专利名称：一种氨基葡萄糖中有关物质的hplc-elsd测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方法，属 于药物制剂分析检测领域。
背景技术：
氨基葡萄糖，一种食品添加剂，是解除骨关节病痛楚，有助于提高人们的生活质 量。骨关节炎在老年人中的发病率很高，在北京高达38.7%、上海13%，而且这种病目前尚 无理想的治疗方法。为此，预防和缓解病痛成为骨关节炎治疗的关键。目前，国际上常用的 预防和缓解骨关节炎的功能性食品配料主要有氨基葡萄糖、透明质酸、胶原肽等。氨基葡萄 糖对骨关节炎的疗效首先由德国医师在1969年发现。近年研究表明，它是结缔组织与软骨 细胞的主要成分，是关节软骨基质中糖蛋白和氨基葡聚糖链的基本单元。补充氨基葡萄糖 可促进软骨细胞合成生理性的糖蛋白和氨基葡聚糖，以修补受损的软骨。此外，氨基葡萄糖 还可防止有害的超氧自由基的生成，研究显示，它具有消炎和止痛的作用，因此被作为防止 和改善软骨组织退化所引发的各种疾病的有效辅助药物。氨基葡萄糖除有利于缓解关节病 痛外，还具有促进肠道免疫、增强大脑记忆功能等效果。动物试验表明，用含有5%氨基葡萄 糖的饲料喂养老鼠，其记忆与学习能力超过对照群。这意味着对老年人记忆衰退和痴呆症 的预防也有一定的帮助。其改善脑功能的效果不亚于DHA银杏叶抽提物。由于氨基葡萄糖 无毒，罕有不良反应，日本、美国广泛将其作为食品配料，以预防或改善骨关节病的症状。长 期食用可使关节保持活络、行走轻松。氨基葡萄糖在酸性下最稳定，因此最适合用于果汁、 酸奶等食品，尤其是柑橘类食品。从市场需求量不难看出氨基葡萄糖受欢迎的程度。2006 年最新数据显示，美国市场需求量达到5000-6000吨，日本市场总销售额达20亿日元，其终 端产品高达400亿日元，是原料的20倍。现在，日本已有100多家大食品企业和医药企业 从事着销售氨基葡萄糖，市场需求进一步增长。氨基葡萄糖是用虾蟹等甲壳做原料，经脱 钙、脱乙酰化后作为壳聚糖，然手水解而成。目前，我国已能大量生产氨基葡萄糖，尤其是浙 江、山东等沿海地区，除少量供应制造药物外，不少是以每千克3000-3500日元出口美国和 日本。氨基葡聚糖是来源于甲壳素的一种天然糖类，为软骨基质中的主要成分，通过改 变其侧链结构，在关节软骨中更易与水结合，保持关节腔润滑和缓冲压力的作用，对受损的 软骨细胞具有一定的保护作用，可以人工合成应用，现有常用的有氨基葡萄糖、盐酸氨基葡 萄糖、硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐或氯化钾复盐等。氨基葡萄糖是组成聚氨基葡萄糖的最 小单位之一，它和糖醛酸组成了聚氨基葡萄糖，包括硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素 以及透明质酸。抗炎类药物仅可以改善骨性关节炎的症状，而氨基葡聚糖还可控制症状发展，有 利于软骨的修复。在美国氨基葡聚糖和硫酸软骨素的制剂已添加至食品中，具有非常高的 安全信度。口服该类药物即可达到治疗目的，对于一些伴有循环系统疾病、肝肾功能差、肺 部疾病、糖尿病的患者，同样具有安全性，对于服用添加镁、锌、硒等金属元素的制剂，应注意这些金属电解后产生的对心血管的抑制作用。每日口服剂量达到1500mg即可达到治疗 效果，对于肥胖或长期口服利尿剂的患者还要追加剂量至100 2500mg，实验中证实服用 4 6周后才可达到治疗效果，因此应坚持服用至少1个月。长期服用后的副反应较小，也 较温和。氨基葡聚糖及硫酸软骨素的软骨保护作用还体现在能够提高滑膜产生透明质酸 的能力，关节腔内正常透明质酸水平可以降低软骨面的退变，减轻骨性关节炎的症状。这类 软骨保护剂运用于体外培养的软骨细胞时，蛋白多糖的合成与聚集均升高，胶原酶的活性 降低，氨基葡聚糖和硫酸软骨素是蛋白多糖合成的基本物质，同时硫酸基团是保持软骨细 胞外基质稳定的重要网络结构。在动物模型中，氨基葡聚糖还具有抗炎的潜能，尽管对炎症 反应中的环氧化酶或蛋白水解酶的活性影响不大，但由于增加了蛋白多糖的合成，发挥了 稳定细胞膜的作用并可填充细胞外基质，间接起到抗炎的作用，这同NSAID s类药物作用机 制不同，但这两类药物合用，可以起到协同作用，降低NSAID s类药物的用量，减轻副反应; 硫酸软骨素也可能具有一定的抗炎特性，在抑制炎性介质的趋向性、吞噬细胞以及溶菌酶 的活性等方面发挥作用，但抗炎能力较消炎痛、布洛芬等药物低。在临床上亦有很多实验证 实氨基葡聚糖和硫酸软骨素的安全性和有效性，Rovati在一项随机双盲实验中，252例膝 关节骨性关节炎的患者，分别服用氨基葡聚糖(每次500mg，每日3次)和对照服用安慰剂 治疗4周时间，55%的患者膝关节疼痛、肿胀、活动受限症状明显减轻，而对照组仅为38%。 