本发明涉及一种从自然环境中分离能够感染大肠杆菌后可杀灭大肠杆菌的噬菌体及利用以该噬菌体为有效成分包含的组合物防止及处置致病性大肠杆菌感染的方法。具体讲，就是涉及一种以携带具有特异性杀灭大肠杆菌能力、用序列号1标记的基因组为特征的从自然中分离的长尾病毒科噬菌体Esc-COP-9(受托编号：KCTC 13131BP)及利用以所述噬菌体为有效成分包含在内的组合物防止致病性大肠杆菌的感染及感染后处置的方法。
背景技术：
大肠杆菌属于肠内细菌科，作为革兰氏阴性杆菌、过氧化氢酶(Catalase)阳性、氧化酶(Oxidase)阴性、兼性厌氧细菌，大部分都分解乳糖。大肠杆菌从血清学的角度区分为细胞体(O)、鞭毛(H)、荚膜(K)抗原，且公知为这些抗原与大肠杆菌的致病性相关。致病性大肠杆菌是指大肠杆菌中少数获得病毒性的大肠杆菌，根据发病特征、毒素的种类等通常大致分为肠出血型大肠杆菌、肠产毒型大肠杆菌、肠侵袭型大肠杆菌、肠致病型大肠杆菌、肠集聚型大肠杆菌这5种类型。致病性大肠杆菌会感染多种年龄的家畜使之发病，主要症状为腹泻，因极其严重的脱水而导致的病死率也是非常高的。这种致病性大肠杆菌引起的腹泻病是在我国几乎所有的养殖户中蔓延的主要疾病，由此给畜牧产业带来的损失是相当大的。
通常情况下，为了对致病性大肠杆菌的感染疾病进行预防及治疗而采取的方法有利用疫苗及抗生素的方法。然而利用抗生素的治疗因耐药菌的增加而导致其效果持续下降。同时，由于加强了对动物使用抗生素的规制，因此迫切需要研发出一种除抗生素之外的其它有效方法。
最近，作为细菌性疾病的应对方案，噬菌体(Bacteriophage)的利用受到了极大关注。特别是，由于人们倾向于亲环境方式，使得大家对噬菌体的关注程度比以往任何时候都高。噬菌体作为感染细菌的极小微生物，通常也简称其为抗菌素(Phage)。噬菌体在感染(Infection)细菌后，在细菌的细胞内增殖，增殖后，当子代噬菌体向细菌外游离时，就通过破坏宿主即细菌的细胞壁的方式而杀灭细菌。噬菌体的细菌感染方式具有很高的特异性，因此能够感染特定细菌的噬菌体种类仅限定在一部分。即，特定噬菌体只能感染特定范畴内的细菌。因此，特定噬菌体只能杀灭特定细菌，而不会对其它细菌产生影响。这种噬菌体的细菌特异性只会对目标细菌产生抗菌效果，而不会对环境中或者动物体内的正常菌群产生影响。通常情况下，广泛用于细菌处置的现有抗生素会同时对多种细菌产生影响。因此，造成了环境污染或者干扰动物的正常细菌丛等问题。与此相反，由于噬菌体只对特定细菌有效，因此使用噬菌体不会产生干扰体内正常菌丛等问题。由此，使用噬菌体与使用抗生素相比，不仅更加安全，且使用中带来副作用的可能性也是相对很低的。
噬菌体是1915年英国的细菌学者Twort在对葡萄球菌(Micrococcus)菌落由某种物质溶解后呈透明状这一现象的原因进行研究时发现的。另外，1917年法国的细菌学者d'Herelle发现痢疾患者大便滤液中存在溶解痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)的某种物质，并通过对此进行的研究，独立发现了噬菌体，且从它能够吞噬细菌这一涵义出发将其命名为”噬菌体”。此后，陆续发现了痢疾菌、伤寒沙门氏菌、霍乱病菌等多种针对致病性细菌的噬菌体。
由于噬菌体具有杀灭细菌的特殊能力，因此噬菌体被发现后，研发人员都期待能够研发出一种应对细菌感染的有效方案，并开展了大量相关研究。但是，Fleming发现青霉素之后，随着抗生素的广泛普及，对噬菌体的研究仅在一部分东欧国家和前苏联开展，维持了一线生机。不过，2000年以后，由于抗生素耐药菌的增加，发现了现有抗生素的局限性。随着作为现有抗生素替代物质的研发可能性不断加大，噬菌体作为抗菌剂再次受到了关注。特别是，最近随着全球范围内从政府层面加强了对抗生素使用的规制，人们对噬菌体的关注度进一步升高，将其用于产业方面的事例也在逐渐增加。
如前所述，噬菌体对细菌的特异性非常高。正是由于存在这种特异性，所以即使对属于同一种(Species)的细菌，噬菌体往往也只会对其一部分株(Strain)发挥抗菌效果。另外，随着对象菌株的不同，由此发挥的噬菌体的抗菌力强度本身也会不一样。因此，要想获得针对特定种类的细菌进行有效控制的方法，就需要确保具有多种有用的噬菌体。为了开发出针对致病性大肠杆菌的有效噬菌体利用方法，当然也需要确保可针对大肠杆菌提供抗菌效果的多种多样的噬菌体。进一步地，在确保的多种有用噬菌体中，也需要从抗菌力强度或者抗菌范围的层面筛选具有比较优势的噬菌体加以利用。
技术实现要素：
发明所要解决的课题
因此，本发明人致力于研发一种可用于防止或处置致病性大肠杆菌感染的组合物，其利用能够选择性杀灭大肠杆菌的从自然环境中分离的噬菌体，并利用该组合物研发出防止或处置致病性大肠杆菌感染的方法，经过不懈努力，终于从自然环境中分离出了符合上述条件的噬菌体。同时，为了能够区分所述分离的噬菌体与其它噬菌体并特定其性质而确保了其基因组(Genome)的基因序列后，开发出了以所述噬菌体作为有效成分的组合物，并确认该组合物能够有效用于防止和处置致病性大肠杆菌感染，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种从自然环境中分离的长尾病毒科(Siphoviridae)噬菌体Esc-COP-9(受托编号：KCTC 13131BP)，其特征在于，携带用序列号1标记的基因组，具有特异性杀灭大肠杆菌的能力。
本发明的另一个目的在于，提供一种组合物及利用该组合物的致病性大肠杆菌的感染防止方法，所述组合物以感染大肠杆菌后能够将大肠杆菌杀灭的噬菌体Esc-COP-9作为有效成分包含在内，并且该组合物可用于防止致病性大肠杆菌的感染。
本发明的又一个目的在于，提供一种组合物及利用该组合物的致病性大肠杆菌的感染处置方法，所述组合物以感染大肠杆菌后能够将大肠杆菌杀灭的噬菌体Esc-COP-9为有效成分包含在内，并且该组合物可用于处置致病性大肠杆菌的感染。
本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的以防止和处置致病性大肠杆菌感染为目的的消毒剂。
本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的以防止和处置致病性大肠杆菌感染为目的的饮用水添加剂。
本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的通过防止和处置致病性大肠杆菌的感染以提高饲养效率为目的的饲料添加剂。
课题解决的方法
本发明提供了一种从自然环境中分离的长尾病毒科噬菌体Esc-COP-9(受托编号：KCTC 13131BP)，其特征在于，携带具有特异性杀灭大肠杆菌的能力、用序列号1标记的基因组。同时，本发明还提供了一种利用以所述噬菌体作为有效成分包含的组合物的防止及处置致病性大肠杆菌感染的方法。
