本发明属于具有抗肿瘤活性药物的合成技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤的第二位。由于肝癌常隐匿起病，症状后病情进展迅速，极易出现肝内播散、远处转移等，治疗后复发率亦相当高，因此总体的疗效欠佳，5年生存率不足30％，对中国人健康造成很大的危害。目前肝癌的治疗仍以外科手术为首选，但是手术后易于复发转移的特点极大地影响了其疗效和预后；而对于不适合接受外科手术的局部进展或远处转移患者，传统的化疗、放疗的疗效不佳，因此寻找新的治疗手段已成为目前肝癌临床研究的当务之急。
分子靶向治疗为肝癌的治疗提供了新的思路和希望。目前全球对这一领域的研究不断深入，针对不同细胞表面分子的新型靶向药物不断涌现，其中作用于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向药物是较为重要的一类。厄洛替尼(Erlotinib)是靶向EGFR中较为有代表性的药物，对于非小细胞肺癌、头颈癌和结直肠癌等已有较为明确的疗效。有文献报道，厄洛替尼单独应用对人肝癌细胞也显示了一定的体内外抑制活性，并且厄洛替尼-锌(Ⅱ)酞菁染料轭合物是一类抑制肝癌细胞活性更好的光敏剂。
三氮唑作为一种重要的含氮杂环化合物，具有作为新型抗肿瘤药物的潜力，已成为药物化学研发的热点和重点。比如，三氮唑类化合物可以作为芳香化酶抑制剂，通过抑制芳香化酶活性，阻止妇女体内雄性激素转化为雌性激素，从而降低雌性激素水平，达到治疗绝经妇女乳腺癌疾病的目的。然而，目前尚没有关于厄洛替尼链接1,2,3-三氮唑类化合物的相关记载，也没有关于该类化合物抗肿瘤活性的相关记载。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种合成工艺简单且方便操作的具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物及其制备方法，该方法合成的厄洛替尼衍生物对肝癌HepG2细胞具有较好的抑制活性。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物，其特征在于结构式为：其中R为苯基、对甲基苯基、间硝基苯基、邻氯苯基或邻羟基苯基。
本发明所述的具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)在乙酸酐溶剂中，3,4-二甲氧基苯甲醇在硝酸作用下于室温经硝化反应得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇；
(2)2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇在溶剂苯中，以五水硫酸铜和氢氧化钾作为催化剂，经高锰酸钾氧化羟甲基得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸；
(3)在甲醇溶剂中，2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸在水合肼和雷尼镍作用下经硝基还原得到2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸；
(4)在乙醇与苯的混合溶剂中，2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸与甲酰胺在催化剂甲酸铵作用下经环合反应得到6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮；
(5)6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮在氯化亚砜作用下得到4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉；
(6)4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉与间氨基苯乙炔在碳酸钾作用下经取代反应得到4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉；
(7)4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉在四氢呋喃溶剂中，在吡啶氢溴酸盐作用下脱去甲基得到4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉；
(8)4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基喹唑啉与2-甲氧基乙基溴在碳酸钾作用下反应得到4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉；
(9)4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉与叠氮类化合物发生click反应得到目标产物厄洛替尼衍生物，其中叠氮类化合物为叠氮苯、对甲基叠氮苯、间硝基叠氮苯、邻氯叠氮苯或邻羟基叠氮苯。
进一步优选，步骤(1)的具体过程为：将3,4-二甲氧基苯甲醇加入到溶剂乙酸酐中，降温至0℃滴加硝酸，搅拌反应液，滴加完后升温至室温，反应完全后减压蒸除乙酸酐，再加入饱和碳酸钠溶液调节反应液的pH为中性，用二氯甲烷萃取反应液，蒸除溶剂后得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇；步骤(2)的具体过程为：将2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇加入到溶剂苯中，再加入高锰酸钾、五水硫酸铜和氢氧化钾，加热至回流反应，TLC监控原料反应完全后将反应液倒入冰水中，用冰乙酸调节反应液的pH为9，用氯仿萃取反应液，蒸除溶剂后得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸，其中2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇、高锰酸钾、五水硫酸铜与氢氧化钾的质量比为20:15:1.5:5。
