一种多肽S1及其在制备治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽s1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

背景技术：

随着老龄人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改变，肥胖、脂肪肝病、代谢综合征和糖尿病等代谢异常人群剧增，现已经成为全球性的公众健康的重要危害。

糖尿病是一组以血葡萄糖水平增高为特征的慢性代谢性疾病，世界卫生组织依据糖尿病病因及发病机制将其分为ⅰ型糖尿病、ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病，其中ⅱ型糖尿病约占糖尿病总数的90％。其最显著的特征为高血糖，主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起，目前被认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果^[1]。其所导致的多种慢性并发症如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病相关的心脑血管疾病以及“糖尿病足”已得到人们的充分认识^[2]，也是其致死致残的主要原因。当前儿童、青少年以及青年人群中ⅱ型糖尿病前期发病率剧增，糖尿病的发病人群不断扩大，防治难度大大增加。

脂肪肝包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，两者都是全球常见的慢性肝病。非酒精性脂肪肝是指除酒精和其他明确的损伤肝因素造成的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病例综合征，常与其他代谢性综合征并存或者相互影响，如腹型肥胖、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、ⅱ型糖尿病以及致动脉粥样硬化的脂质代谢紊乱等，是非酒精性脂肪肝炎、肝硬化以及肝癌三部曲的主要诱发因素^[3]。

研究表明，非酒精性脂肪肝是ⅱ型糖尿病的独立风险因素之一，在有些患者中肝脏脂肪沉积可能是影响其ⅱ型糖尿病发展的主要因素^[4]，防治非酒精性脂肪肝可以减少ⅱ型糖尿病的发生发展。另一方面，如果ⅱ型糖尿病控制不佳或充分发展，不仅促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维变性、肝硬化及肝细胞癌^[5]。现阶段，ⅱ型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的患病率正逐年增加，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高达80％^[6]。因此，研究ⅱ型糖尿病与非酒精性脂肪肝之间的关系以开发能有效防治ⅱ型糖尿病合并非酒精性脂肪肝疾病的药物尤为重要。

腺相关病毒(aavs)属于微小病毒科依赖病毒属，需要辅助病毒如腺病毒、疱症病毒等参与其有效感染^[7]，由于其非致病性以及有效的递送外源dna至靶细胞的能力成为了一种理想的基因治疗病毒载体^[8]，可分为11种不同的血清型(aav1-11)。aav8为一种从猕猴组织中分离出来的，与其他血清型具有高度同源性的腺相关病毒。重要的是，与其他腺相关病毒相比，其具有更高的肝脏细胞转导效率。在小鼠模型中aav8的肝脏细胞转导效率约为aav2的50倍^[9]。这一性质使研究者们广泛应用于肝脏靶向的基因治疗中，并且在犬类模型中取得了较大成功^[10]。

参考文献

[1]faragym,gaballamr.diabesity:anoverviewofarisingepidemic[j].nephroldialtransplant,2011,26(1):28-35.

[2]gaviniiijr,albertik,davidsonmb,etal.reportoftheexpertcommitteeonthediagnosisandclassificationofdiabetesmellitus[j].diabetescare,1997,20(7):1183.

[3]perryrj,samuelvt,petersenkf,etal.theroleofhepaticlipidsinhepaticinsμlinresistanceandtype2diabetes[j].nature,2014,510(7503):84-91.

[4]loriap,lonardoa,ananiaf.liveranddiabetes.aviciouscircle.hepatolres.2013；43:51-64

[5]cusik.treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:currentapproachesandfuturedirections.diabetologia.2016；59:1112-1120

[6]fanjg,farrellgc.epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.jhepatol.2009；50:204-210

[7]muzyczkan,bernski.parvoviridae:thevirusesandtheirreplication[j].fieldsvirology,2001,2:2327-2359.

[8]namhj,lanemd,padrone,etal.structureofadeno-associatedvirusserotype8,agenetherapyvector[j].journalofvirology,2007,81(22):12260-12271.

[9]gaogp,alviramr,wangl,etal.noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapy[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,2002,99(18):11854-11859.

[10]wangl,calcedor,nicholstc,etal.sustainedcorrectionofdiseaseinnaiveandaav2-pretreatedhemophiliabdogs:aav2/8-mediated,liver-directedgenetherapy[j].blood,2005,105(8):3079-3086.