噬菌体Esc-COP-9在由本发明人分离后，于2016年10月17日寄存在韩国生物科学与生物工艺学研究院(受托编号：KCTC 13131BP)。
另外，本发明提供了一种消毒剂、饮用水添加剂及饲料添加剂，其以可用于防止和处置致病性大肠杆菌的感染的噬菌体Esc-COP-9作为有效成分包含。
本发明的组合物中所包含的噬菌体Esc-COP-9能够有效杀灭大肠杆菌，因此对由致病性大肠杆菌诱发的疾病的预防(防止感染)或者治疗(处置感染)显示出效果。因此，本发明的组合物可用于由致病性大肠杆菌诱发的疾病的预防及治疗。
本说明书中使用的“防止”或“预防”等术语的含义：(ⅰ)防止致病性大肠杆菌感染；(ⅱ)抑制致病性大肠杆菌的感染发展成疾病。
本说明书中使用的“处置”或“治疗”等术语的含义：(ⅰ)对由致病性大肠杆菌诱发的疾病进行抑制；(ⅱ)使由致病性大肠杆菌诱发疾病的病情减轻的一切行为。
本说明书中的“分离”、“分离的”或“被分离的”是指，从自然状态中利用多种实验方法分离出噬菌体；并确保能与其它噬菌体区分而特定所述噬菌体的特征的事情。同时，还包括，利用生物工程技术将噬菌体增殖以便用于产业领域。
本发明的组合物中包含的药剂学上允许使用的载体为生产制剂时通常使用的物质，包括但不限于：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、洋槐胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。本发明的组合物除了上述成分外，还可包括：润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。
本发明的组合物中作为有效成分包含噬菌体Esc-COP-9。其中噬菌体Esc-COP-9包含1×101pfu/ml～1×1030pfu/ml或1×101pfu/g～1×1030pfu/g。优选地，包含1×104pfu/ml～1×1015pfu/ml或1×104pfu/g～1×1015pfu/g。
本发明的组合物根据具有本发明所属技术领域常规知识的技术人员容易实施的方法利用药学上允许使用的载体及/或赋形剂制成制剂，可以按单位容量形式制造，或者可以装入大容量的容器内而制造。其剂型既可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以包含分散剂或稳定剂。
本发明的组合物根据使用方式的不同可实现为消毒剂、饮用水添加剂及饲料添加剂，但并非仅限于此。
为了提高这种利用目的中的效率，还可以向本发明的组合物中添加针对其它菌种提供抗菌活性的噬菌体。另外，也可以添加对大肠杆菌具有抗菌活性的其它种类的噬菌体。即使是对大肠杆菌具有抗菌活性的噬菌体，在抗菌力的强度，或者抗菌范围的层面，彼此之间都存在差异。因此，将其进行适当组合可最大限度地发挥其功效。
发明效果
利用以本发明噬菌体Esc-COP-9为有效成分包含的组合物的致病性大肠杆菌的感染防止及处置方法，与现有基于抗生素等化学物质的方式相比，优点在于其对大肠杆菌的特异性非常高。这意味着，它不会对其它有用的正常菌群产生影响，同时还能够用于致病性大肠杆菌的感染防止或处置，而由其产生的副作用却又非常小。通常情况下，如果使用抗生素等化学物质，对普通的正常菌群也会造成损害，最终会导致动物的免疫力降低，从而显示出随使用的多种副作用。另外，由于本发明是分离自然界中已经存在的噬菌体作为组合物的有效成分，因此它还具有非常亲自然、环保的优点。另外，即使噬菌体中能够发挥抗菌活性的菌种相同，就抗菌效果的发挥而言，在抗菌力的强度，或抗菌范围【在从属于大肠杆菌的多种细菌菌株(Strain)的侧面，噬菌体对个别细菌菌株发挥抗菌活性的范围。通常情况下，噬菌体只能够对属于同一菌种(Species)的一部分细菌菌株(Strain)发挥抗菌活性。即，即使属于同一菌种，个别不同的细菌菌株对噬菌体的敏感性会存在差异】的层面存在差异。因此，与对大肠杆菌具有抗菌力的其它噬菌体相比，本发明可以提供具有差异性的抗菌效果。这意味着，在实际的产业应用中可以使所产生的效果存在很大的差异。
附图说明
图1是噬菌体Esc-COP-9的电子显微镜照片。
图2是显示噬菌体Esc-COP-9杀灭大肠杆菌能力的实验结果，透明部分是试验对象细菌被溶菌后最终形成的溶菌斑。
具体实施方式
下面，将依据实施例对本发明进行更加具体的说明。但是，所列举的实施例只是本发明的示例，本发明的范围并非仅限定于这些实施例。
实施例1:分离可杀灭大肠杆菌的噬菌体
分离可杀灭大肠杆菌的噬菌体时，利用了从自然环境中确保的样品。另外，用于噬菌体分离的大肠杆菌已由本发明人事先分离出来，并经过鉴定(identification)是致病性大肠杆菌。
下面，详细说明噬菌体的分离过程。在按照1/1000的比例接种大肠杆菌的TSB(Tryptic Soy Broth)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；葡萄糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中一起添加收集的样品(sample)，然后在37℃的条件下振荡培养3-4小时。培养之后，以8,000rpm离心分离20分钟，回收上清液。将大肠杆菌按照1/1000的比例接种到回收的上清液中，然后在37℃的条件下再次振荡培养3-4小时。在噬菌体已包含在样品中的情况下，为确保噬菌体的数量(Titer)能够充分增加，将上述过程总共重复实施了5次。将上述过程重复实施5次后，再将培养液以8,000rpm离心分离20分钟。离心分离后，将回收的上清液用0.45μm的过滤器进行了过滤。通过使用由此获得的滤液的常规的斑点试验(Spot assay)调查是否存在能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。
所述斑点试验按照以下方法实施。将大肠杆菌按照1/1000的比例接种到TSB培养基中后，在37℃的条件下振荡培养一夜。将由此准备的大肠杆菌培养液3ml(OD600为1.5)涂抹(Spreading)到TSA(Tryptic Soy Agar)平板培养基(酪蛋白消化物，15g/L；大豆消化物，5g/L；NaCl，5g/L；琼脂，15g/L)上。将涂抹后的平板培养基在洁净工作台(Clean bench)上放置大约30分钟左右，使涂抹液干燥。干燥之后，将前面准备的滤液10μl点滴到涂抹有大肠杆菌的平板培养基上，并将其放置30分钟左右使其干燥。干燥之后，将经过上述点滴操作的平板培养基在37℃条件下静置培养一天。然后，调查在滴有滤液的位置是否生成透明环(Clear zone)。生成有透明环的滤液，就可以判断为其含有能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。通过这种调查，可以确保包含噬菌体的滤液，而该噬菌体具有针对大肠杆菌的杀灭能力。