进一步优选，步骤(3)的具体过程为：将2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸加入到溶剂甲醇中，再加入水合肼和雷尼镍，氮气保护反应体系，升温至50℃反应，TLC监控原料反应完全，过滤反应液，蒸除溶剂甲醇得到2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸，其中2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸、水合肼与雷尼镍的质量比为16:105:0.4；步骤(4)的具体过程为：将2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸和甲酰胺加入到乙醇和苯的混合溶剂中，再加入催化剂甲酸铵，在氮气保护下加热至回流反应，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂后，水洗，萃取，蒸除溶剂得到6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮，其中乙醇和苯的混合溶剂中乙醇与苯的体积比为1:3。
进一步优选，步骤(5)的具体过程为：将6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮加入到氯化亚砜中，氮气保护反应体系，加热至回流反应，反应完全后蒸除氯化亚砜得到4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉。
进一步优选，步骤(6)的具体过程为：将4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉和间氨基苯乙炔加入到溶剂丙酮中，再加入碳酸钾，加热至回流反应，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂丙酮后水洗，萃取，蒸除有机相后得到4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉，其中4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉、间氨基苯乙炔与碳酸钾的质量比为22:12:30。
进一步优选，步骤(7)的具体过程为：将4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉和吡啶氢溴酸盐加入到溶剂四氢呋喃中，在室温下反应，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂后再加入丙酮，降温至0℃搅拌析出固体，抽滤固体烘干后得到4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉，其中4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉与吡啶氢溴酸盐的质量比为30:32。
进一步优选，步骤(8)的具体过程为：将4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉和2-甲氧基乙基溴加入到溶剂丙酮中，再加入碳酸钾，加热至回流反应，TLC监控原料反应完全后，蒸除溶剂丙酮，再加入甲醇和水，降温至0℃搅拌析出固体，抽滤烘干得到4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉，其中4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉、2-甲氧基乙基溴与碳酸钾的质量比为28:40:20。
进一步优选，步骤(9)的具体过程为：将4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉与对甲基叠氮苯加入到溶剂叔丁醇中，再加入氯化亚铜，室温反应10h，TLC监控原料反应完全后，经过水洗，萃取，浓缩后再经柱层析色谱分离提纯得到目标产物厄洛替尼衍生物，其中4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉、对甲基叠氮苯与氯化亚铜的质量比为4:2:0.5。
本发明所述的具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明所述的厄洛替尼衍生物的合成路线为：
本发明通过对厄洛替尼分子进行了改造，在其结构上连接一系列不同的1,2,3-三氮唑基团，并对合成的厄洛替尼衍生物进行了抗肿瘤活性测试，发现该类化合物对肝癌HepG2细胞具有较好的抑制活性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
在500mL多口瓶中，加入3,4-二甲氧基苯甲醇16.8g(0.1mol)，再加入乙酸酐150g，降温至0℃左右缓慢滴加硝酸6g，缓慢搅拌反应液，滴加完后升温至室温，反应6h后减压蒸除乙酸酐，再加入蒸馏水300mL，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液，调节反应液的pH为中性，用二氯甲烷200mL萃取反应液三次，合并有机相，蒸除溶剂后得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇20g。
实施例2