技术实现要素：

为解决现有技术中缺乏能有效防治ⅱ型糖尿病合并非酒精性脂肪肝疾病的药物的不足，本发明的目的在于提供一种多肽s1。

本发明的另一目的是提供一种能表达多肽s1的重组腺病毒。

在本发明的第一方面，提供了一种seqno.1所示的多肽，或其药学上可接受的盐。

在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，它编码多肽s1，其核苷酸序列如seqno.2所示。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(a)上述多肽s1或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明多肽s1或其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物。

在另一优选例中，所述的保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物是将多肽s1制备成注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂或其他的非注射途径进行使用。

在本发明的第五方面，提供了一种本发明多肽s1或其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病疾病的药物。

在另一优选例中，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病疾病的药物是将多肽s1制备成注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂或其他的非注射途径进行使用。

在本发明的第六方面，提供了一种表达多肽s1的重组腺相关病毒，是通过以下制备方法得到的：

1)构建paav-mcs-t2a-egfp载体：用引物px458-hindiii-f和px458-bglii-r从质粒px458(addgene，48138)中扩增t2a-egfp片段，两个引物的核苷酸序列如seqno.3、4所示，连接至使用hindiii(neb，r0104l)和bglii(neb，r0144l)双酶切的aav载体paav-mcs中，构建paav-t2a-egfp载体；再合成mcs-oligo1-saci，其核苷酸序列如seqno.5，和mcs-oligo2-kpni，其核苷酸序列如seqno.6，通过变性，融合之后连入经saci(neb，r0156l)和kpni(neb，r0142l)酶切的上述paav-t2a-egfp载体中；

2)构建paav-s1-t2a-egfp载体：利用上游引物，其核苷酸序列如seqno.7，下游引物，其核苷酸序列如seqno.8，从cflip(ncbi：nm_003879.5)基因cdna中pcr扩增得到s1肽段的编码序列；将s1肽段的编码序列用xbai(neb，r0145l)和bamhi(neb，r0136l)双酶切，然后克隆到经同样酶切的paav-mcs-t2a-egfp载体中，得到paav-s1-t2a-egfp载体，此载体中s1片段与egfp在同一读码框内；

3)三质粒共转染至aav293细胞中：将paav-s1-t2a-egfp、paav-helper和paav-2/8用pei(polysciencescat#24765)共转染至aav293细胞中，转染72h后收集细胞，超声裂解后去除细胞碎片；aav8-gfp对照组三质粒转染系统为：paav-mcs-t2a-egfp，paav-helper和paav-2/8；

4)纯化病毒液：用1xpbs+5％sorbitol-inslide-a-lyzerdialysiscassettes透析纯化的病毒液，去除氯化铯，获得腺相关病毒aav8-s1和aav8-gfp。

上述s1重组腺相关病毒中s1片段与egfp在同一读码框内，在表达s1肽段的同时表达egfp，便于切片观察。

在本发明的第七方面，提供了一种s1重组腺相关病毒在制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的应用。

在本发明的第八方面，提供了一种s1重组腺相关病毒在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病疾病的药物中应用。

在本发明的第九方面，提供了一种包含表达多肽s1的重组腺相关病毒的基因药物。

在另一优选例中，提供了一种以所述的基因药物为有效成分与药学上可接受的载体组成的药物组合物。

在本发明的第十方面，提供了将上述组合物用于制备保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物。

在本发明的第十一方面，提供了将上述组合物用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病疾病的药物。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

1、多肽s1的过表达显著抑制小鼠脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生

本发明利用腺相关病毒aav8这种肝脏靶向的基因治疗载体，介导多肽s1在ob/ob小鼠肝脏组织中过表达，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，dio)研究多肽s1的功能，结果发现与aav8-gfp对照组小鼠相比，aav8-s1组小鼠体重与空腹血糖水平无显著差异，但其空腹血清胰岛素水平显著降低，进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现aav8-s1组小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强。通过肝脏重量以及肝脏组织病理染色等结果说明，aav8-s1组小鼠脂肪肝病变明显减轻，脂质蓄积显著减少。这表明在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，多肽s1能够抑制脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生。

2、多肽s1的过表达显著抑制食蟹猕猴脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生

本发明利用腺相关病毒aav8这种肝脏靶向的基因治疗载体，介导多肽s1在食蟹猕猴肝脏组织中过表达，通过高脂饮食诱导的肥胖模型(dietinducedobesity，dio)研究多肽s1的功能，结果发现与aav8-gfp对照组食蟹猕猴相比，aav8-s1组猕猴体重、bmi指标以及空腹血糖水平无显著差异，但其空腹血清胰岛素水平显著降低。通过血脂含量测定以及反应肝功能的酶(alt、ast)活性测定结果表明aav8-s1组猕猴血清中甘油三脂和低密度胆固醇含量显著降低，高密度胆固醇含量增加，alt酶活性显著降低；肝脏组织病理染色结果表明aav8-s1组猕猴肝脏组织中脂质蓄积明显减少，肝脏脂肪变性显著减轻。这表明在猕猴中，多肽s1同样能够抑制脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生。