利用确认含有能够杀灭大肠杆菌的噬菌体的滤液实施了纯噬菌体的分离。纯噬菌体的分离采用了常规的溶菌斑分析(Plaque assay)技术。具体讲，将溶菌斑分析过程中形成的一个溶菌斑用经过灭菌处理的尖端(tip)回收，然后将其添加到大肠杆菌培养液中，在37℃的条件下一起培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心分离20分钟，获得上清液。在获得的上清液中按照1/50的体积将大肠杆菌培养液添加后，再在37℃的条件下培养4-5小时。为了增加噬菌体的数量，将上述过程至少实施了5次以上，最后以8,000rpm离心分离20分钟，获得上清液。利用获得的上清液再次实施溶菌斑分析。通常情况下，由于纯噬菌体的分离不能仅通过上述1次过程完成，因此利用所述形成的溶菌斑再次重复整个前述步骤。这种过程至少重复实施了5次以上，确保了含有纯噬菌体的溶液。按照惯例，纯噬菌体的分离进行了重复执行，直到形成的溶菌斑的大小及形状全都相似为止。最后通过电子显微镜分析确认是否纯粹地分离了噬菌体。在电子显微镜分析过程中，也重复了前述过程，直至确认了纯粹分离为止。电子显微镜分析采用常规方法实施，下面对此进行简单说明。将含有纯噬菌体的溶液沾到铜网(Copper grid)上，再用2％的乙酸双氧铀(Uranyl acetate)进行负染法(Negative staining)和干燥后，通过透射电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体电子显微镜照片如图1所示，如果通过形态特征进行判断，可以确认获得的新型噬菌体属于长尾病毒科(Siphoviridae)噬菌体。
含有通过这种方式确认的纯噬菌体溶液经过了以下提纯的过程。按照占溶液总体积1/50的体积向含有纯噬菌体的溶液中添加大肠杆菌培养液，然后再培养4-5小时。培养后，在8,000rpm离心分离20分钟，从而获得上清液。为了获得含有充足数量噬菌体的溶液，对这一过程总共重复实施了5次。将最后通过离心分离获得的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤后，实施了常规的聚乙二醇(Polyethylene Glycol；PEG)沉淀过程。具体讲，向100ml滤液中添加PEG和NaCl使其达到10％PEG 8000/0.5M NaCl，然后在4℃的条件下静置2-3小时，接着在8,000rpm离心分离30分钟，从而获得噬菌体沉淀物。将由此获得的噬菌体沉淀物用缓冲液(Buffer；10mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1％明胶，pH 8.0)5ml使其悬浮，将其称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
通过上述过程，获得了经过提纯的纯噬菌体。将该噬菌体命名为噬菌体Esc-COP-9。此后，于2016年10月17日寄托在韩国生物科学与生物工艺学研究院(受托编号：KCTC 13131BP)。
实施例2:噬菌体Esc-COP-9的基因组分离及序列分析
将噬菌体Esc-COP-9的基因组按如下方式进行了分离。基因组的分离利用了以与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液。首先，为了去除悬浮液中可能含有的大肠杆菌的DNA和RNA，向10ml噬菌体悬浮液中分别添加了200U的DNase I和RNase A，然后在37℃的条件下放置了30分钟。放置30分钟后，为了消除DNase I和RNase A的活性，添加0.5M乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)500μl后，再静置10分钟。然后，将其再在65℃的条件下静置10分钟。接着，为了瓦解噬菌体的外壁，添加蛋白酶K(20㎎/ml)100μl后，使其在37℃的条件下反应了20分钟。然后，添加10％十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate；SDS)500μl，接着让其再在65℃的条件下反应了1小时。反应1小时后，向该反应液中添加10ml按照25：24：1的构成比由苯酚(Phenol)：三氯甲烷(Chloroform)：异戊醇(Isoamylalcohol)组成的混合液并充分搅拌均匀。然后，将其以13,000rpm离心分离15分钟使其分层，接着从分离的层中取上层，向其中添加1.5体积比的异丙醇(Isopropyl alcohol)后，以13,000rpm离心分离10分钟，使基因组沉淀。将沉淀物回收后，向沉淀物中添加70％乙醇(Ethanol)，然后再以13,000rpm离心分离10分钟，对沉淀物进行了洗涤。将已洗涤的沉淀物回收，对其实施真空干燥后，再将其溶解于100μl的水中。重复执行上述过程，获得了大量噬菌体Esc-COP-9的基因组。
在首尔大学农业与生命科学仪器中心(National Instrumentation Center for Environmental Management)利用由此获得的基因组使用illumina Mi-Seq仪器进行了下一代碱基序列分析(Next generation sequencing analysis)，获得了噬菌体Esc-COP-9的基因组序列信息。最终，分析的噬菌体Esc-COP-9基因组具有的大小为51,102bp，全部基因序列用序列号1标记。
以获得的噬菌体Esc-COP-9基因组序列为基础，利用网上的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对其与现在已知噬菌体基因组序列之间的相似性(Similarity)进行了调查。BLAST调查结果表明，噬菌体Esc-COP-9的基因组序列与志贺氏菌噬菌体pSf-1的序列(基因库登记号.KC710998.1)有比较高的相似性(同一性：93％)。但是，与噬菌体Esc-COP-9具有环状的基因组相反，志贺氏菌噬菌体pSf-1具有线性基因组，二者在基因组的形态方面具有很大的差异。噬菌体Esc-COP-9基因组上的开放型解读框架(Open Reading Frame，ORF)的个数为89个，与此相反，志贺氏菌噬菌体pSf-1为94个，它具有与噬菌体Esc-COP-9不同的开放型解读框架个数。
根据这一事实可以得出的结论是，噬菌体Esc-COP-9为与现有已报告的噬菌体不同的新型噬菌体。与此同时，通常情况下，如果噬菌体的种类不同，则其能提供的抗菌力的强度及抗菌范围也不同，通过这一事实可以判断，噬菌体Esc-COP-9能够提供与现有已报告的其它噬菌体不同的抗菌效果。
