1.一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体,其特征在于,脂肪氧合酶突变体具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列。
2.一种构建权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体中PCR反应的简并引物,其特征在于,该简并引物具体如下:
N130-f:TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG;
N130-r:TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG;
S437-f:GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC;
S437-r:TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG;
G260-f:GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA;
G260-r:AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。
3.一种权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点确定:将鱼腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸作为饱和突变位点;
(2)鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选:以重组质粒为模板,在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子设计简并引物,该简并引物如权利要求2所述,进行全质粒PCR反应,构建3个定点饱和突变库,DpnI消化模板,纯化后产物直接转化大肠杆菌,将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄抗性LB平板上,37℃下培养16-24小时,得到3个饱和突变库;
(3)取3个饱和突变库的菌落接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中,于37℃过夜培养,得到3个突变体库的母版,取母版接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中,37℃下培养3h,再加入IPTG低温诱导16h;然后裂解菌体,得到粗酶液,将粗酶液在50℃条件下孵育5min,冷却,测定残余活力,得到阳性突变体;
(4)将步骤(3)得到的阳性突变体接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃,180 rpm 培养至OD600为0.6-0.8 时,加IPTG低温诱导,离心收集菌体,用磷酸盐缓冲液重悬菌体,超声波破碎菌体,将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化,透析去除咪唑即得到纯的脂肪氧合酶突变体。
4.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法,其特征在于,步骤(2)中大肠杆菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。
5.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法,其特征在于,步骤(2)中重组质粒为重组质粒pET32a-Ana-LOX。
6.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法,其特征在于,步骤(2)中全质粒PCR反应的反应条件为:96℃ 5 min;然后98℃ 10s,55℃ 5s,72℃ 90s,共25个循环;最后72℃ 5 min。
7.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法,其特征在于,步骤(3)中裂解菌体采用冻融破碎的方法进行,具体为-70℃冷冻2小时,室温融化1小时,反复冻融。
8.权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体在食品、制药、造纸或污水处理中的应用。