本发明人的研究证明了：在高脂诱导的脂肪肝及ⅱ型糖尿病模型中，多肽s1具有抑制胰岛素抵抗，增强葡萄糖耐受，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，改善脂肪肝及ⅱ型糖尿病的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种新型的多肽s1。

(2)本发明发现了多肽s1的新功能，即s1具有抑制脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病的作用。

(3)本发明利用多肽s1的重组腺相关病毒实现体内持续高表达多肽s1，发挥抑制脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病的作用。

(4)基于多肽s1在抑制脂肪肝及ⅱ型糖尿病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是腺相关病毒aav8介导的小鼠肝脏多肽s1过表达效率检测结果图

a为生理盐水对照组、aav8-gfp对照组和aav8-s1组小鼠肝脏组织中病毒转染效率结果；b为aav8-gfp对照组和aav8-s1组在尾静脉注射病毒载体后小鼠肝脏组织s1多肽表达情况检测结果；

图2是aav8-gfp和aav8-s1组小鼠体重、空腹血糖以及空腹血清胰岛素水平结果图

a为体重结果图，b为血糖水平结果图，c为血清胰岛素水平结果图

*：p＜0.05vsaav8-gfp组；

图3是aav8-gfp和aav8-s1组小鼠腹腔注射葡萄糖耐受结果图

*：p＜0.05vsaav8-gfp组；

图4是aav8-gfp和aav8-s1组小鼠肝脏重量统计结果图

*：p＜0.05vsaav8-gfp组；

图5是aav8-gfp和aav8-s1组小鼠肝脏组织he和油红o染色结果图；

图6是腺相关病毒aav8介导的食蟹猕猴肝脏中多肽s1过表达效率检测结果

a为生理盐水对照组、aav8-gfp对照组和aav8-s1组食蟹猕猴肝脏组织中病毒转染效率结果；b为aav8-gfp对照组和aav8-s1组在门静脉注射病毒载体后猕猴肝脏组织s1多肽表达情况检测结果；

图7是aav8-gfp和aav8-s1组食蟹猕猴体重以及bmi指标结果图

a为体重结果图，b为bmi指标结果图

图8是aav8-gfp和aav8-s1组食蟹猕猴空腹血糖、空腹血清胰岛素水平结果图

a为空腹血糖水平结果图，b为空腹血清胰岛素水平结果图(*：p＜0.05vsaav8-gfp组)

图9是aav8-gfp和aav8-s1组食蟹猕猴血脂含量以及肝功能测定结果图

a为血清甘油三酯含量测定结果图，b为血清总胆固醇含量测定结果图，c为血清高密度胆固醇含量测定结果图，d为血清低密度胆固醇含量测定结果图，e为谷丙转氨酶(alt)含量测定结果图，f为谷草转氨酶(ast)含量测定结果图(*：p＜0.05vsaav8-gfp组)；

图10是aav8-gfp和aav8-s1组食蟹猕猴肝脏组织he和油红o染色结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验动物及饲养

实验动物：ob/ob小鼠，雄性，8周，购买于南京大学模式动物研究中心；食蟹猕猴(macacafascicμlaris)购买于春盛生物科技发展有限公司。为进行研究，我们按照标准，通过监测猕猴的胸围、腰围、体重、血压、空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、空腹血清甘油三酯水平、空腹血清高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、以及总胆固醇等指标，筛选出20只年龄为8-9岁，体重8-9kg的具有患代谢综合症倾向的猕猴进行后续实验。

实验动物饲料配方：小鼠高脂饲料(hfd)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号d12942)：热量百分比：蛋白质:18.1％；碳水化合物:20.3％；脂肪:61.6％。食蟹猕猴高脂饲料(hfd)(购自北京华阜康生物科技有限公司，#5043)：热量百分比：蛋白质:17.86％；碳水化合物:58.8％；脂肪:22.34％。