实施例3:噬菌体Esc-COP-9杀灭致病性大肠杆菌的能力调查
对分离噬菌体Esc-COP-9杀灭致病性大肠杆菌的能力进行了调查。杀灭能力调查是按照通过实施例1中提出的斑点试验调查是否生成透明环的方式实施的。用于杀灭能力调查的致病性大肠杆菌是由本发明人分离并鉴定为致病性大肠杆菌，总共用了10株。噬菌体Esc-COP-9针对成为实验对象的10株致病性大肠杆菌中的总共9株具有杀灭能力，具有代表性的实验结果如图2所示。另外，还调查了噬菌体Esc-COP-9对支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)及绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的杀灭能力，结果表明，噬菌体Esc-COP-9对这些菌种不具有杀灭能力。
从以上结果可知，噬菌体Esc-COP-9对致病性大肠杆菌具有优秀的杀灭能力，对多数的致病性大肠杆菌都能够发挥抗菌效果。这意味着，噬菌体Esc-COP-9可作为以防止及处置致病性大肠杆菌的感染为目的的组合物的有效成分而使用。
实施例4:噬菌体Esc-COP-9预防致病性大肠杆菌的感染的实验例
向装有9ml的TSB培养基的一个软管内加入100μl的1×108pfu/ml标准的噬菌体Esc-COP-9溶液，向另一个装有9ml的TSB培养基的软管内仅再添加了等量的TSB培养基。然后，向各个软管内加入致病性大肠杆菌的培养液，使其在600nm处的吸光度约为0.5左右。添加致病性大肠杆菌后，将软管移至37℃的培养器中进行振荡培养，并观察了致病性大肠杆菌的生长状态。如表1所示，在添加有噬菌体Esc-COP-9溶液的软管中，观察到致病性大肠杆菌的生长被抑制。相反，在未添加噬菌体溶液的软管中，未观察到致病性大肠杆菌的生长被抑制的现象。
【表1】
致病性大肠杆菌的生长抑制
通过这一结果可以确认，本发明的噬菌体Esc-COP-9不仅能够阻碍致病性大肠杆菌的生长，而且具有将其杀灭的能力。由此可以得出的结论是，噬菌体Esc-COP-9可作为以防止致病性大肠杆菌感染为目的的组合物的有效成分而使用。
实施例5:利用噬菌体Esc-COP-9治疗致病性大肠杆菌感染疾病的示例
对噬菌体Esc-COP-9的针对猪的治疗效果进行了调查，该猪诱发了由致病性大肠杆菌引起的疾病。将出生后25天的断奶仔猪4头分为一组，总共分为两组，然后将其分开饲养在实验用饲养猪舍(1.1m×1.0m)中，实验进行了14天。在保温设施下对周围环境进行控制，使猪舍的温度与湿度保持恒定，每天都对猪舍地面进行了清扫。从实验开始日起的第7天，对所有的猪都使用口腔灌输管使猪口服了致病性大肠杆菌溶液。口服的致病性大肠杆菌溶液按如下方法准备。将致病性大肠杆菌利用TSB培养基在37℃的条件下培养18小时后，只回收菌体。然后，将其用生理盐水(pH 7.2)调整到109CFU/ml。从口服致病性大肠杆菌的次日开始按照与注入致病性大肠杆菌溶液相同的方式每日使实验组(注入噬菌体溶液的组)的猪口服2次109PFU的噬菌体Esc-COP-9，而对照组(未注入噬菌体溶液的组)的猪未做任何处理。为对照组和实验组提供的饲料和饮用水都是相同的，从注入致病性大肠杆菌后开始每日以所有的试验动物为对象调查了腹泻发生状况。腹泻发生状况调查是按照测定腹泻指数的方式实施的，腹泻指数测定按照测定常规排泄物稠度(FC)分数(正常：0，软便：1，拉稀：2，严重腹泻：3)的方式实施，其结果如表2所示。
【表2】
腹泻指数测定结果
通过这一结果可以确认，本发明的噬菌体Esc-COP-9对于治疗因致病性大肠杆菌诱发的感染疾病也非常有效。
实施例6:饲料添加剂及饲料的制造
利用噬菌体Esc-COP-9溶液制造饲料添加剂，确保每1g饲料添加剂中含有1×109pfu的噬菌体Esc-COP-9。饲料添加剂的制造方法如下，向噬菌体溶液中添加麦芽糖糊精(50％，w/v)后进行冷冻干燥即可。最后，将其粉碎成细粉状。在所述制造过程中的干燥过程可以采用减压干燥、加温干燥、常温干燥。为了进行对比实验，不含噬菌体的饲料添加剂按照以下方式制造，即使用制造噬菌体溶液时使用的缓冲液(buffer；10mM Tris-HCl，10mM Mg SO4，0.1％明胶，pH 8.0)代替噬菌体溶液。
将通过上述方法制造的2种饲料添加剂分别按照重量比与1,000倍的养猪用饲料混合最终制成了2种饲料。
实施例7:饮用水添加剂及消毒剂的制造
饮用水添加剂或者消毒剂只是使用方式有差异，其剂型都是相同的，因此，两者都是采用相同的方式制造的。利用噬菌体Esc-COP-9溶液制造饮用水添加剂(或消毒剂)，确保每1ml饮用水添加剂(或消毒剂)含有1×109pfu的噬菌体Esc-COP-9。饮用水添加剂(或消毒剂)的制造方法如下，按照添加所述噬菌体Esc-COP-9溶液并充分混合的方式制造，确保制造噬菌体溶液时使用的每1ml缓冲液中含有1×109pfu的噬菌体Esc-COP-9。为了进行对比实验，不含噬菌体的饮用水添加剂(或消毒剂)按照以下方式制造，即直接使用制造噬菌体溶液时使用的缓冲液本身。
将通过上述方法制造的2种饮用水添加剂(或消毒剂)按照体积比用1,000倍的水稀释后用作最终的饮用水或消毒剂。
实施例8:确认养猪的饲养效果
对利用实施例6及实施例7中制造的饲料、饮用水及消毒剂养猪的饲养效果是否有改善进行了调查。特别是，本调查是从病死率的角度出发实施的。将总共30头仔猪每10头分为一组，总共分为3组(用饲料喂养的组-A；用饮用水供给的组-B；消毒处理的组-C)，试验实施了4周。将每组再分为由5头组成的小组，各小组再分为使用噬菌体Esc-COP-9的小组(小组-①)及不使用噬菌体的小组(小组②)。作为本试验对象的仔猪是出生后20天的断奶仔猪，将各试验小组的仔猪饲养在按一定间隔隔开的不同独立猪舍中，各小组按表3所示情况进行区分及指示。
【表3】
猪饲养试验中的小组区分及表示
如果用饲料喂养，就用实施例6中制造的饲料根据表3中的区分按照常规饲料喂养方式进行喂养。如果用饮用水喂养，就用实施例7中制造的饮用水根据表3中的区分按照常规饮用水喂养方式进行喂养。如果是消毒处理，就一周3次与现有消毒方式轮流消毒。喷洒本发明消毒剂的日子就不用普通的消毒剂进行消毒，试验结果如表4所示。
【表4】
通过以上结果可以确认，用依据本发明制造的饲料及饮用水喂养和依据本发明进行消毒处理在饲养猪的过程中可以有效降低病死率，由此可以得出的结论是，使用本发明的组合物可以有效改善养猪效果。
在上述说明中，对本发明的特定部分进行了详细阐述。具有本行业常规知识的技术人员都会明白，以上详细说明仅是本发明的优选实施例，本发明的范围并非仅限定于此。因此，本发明的实际范围应当根据权利要求项及其等同物确定。