eichelt等在一组病人中，肌肉注射硫酸氨基葡聚糖400mg，每周2次，治疗6周时给药组 (55% )与安慰剂组(33% )在缓解症状上差异有显著性意义，Buesi在观察硫酸软骨素治 疗骨性关节炎的研究中发现每次口服800mg，每日2次，连续服用6个月后，43%的患者 症状明显改善，而服用安慰剂组仅有3%改善，并能够显著延长患肢行走时间，症状的减轻 也是持续的(分别在服用后1、3、6个月内达到15%、24%和37% )。联合服用这两种药物 (氨基葡聚糖1500mg/d，硫酸软骨素110mg/d)同样可达到明显的治疗效果。在同NSAID s 类药物的对比研究中发现在服用软骨保护类药物2周后可达到服用布洛芬1周时的止痛及 抗炎效果，在服用布洛芬2周后症状似乎稳定，而继续服用硫酸软骨素后症状仍有进一步 改善的趋势，最终的治疗效果为布洛芬组达到52%，硫酸软骨素组48%，但副反应的发生 率布洛芬组为35%，而硫酸软骨素组仅为6%。因此NSAID s类药物缓解症状较迅速，而软 骨保护类药物虽然在治疗效果上稍低，但起效温和，长期服用后副反应较小。亲水作用液相色谱(HILIC)是分离多种类型极性化合物和亲水性化合物最有效 的色谱技术。简单的讲，HILIC是正相色谱分离的一种，但其使用反相中常使用的流动相。 一般而言，HILIC的洗脱顺序与RPLC相反，保留随着分析物的带电性和亲水性增加而增强。 这保证了 RPLC色谱柱上无保留化合物的直接分离。HILIC是一款具有亲水固定相的色谱柱。可以使用水，缓冲液和高比例与水混溶的 有机相作为流动相。典型的HILIC应用可以使用有机溶剂占50% -95%的缓冲液体系，缓 冲盐应该在有机溶剂中具有很好的溶解性。目前HILIC色谱柱是通过进样分析溶质在流动相和HILIC固定相亲水表面的水层 分区而进行保留。分析物亲水性越强，分区平衡越易转向固定相的水层，因此分析物的保留 也越强。本发明的目的在于提供一种采用HPLC-ELSD对氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关 制剂进行有关物质检测的测定方法。
本发明有关物质检测方法的实现包括以下步骤(1)色谱条件检测器采用蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度范围为 60-140°C，最佳检测温度为100°C ；氮气流速为2. 0-2. 5L/min，色谱条件的流动相由水-乙 腈组成，其最佳比例为(30 70)，并在流动相中加入0. 甲酸和0. 氨水，调节pH范 围1 5，其最佳pH值为1. 8左右；色谱柱温度为室温，流速为1. Oml/min。理论塔板数按 氨基葡萄糖计算不低于2000。(2)供试品溶液的制备取氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的相关制剂适量，加流动 相配制成0. 3mg/ml的溶液，作为供试品溶液(3)对照溶液的制备量取上述(2)供试品溶液适量，加流动相稀释成每Iml中约 含3 μ g的溶液，作为对照溶液。(4)测定方法取对照溶液20 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满 量程的20%，再取供试品溶液20μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图至氨基葡萄糖保留时间 的3倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰 的峰面积(1.0% )0本发明氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关物质检测方法，上述(2)中供试品溶液 的制备为满足供试品溶液检测浓度的需要，取氨基葡萄糖适量，用流动相配制成浓度为每 Iml含0. 3mg的溶液，作为供试品溶液。再分别用流动相稀释成一系列不同浓度的溶液， 分别进样1 μ 1，使之产生主峰为基线噪音三倍的信号。经试验，最小检知量为0.3ng(S/ N彡3)，若以有关物质检查时的浓度0. 3mg/ml计算，其检出限度为0. 1%。本发明氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方法，上述(3)中 对照溶液的制备精密量取上述供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至 刻度，作为对照溶液。当该对照溶液浓度范围在1-5 μ g/ml内时，峰面积与浓度成良好的线 性关系，其线性相关性系数为0. 9999。