饲养环境及条件：武汉大学动物实验中心/absl-ⅲ实验室，室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】多肽s1过表达腺相关病毒载体系统(aav8-s1/aav8-gfp)的构建：

aav8为一种肝脏靶向的基因治疗载体，本发明中使用aav8介导s1多肽在小鼠或食蟹猴肝脏中的过表达，以研究s1多肽过表达对非酒精性脂肪肝及ⅱ型糖尿病的影响。

(1)用引物px458-hindiii-f(cccaagcttggtaccactagtgtcgacgaattcggcagtggagaggg)和px458-bglii-r(ggaagatctttacttgtacagctcgtccatgcc)从质粒px458(addgene，48138)中扩增t2a-egfp片段，连接至使用hindiii(neb，r0104l)和bglii(neb，r0144l)双酶切的aav载体paav-mcs中，构建paav-t2a-egfp载体。为了便于以后使用，再合成mcs-oligo1-saci(ctctagactcgagaccggtcttaaggctagcgatatcggatccaagcttggtac)和mcs-oligo2-kpni(caagcttggatccgatatcgctagccttaagaccggtctcgagtctagagagct)，通过变性，融合之后连入经saci(neb，r0156l)和kpni(neb，r0142l)酶切的上述paav-t2a-egfp载体中，构建paav-mcs-t2a-egfp载体。

(2)利用上游引物：5’-gctctagagccaccatgctccataatgggagaag-3’，下游引物：5’-cgggatcccttgtcatcgtcgtccttgtaatcaatgcaatcg

attatc-3’，从cflip(ncbi：nm_003879.5)基因cdna中pcr扩增得到s1肽段的编码序列；将s1肽段的编码序列用xbai(neb，r0145l)和bamhi(neb，r0136l)双酶切，然后克隆到经同样酶切的paav-mcs-t2a-egfp载体中，得到paav-s1-t2a-egfp载体，此载体中s1片段与egfp在同一读码框内，在表达s1肽段的同时表达egfp，便于切片观察。

(3)将三质粒转染系统(paav-s1-t2a-egfp，paav-helper和paav-2/8)用pei(polysciencescat#24765)共转染至aav293细胞中，转染72h后收集细胞，超声裂解后去除细胞碎片(aav8-gfp对照组三质粒转染系统为：paav-mcs-t2a-egfp，paav-helper和paav-2/8)。

(4)用氯化铯梯度离心的方法纯化病毒液，用1xpbs+5％sorbitol-inslide-a-lyzerdialysiscassettes透析纯化的病毒液，去除氯化铯，获得腺相关病毒aav8-s1和aav8-gfp。

(5)荧光定量pcr检测病毒滴度，具体步骤如下：

a.取10μl纯化后的病毒液，加入100μldnase裂解液(10mmtris·cl,ph7.5、10mmmgcl2、2mmcacl2、50u/mldnasei)，37℃孵育1小时。

b.加入0.5m的edta，混合均匀后70℃孵育10分钟，加入终浓度为50μg/ml的蛋白酶k，50摄氏度过夜孵育。

c.在99℃下孵育10分钟，彻底灭活蛋白酶k。加入灭菌双蒸水至1ml，取出2μl补水至400μl用作荧光定量pcr的模板。

d.按照9.1×10¹¹个1000bp的双链dna分子计算，将paav-s1-t2a-egfp/paav-mcs-t2a-egfp质粒稀释至5×10¹至5×10⁸八个浓度梯度，制成标准品。

e.分别取2μl样品和标准品，用gfp特异性的引物forward5’-agcagcacgacttcttcaagtcc；和reverse5’-tgtagttgtactccagcttgtgc做荧光定量pcr。根据标准品指定标准曲线，计算出病毒中的载体拷贝数(病毒滴度)。

【实施例2】腺相关病毒(aav8-s1)介导的肝脏s1多肽过表达小鼠模型的构建

ob/ob小鼠随机分为3组：s1过表达(aav8-s1)组、腺相关病毒对照(aav8-gfp)组以及阴性对照组。分组完成后给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点，夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准。麻醉完成后s1过表达组小鼠通过尾静脉注射0.2ml含1×10¹²个aav8-s1病毒载体的生理盐水，腺相关病毒对照组注射同等量的aav8-gfp载体，阴性对照组注射同等量的生理盐水，注射完成后小鼠自由摄食。高脂喂养24周后终末取材时检测。