【受托编号】
寄托机构名称：KCTC
受托编号：KCTC 13131BP
受托日期：20161017
<110> 因特伦生物技术株式会社
<120> 大肠杆菌噬菌体Esc-COP-9及其致病性大肠杆菌增殖抑制用途
<130> DFP16KR2908
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 51102
<212> DNA
<213> Bacteriophage Esc-COP-9
<400> 1
atattgaaac agcttttgac cttgcgaagc agtctgataa aatggcggcg cagcgtaaat 60
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ttgatggcgc ttgtgttctt gagaatgcgg aaggaaacca gaacaaaaac atttttgttg 300
gtgttgcagt ccagcatggc ggcgttgatg ctatgggcaa taagctaatt aagccgatgg 360
cggcaagcgg caaggcttac ggtgttgcaa ttcgatccca cttccagacg acttcggctg 420
acggtcgaat gatttatgag tctggcggcg gaatcaacgt aatgactgag gggcgtgttt 480
ggatgttggc taaagacgct tccgcaccag cgttcggcgc tacaatcaaa ctgtctgatg 540
atggtcaggt tgataccgcg tctggtacta tcgaaaccaa ctggatcgcg actggtgatt 600
tcaccaagtt tcaagacttg aagctggtag aggttcaggt acaaaaagtt ccggcagttt 660
cagcagttta ataaatatgg cgctcactga gcgccttttt tatatttggg gttatcatga 720
gtgattattc agtcattgtt ggcgctgagt cgccagggtg catggtcgat tcttcaataa 780
tggtgattaa cggatctttc gtgtgcggag atgaatttat tgagccaggt aagattgtgc 840
gactatcaca tataacaaat ggatacaaaa tagcaagtgt taatggggat ctcgttattg 900
gtgtggcagt aaggccgccg gactcgtgca tatatgagga gggtgatccc gttagtgtag 960
ttagtagagg tagtgtgtgg tgcttaactt ctgagagcga agcgccagaa tatggagata 1020
aagtatttgt aacgcaagat ggagatgcgg catacagtga aggcgacttg ctgattggtt 1080
ggatctttac tggcgaacat gtaaaggttg atcatgagtc atatattgtc ggggtaagca 1140
ttagcgcata acacaaaatt atgttgcacg tttaacaaaa aatgctatca ttggggcgtt 1200
acatactaac agcctttata tatggaggaa gaaaatggaa aaagaaaaat ttgatcagct 1260
agatgcggat attgtttcta gctatctggc tactcgcggc gttaagggtg atgcttctga 1320
tatgggtatc tggacggcgc aagagcttca caagatccgc tctaatgctt acgagaaaga 1380
atatccggca ggttcagcgc ttcgtgtatt ccctgtaact aatgagcttt ctgatactga 1440
taagactttt gaatatcaga tgtttgacaa ggttggttac gcaaaaatta tcgctgatta 1500
caccgacgac ctaccgaccg ttgacgcgct gatgtcaagc gaatttggta aagtgttccg 1560
cctgggtaac gcgttcttga tctccattga cgaaatcaag gctggtcagc gtactggcaa 1620
gagcctttcc actcgcaagg caaacgcagc gcaaaacgct catgatcagg aagttaaccg 1680
cctggtgttt aagggttcaa agccgcataa gattctttcg gtgttcgaac atcctaacct 1740
gacaaagatc gtgtcaactg gctggttaag tgctgatgaa aacactaagt tcccgcaggc 1800
agcatctgat gaactggaaa aggctattga aaccattcag accatcacca atggtcagca 1860
ccgagcaacc aacatcctga ttccgccatc tatgcgcaag gttctttccg ttcgaatgga 1920
aaacaccact gaaagttatc tggaatactt ccagaaacaa aacagcggaa tcaccattga 1980
ctcaatcgca gagcttgagg atattgatgg cacaggaacg aaaggttgcc tggtatatga 2040
gaaagacccg atgaacatgt cgatcgaaat tccagaagca tttaacatgc ttcctgcgca 2100
accaaaagat ctgcatttca aagttccgtg tacttcaaaa tgtactggcc tgacgattta 2160
ccgtccgttt acgctagtgc ttattactgg cttgaaaaaa ccaagttaat cgtataacat 2220
tggggaatcc ttaactggat tccctttttt ttattggagg ttatgaaatg gctaaagaaa 2280
aaactgtaac gctaaaggtt tccggcgtgt gccttatcat tgttgatggt gagcattatc 2340
atccaggcaa agagtttgac gtagaagaat caaaattgaa aacaagcgcg tttgaatatc 2400
