一种生产氨基葡萄糖的方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种生产氨基葡萄糖的方法。
背景技术：
：氨基葡萄糖，又叫葡萄糖胺(glucosamine，glcn)，简称氨糖，广泛存在于动物外骨骼及微生物细胞壁中。氨基葡萄糖广泛应用于食品、保健、化妆品、医药等行业。氨基葡萄糖是形成软骨组织细胞的重要营养素，是健康关节软骨组织的天然组成成分，可以帮助修复和维护软骨组织，并能刺激软骨组织细胞的生长与发育。目前，氨基葡萄糖的生产方法主要是甲壳素水解法。甲壳素水解法是酸解虾蟹壳中的甲壳素生产氨基葡萄糖，此方法造成了海洋资源的过渡捕捞，而且加工处理工艺产生的废液对环境污染较为严重，相关研究表明，利用该种方法得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种生产氨基葡萄糖的方法。本发明提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以n-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。所述n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为ecdac蛋白；所述ecdac蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为vcdac蛋白；所述vcdac蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为tmdac蛋白；所述tmdac蛋白为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述几丁二糖脱乙酰酶为tkdac蛋白；所述tkdac蛋白为如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述功能基因为ecdac基因；所述ecdac基因为如下(e1)或(e2)或(e3)的dna分子：(e1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；(e2)在严格条件下与(e1)限定的dna序列杂交且编码ecdac蛋白的dna分子；(e3)与(e1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码ecdac蛋白的dna分子。所述功能基因为vcdac基因；所述vcdac基因为如下(f1)或(f2)或(f3)的dna分子：(f1)编码区如序列表中序列3所示的dna分子；(f2)在严格条件下与(f1)限定的dna序列杂交且编码vcdac蛋白的dna分子；(f3)与(f1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码vcdac蛋白的dna分子。所述功能基因为tmdac基因；所述tmdac基因为如下(g1)或(g2)或(g3)的dna分子：(g1)编码区如序列表中序列5所示的dna分子；(g2)在严格条件下与(g1)限定的dna序列杂交且编码tmdac蛋白的dna分子；(g3)与(g1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码tmdac蛋白的dna分子。所述功能基因为tkdac基因；所述tkdac基因为如下(h1)或(h2)或(h3)的dna分子：(h1)编码区如序列表中序列7所示的dna分子；(h2)在严格条件下与(h1)限定的dna序列杂交且编码tkdac蛋白的dna分子；(h3)与(h1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码tkdac蛋白的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。所述出发载体可为载体pbad/hisb。所述重组质粒具体可为：在载体pbad/hisb的多克隆位点(例如xhoi和ecori之间、ncoi和ecori之间或xhoi和spei之间)插入所述功能基因，得到的重组质粒。所述出发载体还可为pet系列质粒、petduet系列质粒、ptxb1系列质粒、ptub1系列质粒、ptyb1系列质粒等。所述出发菌可为大肠杆菌。所述出发菌可为大肠杆菌bw25113。所述出发菌还可为bl21系列菌株、rosetta系列菌株、bw25113系列菌株、origami系列菌株等。所述方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，n-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/l。所述液相反应体系的溶剂为ph8.0的tris-hcl缓冲液。所述液相反应体系由工程菌、n-乙酰氨基葡萄糖、tritonx-100和ph8.0的tris-hcl缓冲液组成。初始体系od600nm＝30。初始体系中，n-乙酰氨基葡萄糖浓度为50g/l、tritonx-100浓度为0.1％(体积百分含量)。所述方法中，反应条件为：25℃-42℃(优选30-37℃)、1-3h。所述方法中，反应条件为：37℃、1h。所述方法中，反应ph为7.0-8.0，优选为7.5-8.0。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌培养至od600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入l-阿拉伯糖进行诱导；(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌接种至液体培养基(例如lb液体培养基或2yt液体培养基或m9培养基)，振荡培养至od600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，振荡培养12小时；(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌接种至液体培养基(例如lb液体培养基或2yt液体培养基，液体培养基中还可含有抗生素，例如50μg/ml链霉素)，37℃、220rpm振荡培养至od600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，30℃、200rpm振荡培养12小时；(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集细胞沉淀，即为工程菌。