本发明氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方法，其有关物质 检测高效液相色谱图中，如有杂质峰出现，量取各杂质峰面积的和，应不得大于对照溶液的 主峰面积(1% )o本发明氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方法，适用于各种 需要进行有关物质检测的氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂，如片剂、胶囊剂、颗粒 剂、注射类制剂、控释和缓释制剂以及含氨基葡萄糖的复方制剂。本发明与已有技术相比的最大优点在于1、使用蒸发光散射检测器对本品进行有关物质检测，克服了本品原料没有发色基 团，用紫外检测器难以检测的缺点。传统方法常用衍生化方法，本发明采用蒸发光散射无需 进行复杂的衍生化反应，并有效提高了其检测灵敏度。2、本发明适用于各种需要进行有关物质检测的氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相 关制剂，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射类制剂、控释和缓释制剂以及含氨基葡萄糖的复方制 剂。3、本发明检测方法准确、操作简捷，方便，重现性好，灵敏度高，可以充分满足有关 物质检查与降解产物测定的要求，较好地控制样品中的特殊杂质，保证产品质量，在实际工作中实用性强。
具体实施例方式实施例一1、色谱条件与系统适用性试验1. 1、检测仪器的选择由于本品结构中没有发色基团，因此本品在紫外区没有吸 收。为了更好的检出杂质，更好的控制产品质量，我们选用了蒸发光散射检测器。1. 2、色谱条件的选择仪器SHIMADZULC-10AT VP，HPLC 1A/ELSD (SEDEX 75)(5)ELSD漂移管温度范围为60_140°C，其最佳检测温度为100°C ；氮气流速为 2. 0-2. 5L/min。液相色谱柱用亲水作用液相色谱(ZIC-HILIC，150mmX4. 6mm, 5 μ m)，参照相 关文献并结合试验具体情况，先后选用甲醇_水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-0. 3%三氟乙酸 溶液等多种条件，最终确定流动相由水-乙腈组成，其最佳比例为(30 70)，并在流动相中 加入0. 甲酸和0. 氨水，调节pH范围1 5，其最佳pH值为1.8左右；色谱柱温度为 室温，流速为l.Oml/min。在该色谱条件下，氨基葡萄糖保留时间适中，峰形较好。1.3、灵敏度测定 取氨基葡萄糖适量，用流动相配制成浓度为每Iml含0. 3mg的溶液，作为供试品溶 液。再分别用流动相稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样ι μ 1，使之产生主峰为基线噪 音三倍的信号。经试验，最小检知量为0. 3ng (S/N > 3)，若以有关物质检查时的浓度0. 3mg/ ml计算，其检出限度为0. 1%。结果证明，该方法灵敏度高，可以充分满足有关物质检查测 定的要求。1. 4、溶液稳定性取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8小时分别进样测定，其主峰峰面积及有关 物质测定结果在8小时内基本稳定。以上试验结果表明，此方法简便灵敏，重现性好，可较好地对样品中氨基葡萄糖的 质量进行较好的检测。2供试品溶液的制备取氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的相关制剂适量，加流动相 配制成0. 3mg/ml的溶液，作为供试品溶液3对照溶液的制备量取上述(2)供试品溶液适量，加流动相稀释成每Iml中约含 3yg的溶液，作为对照溶液。4、氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂有关物质的检测取对照溶液20 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满 量程的20%，再取供试品溶液20μ 1注入色谱仪，记录色谱图至氨基葡萄糖主峰保留时间 的3倍，供试品溶液色谱图如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液中主峰 的峰面积。实施例二 复方硫酸氨基葡萄糖注射液中有关物质的测定取本品小针，用流动相稀释成含氨基葡萄糖0.3mg/ml，作为供试品溶液。精密量取 适量，加流动相稀释成每Iml中约含氨基葡萄糖3 μ g的溶液，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下HPLC-ELSD检测器(SHIMADZU LC-10AT VPjHPLC 1A/ELSD(SEDEX 75))，用亲 水作用液相色谱(ZIC-HILIC，150mmX4. 