在500mL带有搅拌器的反应瓶中，将2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲醇20g(0.093mol)加入到苯150mL中，再加入高锰酸钾15g，搅拌均匀后，再加入五水硫酸铜1.5g和氢氧化钾5g，加热至回流反应，反应10h后，TLC监控原料反应完全，将反应液倒入冰水500mL中，搅拌1h后，用冰乙酸调节反应液的pH为9，用氯仿200mL萃取反应液三次，合并有机相，蒸除溶剂后得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸13g。
实施例3
在500mL带有搅拌器的反应瓶中，将2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸16g加入到溶剂甲醇150mL中，再加入水合肼105g和雷尼镍0.4g，氮气保护反应体系，升温至50℃反应，反应5h后，TLC监控原料反应完全，过滤反应液，蒸除溶剂甲醇得到2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸11g。
实施例4
在500mL带有搅拌器的反应瓶中，将2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸20g和甲酰胺9g加入到乙醇和苯的混合溶剂200mL中(乙醇与苯的体积比为1:3)，再加入甲酸铵10g，在氮气保护下，加热至回流反应，反应10h后，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂后，加入饱和食盐水150mL，再用氯仿100mL萃取反应液3次，合并有机相，蒸除溶剂得到6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮17g。
实施例5
在250mL三口瓶中，加入6,7-二甲氧基喹唑啉-4-酮20g，再加入氯化亚砜100mL，氮气保护反应体系，加热至回流反应，反应3h后，蒸除氯化亚砜得到4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉13g。
实施例6
在反应瓶中加入丙酮200mL、4-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉22g和间氨基苯乙炔12g，搅拌混合均匀后再加入碳酸钾30g，加热至回流反应，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂丙酮后加入水100mL，再用乙酸乙酯200mL萃取两次，合并有机相，蒸除有机相后得到4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉20g。
实施例7
在反应瓶中加入四氢呋喃200mL、4-氨基苯乙炔-6,7-二甲氧基喹唑啉30g和吡啶氢溴酸盐32g，在室温下反应6h，TLC监控原料反应完全，蒸除溶剂后再加入丙酮70mL，降温至0℃搅拌析出固体，抽滤固体烘干后得到4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉26g。
实施例8
在500mL带有搅拌器的反应瓶中，将4-氨基苯乙炔-6,7-二羟基基喹唑啉28g和2-甲氧基乙基溴40g加入到丙酮200mL中，再加入碳酸钾20g，加热至回流反应，TLC监控原料反应完全后，蒸除溶剂丙酮，再加入甲醇85mL和水15mL，降温至0℃搅拌析出固体，抽滤烘干得到4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉27g。
实施例9
在100mL带有搅拌器的反应瓶中，将4-氨基苯乙炔-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉4g与对甲基叠氮苯2g加入到叔丁醇30mL中，再加入氯化亚铜0.5g，室温反应10h，TLC监控原料反应完全后，经过水洗，萃取，浓缩后再经柱层析色谱分离提纯得到化合物4-氨基苯乙基-1,2,3-三氮唑-对甲基苯-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉2.5g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.68(s,1H),9.27(s,1H),8.49(s,1H),8.37(s,1H),7.94(s,1H),7.86(d,J＝4Hz,2H),7.67(d,J＝4Hz,1H),7.51(s,1H),7.43(s,2H),4.34(s,4H),3.80(s,4H),3.39(s,8H),3.40(s,3H),
实施例10
抗肿瘤活性测试
收集生长期肝癌HepG2，以MTS法测定以下化合物的抗癌活性，将细胞以适当浓度(每毫升4×104个细胞)加到96孔细胞培养板中(含10wt％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液)，培养24h后，在37℃、体积浓度为5％的CO2条件下与不同浓度的化合物作用72h，然后将MTS(最终质量浓度2mg/mL)和DMS(最终摩尔浓度30μM)的混合物直接加入含细胞的培养基中，继续置培养箱孵育4h。作用4h后，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡，细胞存活率通过其对MTS作用的代谢物在酶联免疫监测仪490nm波长下的吸收率测定。
生物活性测试表明，该类厄洛替尼衍生物在肝癌HepG2中对癌细胞有一定的抑制作用。综上所述，本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的厄洛替尼衍生物及其制备方法，并且首次发现了该类化合物对肝癌HepG2细胞具有较好的抑制活性，故具有重大的研发潜力。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。