【实施例3】腺相关病毒(aav8-s1)介导的肝脏s1多肽过表达食蟹猕猴模型的构建

腺相关病毒载体通过门静脉注射至食蟹猕猴体内，在肝脏中过表达多肽s1。

食蟹猕猴高脂饲料(购自北京华阜康生物科技有限公司，#5043，热量百分比：蛋白质:17.86％；碳水化合物:58.8％；脂肪:22.34％)喂养2天后，随机分为三组(每组6-8只，分别注射aav8-s1、aav8-gfp、生理盐水)。门静脉注射需要开腹手术，术前禁食10-14小时，禁水6小时。术前先肌肉注射阿托品0.05mg/kg(减少术中腺体的分泌)，约10分钟后肌肉注射舒眠宁ⅱ0.1ml/kg。待实验猴麻醉后称量体重，备皮，将猕猴以仰卧位固定于手术台上，连接心电监护仪，监测血氧饱和度、血压、心率，用碘酒消毒手术区域3遍。手术及助手洗手消毒穿手术衣，给实验猴消毒铺巾，准备手术。沿腹中线分层划开皮肤，打开腹腔，找到门静脉后缓慢将含有aav8-s1病毒载体(滴度5.88e+08tu/ml，血清型aav2/8)1ml的缓冲液注射入门静脉内，注射完成后用无菌小纱布块按压止血，检查无出血情况后准备缝合。同时静脉匀速滴注青霉素400万单位，预防感染。分层关闭腹腔，穿好腹带防止手术后切口张力过大和减少腹腔内出血(aav8-gfp、生理盐水组分别注射同等体积的含同等量aav8-gfp病毒以及同等体积的生理盐水，其方法与aav8-s1组相同)。高脂饲养30周后，穿刺活检术取出组织通过免疫荧光以及westernblot检测腺相关病毒介导的多肽s1的过表达。

【实施例4】小鼠以及食蟹猕猴脂肪肝(dietinducedobesity，dio)模型的获得

小鼠通过高脂饲料d12942饲养24周获得dio模型，食蟹猕猴通过高脂饲料#5043饲养30周，并每天供应150g时令水果。所有动物均自由饮水。

【实施例5】小鼠肝脏过表达s1多肽抑制高脂饲养引起的脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生

通过尾静脉注射aav8-s1的s1过表达组以及注射aav8-gfp的对照组经高脂饲料饲养24周后，测定其空腹体重、血糖、血清胰岛素水平，并通过腹腔注射葡萄糖测定其糖耐量。完成后采血分离血清，于-20℃存储，之后处死小鼠，取肝脏组织称重，一部分肝脏组织用于分子生物学检测肝脏组织中s1多肽的表达，一部分进行病理染色。

1、小鼠体重、空腹血糖、空腹血清胰岛素测定

(1)体重检测

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食水，下午2:00开始实验操作。

②称重：将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。

(2)空腹血糖水平检测

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，onetouch)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

(3)空腹血清胰岛素检测

①试剂及耗材准备：

样品(冰冻血清)，去离子水一瓶(1000ml)，小鼠胰岛素elisa试剂盒(millipore，货号ezrmi-13k)含胰岛素elisa酶标板(1块，储存于2-8℃)、酶标板封口膜(1片)、10×hrp洗脱缓冲液(2瓶，每瓶50ml,使用前使用去离子水稀释10倍)、胰岛素标准品(浓度为：0.2，0.5，1，2，5，10ng/ml，每种量为0.25ml)、胰岛素质量对照buffer(0.25ml)、基质溶液(0.5ml)、分析缓冲液(20ml)、胰岛素检测抗体(10ml)、酶溶液(12ml)、底物(12ml)、终止溶液(12ml)。

②实验步骤：

a.确认温箱开启，熟悉酶标仪操作，将待检测的血清标本从-20℃冰箱中找出；

b.将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；

c.稀释10×hrp洗脱缓冲液，每瓶用450ml去离子水稀释；

d.将取下来的酶标板条安装到一个空的酶标板架上300μltbs洗脱缓冲液洗涤3次。洗涤完毕将酶标板倒扣在吸水纸上，轻轻拍几次，将残液吸净(注意：在进行下一步之前避免酶标板干燥，将未使用的酶标板条密封在装酶标板的袋子里，2-8℃保存)；

e.将10μl分析缓冲液加入非特异性孔(nsb)和所有的样品孔；

f.在nsb孔，标准孔和对照孔加入10μl基质溶液；

g.在预设的标准孔里加入10μl胰岛素标准品；

h.在预设的质量对照孔里加入胰岛素质量对照buffer1和2各10μl；

i.在每个样品孔里加入10μl样品；

j.每孔中加入80μl胰岛素检测抗体(以上所有加样步骤在1个小时之内完成，室温孵育2小时，在此期间将酶标板至于酶标板振荡器上，调整转速为400-500rpm震荡)；