本发明还保护将重组质粒导入出发菌得到的重组菌；所述重组质粒为将功能基因插入出发载体得到的；所述出发菌为大肠杆菌；所述出发载体为载体pbad/hisb；所述功能基因为编码功能蛋白的基因。所述重组质粒具体可为：在载体pbad/hisb的多克隆位点(例如xhoi和ecori之间、ncoi和ecori之间或xhoi和spei之间)插入所述功能基因，得到的重组质粒。所述出发菌可为大肠杆菌bw25113。本发明还保护所述重组菌在制备氨基葡萄糖中的应用。所述应用中，以n-乙酰氨基葡萄糖为原料。本发明还保护一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以n-乙酰氨基葡萄糖为原料，在功能蛋白的作用下，生产氨基葡萄糖。所述方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，n-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/l。所述液相反应体系的溶剂为ph8.0的tris-hcl缓冲液。所述方法中，反应条件为：25℃-42℃(优选30-37℃)、1-3h。所述方法中，反应条件为：37℃、1h。所述方法中，反应ph为7.5-8.0。所述功能蛋白的存在形式可为：完整的微生物细胞、细胞破碎液、粗酶或纯酶。本发明提供的方法，不受资源限制，对环境污染小，符合环保要求。采用本发明提供的方法制备氨基葡萄糖，反应条件温和、工艺路线简单、产物纯度高、适合大规模的工业化生产，非常适于推广应用。附图说明图1将n-乙酰氨基葡萄糖标准品和氨基葡萄糖标准品的hplc图谱。图2为重组菌ⅱ进行相应步骤后的hplc图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。对于同一条件参数下的不同次反应的色谱图来说，目标峰保留时间会有一定的误差范围，一般相差0.1min内可以视为误差。载体pbad/hisb：购自invitrogen公司，产品目录号：v430-01。大肠杆菌bw25113：biovectorntccinc，货号为355297。n-乙酰氨基葡萄糖：购自aladdin公司，产品目录号：a105211。氨基葡萄糖标准品：购自aladdin公司，产品目录号：g100089。氨基葡萄糖的结构式如下：实施例1、构建重组菌一、构建重组菌ⅰ构建重组质粒pbad/hisb-ecdac。根据测序结果，对重组质粒pbad/hisb-ecdac进行结构描述如下：将载体pbad/hisb的xhoi和ecori酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列1所示的双链dna分子。序列表的序列1所示的dna分子编码序列表的序列2所示的蛋白质。序列表的序列2所示的蛋白质为来源于大肠杆菌(escherichiacoli)的n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称ecdac蛋白。将重组质粒pbad/hisb-ecdac导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌ⅰ。二、构建重组菌ⅱ构建重组质粒pbad/hisb-vcdac。根据测序结果，对重组质粒pbad/hisb-vcdac进行结构描述如下：将载体pbad/hisb的xhoi和ecori酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3所示的双链dna分子。序列表的序列3所示的dna分子编码序列表的序列4所示的蛋白质。序列表的序列4所示的蛋白质为来源于霍乱弧菌(vibriocholerae)的n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称vcdac蛋白。将重组质粒pbad/hisb-vcdac导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌ⅱ。三、构建重组菌ⅲ构建重组质粒pbad/hisb-tmdac。根据测序结果，对重组质粒pbad/hisb-tmdac进行结构描述如下：将载体pbad/hisb的ncoi和ecori酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列5所示的双链dna分子。序列表的序列5所示的dna分子编码序列表的序列6所示的蛋白质。序列表的序列6所示的蛋白质为来源于海栖热袍菌(thermotogamaritima)的n-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，简称tmdac蛋白。将重组质粒pbad/hisb-tmdac导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌ⅲ。四、构建重组菌ⅳ构建重组质粒pbad/hisb-tkdac。根据测序结果，对重组质粒pbad/hisb-tkdac进行结构描述如下：将载体pbad/hisb的xhoi和spei酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列7所示的双链dna分子。序列表的序列7所示的dna分子编码序列表的序列8所示的蛋白质。序列表的序列8所示的蛋白质为来源于嗜热古菌(thermococcuskodakaraensis)的几丁二糖脱乙酰酶，简称tkdac蛋白。