3是本发明的温度响应型核交联星型聚合物对辣根过氧化物酶(HRP)的富集容量。

具体实施方式：

实施例1

(1)核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成

链转移剂三硫代碳酸酯(DMP)、亲水单体丙烯酰胺(AM)、识别单元并酰胺基苯硼酸(AAPBA)、油溶性引发剂AIBN，按照1:100:50:0.1摩尔比加入到水和二甲基甲酰胺混合溶剂。在惰性气氛下，70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯,得到能够特异性捕获糖蛋白的亲水外臂(PAA-DMP)。将上述的亲水外臂PAA-DMP作为大分子链转移剂、温敏单体选用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、交联剂选用N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、疏水单体苯乙烯(St)引发剂AIBN，按照50:282:7.8:25:1质量比加到水和二甲基甲酰胺混合溶剂中。在惰性气氛下，70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯,便得到纯净的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP。

(2)糖蛋白的富集

取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到PH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；将孵化之后的蛋白溶液加热至35℃，保温5min，这时可以看到有大量的沉淀析出；通过离心将络合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP从混合溶液中分离出来；多次洗涤非特异性吸附之后，降低溶液的PH使星型聚合物将络合的糖蛋白释放，完成糖蛋白的富集。

实施例2

(1)核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成

链转移剂三硫代碳酸酯(DMP)、亲水单体丙烯酰胺(AM)、识别单元乙烯基苯硼酸(APBA)、油溶性引发剂AIBN，按照1:100:50:0.1摩尔比加入到水和二甲基甲酰胺混合溶剂。在惰性气氛下，70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯，得到能够特异性捕获糖蛋白的亲水外臂(PAA-DMP)。将上述的亲水外臂PAA-DMP作为大分子链转移剂、温敏单体选用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、交联剂选用N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、疏水单体苯乙烯(St)引发剂AIBN，按照50:282:7.8:25:1质量比加到水和二甲基甲酰胺混合溶剂中。在惰性气氛下,70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯,便得到纯净的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP。

(2)糖蛋白的富集

取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到pH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；将孵化之后的蛋白溶液加热至35℃，保温5min，这时可以看到有大量的沉淀析出；通过离心将络合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP从混合溶液中分离出来；多次洗涤非特异性吸附之后，降低溶液的PH使星型聚合物将络合的糖蛋白释放，完成糖蛋白的富集。

实施例3

(1)核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成

链转移剂三硫代碳酸酯(DMP)、识别单元乙烯基苯硼酸(APBA)、油溶性引发剂AIBN，按照1:50:0.1摩尔比加入到水和二甲基甲酰胺混合溶剂。在惰性气氛下，70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯,得到能够特异性捕获糖蛋白的亲水外臂(PAA-DMP)。将上述的亲水外臂PAA-DMP作为大分子链转移剂、温敏单体选用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、交联剂选用N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、疏水单体苯乙烯(St)引发剂AIBN，按照50:282:7.8:25:1质量比加到水和二甲基甲酰胺混合溶剂中。在惰性气氛下，70℃反应24h，聚合结束后，对聚合物提纯,便得到纯净的对糖蛋白具有富集作用的温度响应型核交联星型聚合物PNSB@PAA-DMP。

(2)糖蛋白的富集

取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到pH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；将孵化之后的蛋白溶液加热至35℃，保温5min，这时可以看到有大量的沉淀析出；通过离心将络合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP从混合溶液中分离出来；多次洗涤非特异性吸附之后，降低溶液的PH使星型聚合物将络合的糖蛋白释放，完成糖蛋白的富集。