k.取下封口膜，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍打，吸净残液；

l.使用洗脱缓冲液洗板3次，每次300μl，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液；

m.每孔加入酶溶液100μl，封口膜封口后，室温下酶标板振荡器震荡30分钟，取下封口膜，弃去溶液，拍打吸干；

n.使用洗脱缓冲液洗板6次，每次300μl，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液加入100μl底物溶液，酶标板震荡器上震荡15分钟左右。此时可以看到标准孔出现深浅渐变的蓝色。(注意：在这一步，蓝色的出现和进展可能明显快于15分钟，也可能明显慢于15分钟，取决于室温温度。请通过视觉来判断孵育的时间。或者使用酶标仪370nm波长检测，读数在1.2到1.8之间，则为合适的孵育时间)

o.加入100μl终止溶液，震荡酶标板确保充分的混匀，此时蓝色变为黄色。5分钟内在450nm和590nm处分别读取吸光值。根据测定的标准曲线，通过吸光值换算出浓度。

2、葡萄糖耐量实验(intraperitonealglucosetolerancetest，ipgtt)

实验第24周，进行腹腔注射葡萄糖实验(ipgtt)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μl/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

3、肝多肽s1表达及肝脏组织脂质含量测定

(1)终末肝脏组织取材

1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。称重完成后的肝脏组织一部分用于制备冰冻及石蜡切片，另一部分置于-80℃冰箱中保存以备测定肝脏s1多肽含量。

4)冰冻标本：切取部分肝脏，置于有oct的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。

石蜡标本：切取部分肝脏置于10％中性福尔马林中固定。

(2)肝脏组织冰冻切片

使用冰冻切片机切片(切片厚度5μm)，用载玻片接近组织片，将其粘贴于载玻片上。冰冻切片置于荧光显微镜下观察绿色荧光。

(3)westernblot检测多肽s1表达

1)蛋白质提取

①于-80℃取出肝脏组织样本，放入干冰中。每个ep管放入3-4颗钢珠，放入干冰中预冷。用眼科剪剪下所需样本放入对应的ep管，称重并记录每个样本的重量。

②裂解液中加入pmsf，混匀，加入相应量的裂解液到样品中，迅速摇匀。

③于-80℃预冷研磨仪适配器中研磨样品，研磨参数设置为30hz/秒，90秒。

④研磨结束后，冰上放置10分钟，取出钢珠。

⑤超声裂解仪裂解样本5khz/次，每次1秒，间隔1秒，重复10次。超声完成后冰上放置10分钟。

⑥样本放入4℃预冷的离心机中离心，4℃，12000转/分钟离心30min。

⑦吸取上清转移到新的ep管中，4℃，14000转/分钟离心10min。

⑧吸取上清转移到新的ep管中继续离心，4℃，14000转/分钟离心5min。准确吸取清液并利用bcaproteinassaykit(pierec^tm，23225)进行蛋白定量。

2)配置sds-page凝胶并进行上样与电泳

①将配制好的凝胶板架在电泳槽中，加入电泳内液和电泳外液。每个电泳槽需200ml电泳内液。电泳外液需要灌满电泳槽体积的2/3。

②把蛋白样品上样到sds-page胶加样孔内，点样完成后开始电泳。

3)转膜

①按要求配制转膜液于4℃预冷。

②按8cm×5.9cm裁剪好pvdf膜并在一角剪个缺口作为膜的左上角，使用前在甲醇中浸泡15秒后放入转膜液中备用。

③将夹板左右摊开，负极向右。黑色的一边为负极，白色为正极，两边各铺上2张海绵和5张滤纸(海绵和滤纸预先用转移缓冲液浸湿)。

④取出凝胶板中的凝胶，去除多余部分，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，赶走气泡，将pvdf膜覆盖其上，剪缺口的地方应与大marker的一角对齐，赶走气泡后覆盖上左边的滤纸及海绵(不能有气泡)，夹上夹板。

⑤将夹板放入转膜槽中，转膜槽的负极(黑色面)应与夹板的负极(黑色面)放在一起，灌满转膜液以淹没凝胶。

⑥转膜槽接通电源，电压设为250v，电流设为0.2a。开始电泳转移，起始电压应大于100v，如果低于100v，可适当调高电流至所需电压，转移1.5小时。

⑦转移结束后，取出pvdf膜。

4)封闭

把蛋白膜放置到预先准备好的tbs中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4小时。

5)一抗(anti-flag(sigma，#f3165))孵育

①用tbst洗涤蛋白膜3次，每次5分钟。

②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗，封口，尽可能不留空气。

③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。

6)二抗(biotinaffinipuregoatanti-mouseigg(h+l)(abbkine，a21210))孵育

①将薄膜取出用tbst洗涤3次，每次5分钟，回收一抗。

②将膜放入对应的加有二抗的二抗稀释液中，避光孵育1小时。

7)蛋白检测

孵育后用tbst洗涤3次，每次5min。利用bio-radchemidocxrs+凝胶成像系统检测目的条带。

(4)肝脏组织处理及病理染色相关实验

1)肝脏脱水，透明，浸蜡

切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)：石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。