taattgcaaa aggcgatctt gaggttaaag acaactccgc attgaacgaa gaaatcaaac 2460
agagcgcagc aagcaaacgt aaaaaagacc cgcgagaggg caagagcaaa gccgaacttg 2520
aagacggcgg catctattaa taaagagggc gcttatagcg ccctttgtca tatctggagg 2580
aaacaaaatg gttgatgaat ttttcactga cgcagaaatc acgcagcaaa tcgtgaaatt 2640
agctccaccg atgaaacaga ttgatccaga tttaatggtg gcatggattg atctagcaaa 2700
ggaatttgtt tgcaagaagc ggtttaaaga atcatatcct aaagcggttg ccctttatac 2760
tttgcacctt atgacgcttg atggagctat gaagcaagaa ggggaaggcg tagagagtta 2820
ctcacggcgc gtggcgtcat tttccctgac tggtgaattt agccagacat ttgatcgcgt 2880
gtccggcgat tcaagcggaa aagagattag acaaactccg tggggcaaaa tgtatgagac 2940
gttaaataga aaaaaaggcg gtggatttgg ccttgtgact ggatttcgga ggcgctgcaa 3000
atgaactata acgagatcgc aagaatggca accgaaggaa ttaacttctt tagtgatagc 3060
aacggtgagt ttaagtgcat aacgcagcgt ggaagcgttg aaataatcgg aggcgaagaa 3120
gtacaaaagc cagagattag tgtaatgatt aaaggtttaa ttcgctcacc aaaagtacgc 3180
gaggttgacg gcgagacaat acgagtaaac gataagctgg gagttttcaa caataatgtt 3240
gaaattaaga acgggtatca tattgatgtt gatggtgaat tatatgttgt agttgaagca 3300
agaccaatca gacaaaccaa tgtcacagtt gcttatcggc ctattttgag aaggatttcc 3360
gtgcatggct aaaaactaca cgataaggga atttcatggc aacattgatg cgtggataaa 3420
cgccgttgat aatggactaa aagattgcgt ggaattgttc gccgaaaaag tacacacaga 3480
tttggttaag cgttctcctg tagatactgg tcgttaccgt gcaaactggc aggtaacagc 3540
aaacaatccg ccattgtatg cgcttaacca gtacgataag cacggcgaca aaacgatcgc 3600
ggaaggcaag cgcgccatat acgcaatatt acgaggtggc ggagcagtaa gagccattta 3660
tttttccaat atgcttattt atgctaacgc gcttgagtac ggtcattcaa aacaagcgcc 3720
agcgggtgtg cttgggattg tagctgttaa gttgagatct tatatggctg aagcaataaa 3780
agagtcgagg gctaaaaatg cactatgaat taatgctatc ggcgcgtaag gcgctggcga 3840
ctgaatacga aagcagattc atgatcgctt atgaaaacgt agagtttacg ccacctggtg 3900
acggttcgcc gtggttgaag tttgactatg ccgaagttga cacagaatac ttgtcattgg 3960
atcgcaaatg cgtttcttat atcggaatga ttcaggttgg tattgtgttt ccaccaggtt 4020
acggaactga caggccgcgc gttctcgcta aagagattgc gcaattcttt tacgatggta 4080
aaatgctgga gcatggttat atatatgagg gtgcaagagt tcacaagccg ctcaagagtg 4140
aaagcggttg gattctccca ataaggtttt atgttcgaat tgaaacaaag gagtaaaaat 4200
tatgcattta ccaaatggat cgcaaatttt cgttgagagc aatcgcggaa gcgaaatcca 4260
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gtacaagaaa ggtgattatg tgatcatcac tgcgtcttct tggggtaagc tgattgatcg 4380
tgttatgcgt gtaaaggcta acggtgaaga aacaagcgtg actcttgaag gcgtagatac 4440
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ttatcagtgt ttggcagacg atcaggaaca gcagttacct acctataaga gcgccgtttc 4620
tcttacctac acttttgcgc acgaatacga taacgcgatc tatccgctat tgcgttcagc 4680
agatgaatca ggcgaagtaa ccgctcttcg catgtatgta ccaaaagcaa aagagatgcg 4740
ttgctgggct ggtgtgcttt cgtttaacga aatcccgcag accacagtta acgaaatgga 4800
aactgtttcc ctttctgtat cactgaaagg tcgattcacc tttctaccct ctcaagtaga 4860
gtaataacaa ggggcattgc gccccttttt ttgttactgt acaatcatga tacacgattc 4920