将重组质粒pbad/hisb-tkdac导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌ⅳ。五、构建重组菌ⅴ将载体pbad/hisb导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌ⅴ。实施例2、应用重组菌制备氨基葡萄糖一、制备菌体试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌ⅰ、重组菌ⅱ、重组菌ⅲ、重组菌ⅳ、重组菌ⅴ或大肠杆菌bw25113。1、取试验菌株的单克隆，接种到含50μg/ml链霉素的lb液体培养基(实际应用中，也可采用2yt液体培养基)，37℃、220rpm振荡培养至od600nm＝0.7(实际应用中，od600nm＝0.6-0.8均可)。2、完成步骤1后，在培养体系中加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，30℃、200rpm振荡培养12小时。3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集细胞沉淀。重组菌ⅰ得到的细胞沉淀命名为菌体ⅰ。重组菌ⅱ得到的细胞沉淀命名为菌体ⅱ。重组菌ⅲ得到的细胞沉淀命名为菌体ⅲ。重组菌ⅳ得到的细胞沉淀命名为菌体ⅳ。重组菌ⅴ得到的细胞沉淀命名为菌体ⅴ。大肠杆菌bw25113得到的细胞沉淀命名为菌体ⅵ。二、制备氨基葡萄糖试验菌体分别为：步骤一制备的菌体ⅰ、菌体ⅱ、菌体ⅲ、菌体ⅳ、菌体ⅴ或菌体ⅵ。将试验菌体、n-乙酰氨基葡萄糖(底物)、tritonx-100和ph8.0的tris-hcl缓冲液混匀，即为初始体系。初始体系od600nm＝30。初始体系中，底物浓度为50g/l、tritonx-100浓度为0.1％(体积百分含量)。初始体系37℃反应1小时(反应过程中，实时监测ph,用2mnaoh水溶液控制ph为7.5-8.0)。完成反应后，即为终止体系。检测终止体系中的氨基葡萄糖浓度。进行三次重复试验，每次重复中每种菌体设置五个重复处理。检测氨基葡萄糖浓度的方法如下(hplc)：取终止体系，13000rpm离心3min，收集上清液，用无菌水稀释得到稀释液，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤并收集滤液。将滤液作为上样液。色谱柱：agilentxdb-c18；hplc系统：agilent1260；流动相：由3体积份乙腈和97体积份乙酸钠缓冲液组成；乙酸钠缓冲液：含10mm乙酸钠和5mm正庚烷磺酸钠，余量为水(用乙酸调ph至4.5)。流速：1.0ml/min；温度：40℃；进样量10μl；检测器：rid。将n-乙酰氨基葡萄糖标准品和氨基葡萄糖标准品在相同条件下进行hplc。图谱见图1。n-乙酰氨基葡萄糖标准品(glcnac)的出峰位置为1.808min。氨基葡萄糖标准品(glcn)的出峰位置为5.483min。用氨基葡萄糖标准品建立氨基葡萄糖与峰面积的标准曲线方程如下：y＝93018x+2368.8，r2＝0.9978(x为氨基葡萄糖的浓度，单位为g/l；y为hplc色谱图中的峰面积)。重组菌ⅱ进行上述步骤的相应图谱见图2(分别在1.804min和5.476min显示出峰)。采用各个不同试验菌体时，终止体系中的氨基葡萄糖浓度见表2(平均值)。表2终止体系中的氨基葡萄糖浓度重组菌ⅰ35.7g/l重组菌ⅱ40.8g/l重组菌ⅲ17.6g/l重组菌ⅳ10.2g/l重组菌ⅴ0g/l菌体ⅵ0g/l序列表<110>中国科学院微生物研究所<120>一种生产氨基葡萄糖的方法<130>gncyx162025<160>8<210>1<211>1149<212>dna<213>人工序列<400>1atgtatgcattaacccagggccggatctttaccggccacgaatttcttgatgaccacgcg60gttgttatcgctgatggcctgattaaaagcgtctgtccggtagcggaactgccgccagag120atcgaacaacgttcactgaacggggccattctctcccccggttttatcgatgtgcagtta180aacggctgcggcggcgtacagtttaacgacaccgctgaagcggtcagcgtggaaacgctg240gaaatcatgcagaaagccaatgagaaatcaggctgtactaactatctgccgacgcttatc300accaccagcgatgagctgatgaaacagggcgtgcgcgttatgcgcgagtacctggcaaaa360catccgaatcaggcgttaggtctgcatctggaaggtccgtggctgaatctggtaaaaaaa420ggcacccataatccgaattttgtgcgtaagcctgatgccgcgctggtcgatttcctgtgt480gaaaacgccgacgtcattaccaaagtgaccctggcaccggaaatggttcctgcggaagtc540atcagcaaactggcaaatgccgggattgtggtttctgccggtcactccaacgcgacgttg600aaagaagcaaaagccggtttccgcgcggggattacctttgccacccatctgtacaacgcg660atgccgtatattaccggtcgtgaacctggcctggcgggcgcgatcctcgacgaagctgac720atttattgcggtattattgctgatggcctgcatgttgattacgccaacattcgcaacgct780aaacgtctgaaaggcgacaaactgtgtctggttactgacgccaccgcgccagcaggtgcc840aacattgaacagttcatttttgcgggtaaaacaatatactaccgtaacggactttgtgtg900gatgagaacggtacgttaagcggttcatccttaaccatgattgaaggcgtgcgtaatctg960gtcgaacattgcggtatcgcactggatgaagtgctacgtatggcgacgctctatccggcg1020cgtgcgattggcgttgagaaacgtctcggcacactcgccgcaggtaaagtagccaacctg1080actgcattcacacctgattttaaaatcaccaagaccatcgttaacggtaacgaggtcgta1140actcaataa1149<210>2<211>382<212>prt<213>人工序列<400>2mettyralaleuthrglnglyargilephethrglyhisglupheleu151015aspasphisalavalvalilealaaspglyleuilelysservalcys202530provalalagluleuproprogluilegluglnargserleuasngly354045alaileleuserproglypheileaspvalglnleuasnglycysgly505560glyvalglnpheasnaspthralaglualavalservalgluthrleu65707580gluilemetglnlysalaasnglulysserglycysthrasntyrleu859095prothrleuilethrthrseraspgluleumetlysglnglyvalarg100105110valmetargglutyrleualalyshisproasnglnalaleuglyleu115120125hisleugluglyprotrpleuasnleuvallyslysglythrhisasn130135140proasnphevalarglysproaspalaalaleuvalasppheleucys145150155160gluasnalaaspvalilethrlysvalthrleualaproglumetval165170175proalagluvalileserlysleualaasnalaglyilevalvalser180185190alaglyhisserasnalathrleulysglualalysalaglyphearg195200205alaglyilethrphealathrhisleutyrasnalametprotyrile210215220thrglyarggluproglyleualaglyalaileleuaspglualaasp225230235240iletyrcysglyileilealaaspglyleuhisvalasptyralaasn245250255ileargasnalalysargleulysglyasplysleucysleuvalthr260265270aspalathralaproalaglyalaasnilegluglnpheilepheala275280285glylysthriletyrtyrargasnglyleucysvalaspgluasngly290295300thrleuserglyserserleuthrmetilegluglyvalargasnleu305310315320valgluhiscysglyilealaleuaspgluvalleuargmetalathr325330335leutyrproalaargalaileglyvalglulysargleuglythrleu340345350alaalaglylysvalalaasnleuthralaphethrproaspphelys355360365ilethrlysthrilevalasnglyasngluvalvalthrgln370375380<210>3<211>1209<212>dna<213>人工序列<400>3atgggtacctctcatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcctc60gagtctaacgcgatgtatgcgctgaccaactgcaaaatctacacgggcaacgatgttctg120gtaaaacacgctgtgatcattaacggtgacaaaatcgaagcggtgtgtccgatcgaatct180ctgccgtctgaaatgaacgttgttgacctgaatggtgcgaacttgtctccaggttttatc240gatctgcaactgaacggttgcggtggtgtaatgttcaacgacgaaatcaccgccgaaact300atcgataccatgcataaggctaacctgaaatctggttgtacttctttcctgcccactctg360atcacctcttctgacgaaaacatgcgtcaggcaatcgcggcagcgcgtgaataccaagca420aaatatcctaaccagagcctcgggctgcacttggaaggtccgtacctgaacgtcatgaaa480aaaggcattcacagcgttgactttatccgtccgagcgacgacaccatgatcgataccatc540tgtgcgaactcagacgttattgcaaaagttaccctggcgcctgaaaacaacaaaccagaa600catatcgagaaactggtgaaagcgggcattgtggttagcatcggtcacaccaatgccact660tattctgaagcacgcaaatccttcgagtccggcattacattcgcaacccatctgttcaac720gctatgaccccgatggttggtcgcgaaccgggtgtcgtaggcgcgatctacgacacccca780gaagtttatgccggtatcattgcggacggttttcacgtggattacgctaacatccgtatc840gcacacaaaatcaaaggtgaaaaactcgt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