2)肝脏组织切片

使用切片机切片(切片厚度5μm)。

3)肝脏组织苏木精-伊红(he)染色

将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→苏木素(5分钟)→自来水洗去切片上的浮色→1％盐酸酒精(1至3秒)→自来水洗数下→scott促蓝液(碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100ml)(1分钟)→自来水洗数下→伊红(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

4)肝脏组织油红o染色

①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4％多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。

②以60％异丙醇处理1分钟。

③用油红o(公司sigma，货号o0625，浓度0.5克/100ml100％异丙醇)染色30分钟。

④之后以60％异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。

⑤用mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。

⑦用甘油明胶封片，拍照。

4、检测结果

aav8病毒在肝脏中的转染效果以及多肽s1过表达情况如图1所示。相比于生理盐水对照组，aav8-gfp以及aav8-s1组小鼠肝脏组织中在荧光显微镜下均可见明显绿色荧光，且两组之间荧光强度无显著差异(图1a)，这一结果表明aav8-gfp以及aav8-s1组所注射的病毒载体在小鼠肝脏中均表达良好。westernblot检测结果如图1b所示，aav8-gfp组未检测到s1多肽表达，aav8-s1组条带明显，即在该组小鼠肝脏中，s1多肽显著表达。

体重及空腹血糖变化结果如图2a、b所示，在高脂饲料饲养24周后，过表达s1多肽组小鼠体重和空腹血糖水平与对照组相比无显著差异，但是血清胰岛素检测结果表明，当小鼠肝脏中过表达多肽s1时，经高脂饲养24周后，小鼠的血清胰岛素含量显著低于未过表达多肽s1对照组(图2c)。这一结果表明肝脏组织中s1多肽的过表达可显著缓解高脂饮食所导致的胰岛素抵抗。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitonealglucosetolerancetests，ipgtt)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，结果如图3所示。通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后30分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且aav8-s1组小鼠血糖水平在15min、30min、60min时均显著低于aav8-gfp对照组。表明s1多肽的过表达有助于维持糖代谢的稳态。

高脂饲料饲养24周后比较两组小鼠肝重结果，s1多肽过表达组小鼠肝脏重量显著轻于对照组(图4)。进一步通过组织切片，进行he及油红o染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏he染色，可以观察到在hfd饲养条件下，aav8-gfp组小鼠肝脏组织脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态被破坏，而aav8-s1组小鼠的肝细胞脂肪变性减轻(图5上)；通过肝脏油红o染色来检测肝组织中脂质，可以发现在aav8-gfp组的小鼠的肝门静脉周围呈大面积红色，提示有大量脂质沉积，而aav8-s1组脂质沉积明显较aav8-gfp组减少(图5下)。这些结果表明多肽s1显著减轻了高脂饮食引起的小鼠肝脏脂质沉积以及脂肪变性，抑制脂肪肝疾病的发生。

【实施例6】食蟹猕猴肝脏过表达s1多肽抑制高脂饲养引起的脂肪肝及ⅱ型糖尿病的发生

所有实验猴每两周检测生理指标，包括体重，体温，呼吸，心率，血压，腰围，臀围，坐高等指标。每4周进行腹部超声检测以及空腹血糖检测。第0周及30周时采集血液5ml分离血清后进行空腹胰岛素，血脂(甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)及肝功能(alt、ast)检测。在第30周时，通过穿刺活检术取出组织通过gfp荧光检测以及westernblot检测腺相关病毒介导的多肽s1的过表达。

1、荧光检测以及肝脏组织westernblot分析

制作肝脏组织冰冻切片，在荧光显微镜下观察gfp的绿色荧光强度，以确定腺相关病毒的感染效率；肝脏组织westernblot分析检测肝脏组织中s1多肽的表达情况。具体实施步骤同小鼠冰冻切片以及westernblot检测步骤。

2、生理生化指标检测

(1)生理指标检测

禁食10-14小时，禁水6小时，盐酸氯胺酮10mg/kg肌肉注射麻醉，检测以上生理指标并记录相关实验数据。

(2)生化指标检测

实验前禁食10-14小时，禁水6小时，盐酸氯胺酮10mg/kg肌肉注射麻醉，静脉采血后测其空腹血糖，并收集血液5ml，分离学清后送公司检测(武汉迪安)胰岛素、脂质及肝功能情况。