ataatcaatt cttttaacaa aaagtgctat caaggagaaa gaaatgtcaa aaatgaaatt 4980
gacgattggg ccgcttcctg actttaaatt accagtgaaa tttgcaatgc ctaacggaga 5040
agatcaaaca attatcttca cagttcgcca ccgcaaaaca agtgagattc acgagcgcta 5100
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tcttgatgat gaatttaacg aagaaaatat taaacagctt cttgattact acccagcgac 5220
agcaatcgga ttaactagcg catacatgaa agcgcttgcg gggcagcgag taaaaaacta 5280
aaaagggcgg tttacctgtt ttatcagaaa ccgccgacag atgcagagct tgaggccgtt 5340
ggccttacaa gggcagacta tgaaggagaa gatccgccag aggttatatt tgatgaaagc 5400
atgatgcaat catgggatat attttgcgca atgcaaacgc aatggagatg ttcaggcggt 5460
ggcgcttacg gatttgatta taacgtcttg cctatgcttt ttgagattta caaggttgag 5520
gatcgcgaga tggcgctaaa cgacttgcga atcatggagc aaaaagcact tgaaatgatg 5580
cattcaaaat aagcgcctac gggcgctttt ttattacctg gaggattaat aatgtcagaa 5640
caatacgcag gcttgacgct tggggttgat gtttctcaac tcaacaatgc tgtaaagtct 5700
ttgcagcaat tcaaaaaggc aaacgacgat gcaaagggaa gcgttgagag ttttgttgat 5760
tcagaggttg ttgcaagaca aagagccaaa caactggctg aggaattggc aaagcagaag 5820
caagaattta aagcaattca gtcggcaata gatccgacag caagcaaaat ggataagttg 5880
cgccaggctg cgacacagct tgatgcgctt tggaaaaaag gaattgtgcc ggatgataca 5940
ttctttgagt taggatcaat tcttgagacg cagcaaaaca aactgatcgc aactaaaaag 6000
gcgctaactg aagaaggccg cgcggcgctt gaggaagcaa aaaacaaggc aagggcagag 6060
gctgaggcaa gaaagtttat tgcggcattg caggcgcaag ctgacgcagc ggaaaaaaca 6120
aaatcagagc ttgtcgaaat gagagccgca caacttggag ttagtgcaga ggctgcgcca 6180
tttattgcaa aaatgaagga gcaggaaaaa caagcctcaa aacttggcgt ttctatgggg 6240
cagtacaagc aagcaatggc gcaattgcca atgcagatca ctgacgttgt tacttctctt 6300
gcttcaggaa tgccagtatg gatgatcgca atccagcagg gcgggcagat caaggactca 6360
ttcggcggtg ttgctaatac ttttaaagcg ctaatgacat ttgtcacgcc gctaagtgtt 6420
ggaatgacgg cgctgactgg tgctcttggg tatgcagcat ataacgctta caaagccaac 6480
gcacaactga aggagatcac aaaaaccgtt caggatgcaa caggtctttc cggtgagttt 6540
gcagagcgga tcgcaactgg aatccaggcg ctatctgaca agacaggaga gagcgcagac 6600
aatatcgcaa aggcttacat aagcactaag gatggagcaa gcgaggctat acaaaaactc 6660
gtcgatgttg gatttaccta tgacgaagca aaggcaaaag taaacgaata caaaaacgca 6720
tcaagttttg taagtcttaa caatgaaatt gctgatcaca aaaacaaagt tcttgagctt 6780
ggcgattcat ggtatgcggt cttaaaagca aaacgtgatt atgcttcacc gtccggcggg 6840
ctgttgggga aagagcttgg ttatgtgaat ccaatgctgc aatttgcgaa gaacacctat 6900
gaggatatag gaaagatagt aaaagatgcg aataaggata tggcggaacg agcagcacgc 6960
atcgacagag aaaatctttc attaaacaga gttcgagcgg cgcaagaggc tttaaacaaa 7020
gccatagagg atcagaagaa cgtagcaagg acagcagacg aagagttgaa aaagcgcgcg 7080
gctgagaacg tggagttcag gcgaaaagag cttgaagagg cgaagaaggc gcagcagcaa 7140
aaggagaaag ttggtggagt tgtaaaagca ccaacagagc agcttgataa ggagctatat 7200
gttctcaagg cgcaacttga aacgctgaaa gagcaccgaa ctgtaaatga tgttatttca 7260
cgccagaggc aatctttgtg gagcattgaa aagcagatcc agatccttga ggaagcgcaa 7320
agtaaacgca agctgacaaa agcggaacag gcgttactaa acgagcaaaa agcagttatt 7380
gctatggcaa aagaaaaggc agagataggc gatcagattg ttttgcaaca gagaaagaac 7440