6mm, 5 μ m)为色谱柱，流动相由水-乙腈组成，其最 佳比例为(30 70)，并在流动相中加入0. 甲酸和0. 氨水，调节pH范围1 5，其最 佳PH值为1. 8左右；色谱柱温度为室温，流速为1. Oml/min。理论塔板数按氨基葡萄糖计 算应不低于2000。取对照溶液1 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高 约为满量程的20%，再取供试品溶液1 μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图至氨基葡萄糖保留 时间的3倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液 主峰的峰面积。三批复方硫酸氨基葡萄糖注射液的HPLC-ELSD图见附图
。表1.复方硫酸氨基葡萄糖注射液有关物质测定结果
权利要求
1.一种氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方法其特征在于检测 方法包括以下步骤(1)色谱条件本品原料药结构中没有发色基团，因此选用蒸发光散射检测器。由于氨基葡萄糖极性 大，采用以水(0. 甲酸+0. 氨水)乙腈=30 70为流动相，流速为l.Oml/min。理 论塔板数按氨基葡萄糖计算不低于2000。(2)供试品溶液的制备取氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的相关制剂适量，加流动相配制成0. 3mg/ml的溶液，作 为供试品溶液。(3)对照溶液的制备量取上述(2)供试品溶液适量，加流动相稀释成每Iml中约含3μ g的溶液，作为对照 溶液。(4)测定方法取对照溶液1μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的 20%，再取供试品溶液1 μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图至氨基葡萄糖保留时间的3倍，供 试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的峰面积 (1. 0% )。
2.根据权利要求1所述的氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方 法，其特征在于，其中(1)检测器采用蒸发光散射检测器，漂移管温度范围为60-140°C，最 佳检测温度为100°C ；氮气流速为2. 0-2. 5L/min，色谱条件的流动相由水-乙腈组成，其最 佳比例为(30 70)，并在流动相中加入0. 甲酸和0. 氨水，调节pH范围1 5，其最 佳PH值为1. 8左右；色谱柱温度为室温，流速为1. Oml/min。
3.根据权利要求1所述的氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质检测方 法，其特征在于其中(3)对照溶液的制备由于氨基葡萄糖有关物质的检测限度为1%， 同时为满足供试品溶液检测浓度的需要，取氨基葡萄糖相关制剂适量，加流动相配制成 0. 3mg/ml的溶液，作为供试品溶液。再精密量取供试品1ml，置50ml容量瓶中，加流动相溶 解并稀释至刻度，作为对照溶液。
4.根据权利要求1、2、3所述的氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖相关制剂的有关物质的检 测方法，其特征在于该方法适用于各种需要进行有关物质检测的氨基葡萄糖及含氨基葡 萄糖的相关制剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射类制剂、控释和缓释制剂以及各种氨基葡萄糖 的复方制剂。
全文摘要
本发明公开了一种氨基葡萄糖的有关物质检测方法，具体是采用蒸发光散射检测器，以水(0.1％甲酸+0.1％氨水)∶乙腈＝(1-40)∶(20-70)为流动相。以液相色谱柱用亲水作用液相色谱(ZIC-HILIC，150mm×4.6mm，5μm)为色谱柱。本发明氨基葡萄糖及含氨基葡萄糖的相关制剂的有关物质测定方法，本发明克服了本品在紫外区没有吸收难以进行检测的缺点，可快速准确的检测出氨基葡萄糖的杂质及降解产物。该方法具有分离效果好、灵敏度高、分析速度快、准确度高等优点，不仅提高了氨基葡萄糖原料和制剂中有关物质的检测水平，还加强了氨基葡萄糖原料和制剂的质量控制。
文档编号G01N30/74GK102103133SQ201010521209
公开日2011年6月22日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者任金山, 廖燕燕, 张敏, 张瑾, 徐健峰, 赵晖, 邹爱峰, 魏小荣 申请人:南京威尔曼药物研究所