3、肝脏组织病理染色相关实验

制作石蜡切片，并进行he和油红o染色。具体切片及染色步骤参考实施例5。

4、检测结果

荧光检测结果如图6a，aav8-gfp以及aav8-s1组猕猴肝脏组织在荧光显微镜下均可见明显绿色荧光，且两组之间荧光强度无显著差异，说明aav8病毒载体在两组猕猴肝脏组织中转染率相同。肝脏组织westernblot检测s1多肽表达结果如图6b所示，可见在aav8-gfp中未见westernblot条带，即未检测到s1表达，而在aav8-s1组中可见明显条带，即aav8-s1门静脉注射组猕猴肝脏中s1多肽表达显著。

猕猴体重及bmi测定结果如图7所示。aav8-gfp以及aav8-s1组食蟹猕猴从实验开始直至高脂饲养30周，两组动物体重均无显著差异(图7a)，且其bmi结果也无明显差异(图7b)。两组猕猴空腹血糖水平在第0周以及第30周均无显著差异(图8a)，但在高脂饲养30周后，aav8-gfp组猕猴血清胰岛素水平显著高于aav8-s1组(图8b)，这一结果表明多肽s1显著减轻了高脂饮食导致的胰岛素抵抗，多肽s1有助于抑制ⅱ型糖尿病的发生。

血脂以及asl、ast检测结果如图9所示。在高脂饲料饲养30周后，aav8-s1组猕猴血清甘油三酯含量显著低于aav8-gfp对照组(图9a)；两组动物血清总胆固醇含量无明显差异(图9b)，但aav8-s1组猕猴血清高密度胆固醇含量高于aav8-gfp组(图9c)，低密度胆固醇含量低于aav8-gfp组(图9d)。两组猕猴ast酶含量无显著差异但aav8-s1组alt酶含量显著低于aav8-gfp组(图9e、f)。这些结果表明，多肽s1抑制了高脂饮食引起的肝功能的恶化以及脂肪肝的发生。

肝脏组织病理染色结果如图10所示，高脂饲料饲养30周后的aav8-gfp组猕猴肝脏切片经he染色后可见明显空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态被破坏，aav8-s1组空泡化较aav8-gfp组明显减轻(图10左)；油红o染色结果可见aav8-gfp组猕猴的肝门静脉周围呈大面积红色，提示有大量脂质沉积，而aav8-s1组红色面积显著减少，脂质沉积量降低。病理染色结果表明多肽s1过表达显著减轻了食蟹猕猴由高脂饮食导致的肝脏脂肪变性以及肝脏脂质沉积。多肽s1可抑制食蟹猕猴脂肪肝疾病的发生。

上述结果显示，多肽s1的过表达可显著减轻hfd诱导下发生的ⅱ型糖尿病以及脂肪肝病变。多肽s1对改善ⅱ型糖尿病及脂肪肝具有显著的作用。多肽s1可有望成为一种治疗ⅱ型糖尿病及脂肪肝的新型药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>武汉大学

<120>一种多肽s1及其在制备治疗脂肪肝和/或ⅱ型糖尿病药物中的应用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>58

<212>prt

<213>人

<400>1

leuhisasnglyargserlysgluglnargleulysgluglnleugly

151015

alaglnglngluprovallyslysserileglngluserglualaphe

202530

leuproglnserileproglugluargtyrlysmetlysserlyspro

354045

leuglyilecysleuileileaspcysile

5055

<210>2

<211>174

<212>dna

<213>人

<400>2

ctccataatgggagaagtaaagaacaaagacttaaggaacagcttggcgctcaacaagaa60

ccagtgaagaaatccattcaggaatcagaagcttttttgcctcagagcatacctgaagag120

agatacaagatgaagagcaagcccctaggaatctgcctgataatcgattgcatt174

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccaagcttggtaccactagtgtcgacgaattcggcagtggagaggg47

<210>4

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggaagatctttacttgtacagctcgtccatgcc33

<210>5

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctctagactcgagaccggtcttaaggctagcgatatcggatccaagcttggtac54

<210>6

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

caagcttggatccgatatcgctagccttaagaccggtctcgagtctagagagct54

<210>7

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gctctagagccaccatgctccataatgggagaag34

<210>8

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgggatcccttgtcatcgtcgtccttgtaatcaatgcaatcgattatc48