aagcaatacc aggaagggct taaattcatt cagcaaacat cagatgctat tgacgctatg 7500
aacttgcgac agtctggagc tacagatctg caaatccagc gagagcttga gttgaagaag 7560
ttgcgaactg attatgttgc tggcggcggt agtatcgacg atgaaattta tcagcagatg 7620
gaagcaaagc tgaaggagta ttacgccact gaggatcagc ttagaaataa ctggattgca 7680
ggagcaaaaa acgcatggga ggtttacgga caagatgcaa tggatatgta cggcaacgtg 7740
caagatattg caagcgaggc gctcaacggt ctaaccaacc aaatggctac attccttgca 7800
acaggaaagg caaactttaa gagcttcgca acgtcaatca tccaaatgat tatccagatg 7860
atcacgaaga tggttatctt taatgccata tctggtgcga ttggaggtga cacttggacg 7920
attggaagcc ttcttaaaaa tgttggattt gcaactggtg gatacactgg cgacggcggg 7980
aagtatgagc cagcaggtgt tgtccataaa ggcgagtttg tcatgacgaa ggaggcaacg 8040
aagaggatcg gagttggaaa tctttacaaa atgatgcgcg gttatgcaaa tggcggcgtt 8100
gttggcggca cttcatacac tggcggcgga gtttcatctg gagcaacaaa tcttaatatt 8160
ggtgggatta gcgttgatat taacaacgga aacgatccaa aagggttgga gactggcgta 8220
aaaatgattt tcactgatat gattaagcgt tcctgtacgc agggtgggga agtttacgaa 8280
tttgttatgt ctaagcgggg gtgatagtga aacttgagca attcaaatgg tgcacgcaaa 8340
cgcaaggagg cggcggcact atgaccacat caaataacga cagggaaatc tcatttggta 8400
atggttacac gcaggttgcg tcaggagggt ttaacactgt acgcagggag ttttccattg 8460
tctatgtggg taatgattac cgagatgttg ttgacttcct gaatggtcac aggttgaagc 8520
cgtttttatg gtttatgcct gacggtcaac ctggtctatt cagggtaaaa tctggtagcg 8580
ttgggttaac tccaatatca gcaaccgttc aggaagtgaa agcaacattt actgagcaat 8640
ttacatcaat gcaataattc aagccgcctt tgtgcggctt ttttattgat gatacaatgt 8700
acgaaaggag gtgcaattat ggctaatgaa acaacaggtc gcgcggatct tgaaaattgt 8760
ctgcaaagcc tttaccctgg cgagattatc acgctaattg agattgacgg tacaaagttt 8820
ggcgcaaaca tttaccgcat acacaatgag aatatatcat acactgcgga agaattatta 8880
caggcgcgag aaactggagt tcttcctccg aaagagatta cattccgtgg cgaggtttac 8940
ggcgcgcgcc cgtttggaat atctggaatc aacttcacaa gcaacggaaa ggctgataag 9000
ccacaattga tactatcaaa ccttgatagc caggtgagcg cgatgattcg caactttaac 9060
ggcatgatgc aagctaaggt tacaatatgg atcacgccag cggaattaat ggggaaagat 9120
ggcagcatta aagatggagc ctcaagaaag ctggtttact acattgagcg accaagccat 9180
tacaatagaa tgatggcgaa atttgacctg acatcgcctt atgatatgga tgggataatg 9240
attcctccgc gaataactca aagcgtttgt tattgggcgc agcgtggatg gtatcgaagc 9300
ggaaaaggtt gcggatacaa tggatcgcga atgtttgaca aagacaacaa tcctgtaacc 9360
gatccatctc aagacttttg cgccggaact gtaacagcgt gcaaacttcg ttttggtgca 9420
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tgattagtgc aaagataaaa cttgaaataa tgcagcacgt aaaagatgaa tacccgcgcg 9540
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tgcatgatga tcctgaaaat cattttgaga tgggcgcaac tgaatacgtt gaggcgtgtg 9660
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ggcctgaagg tgatatgaga atcattgagc ctgaatctcg tcctctgatt ggtcgcccgt 9840
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gtgatatggt tatctttcag ctttccgcgc cagtgtggaa tcatgcaggc atttatcttg 10080
gcaacaatca gttgcttcat catgcctttg gtaagttgtc gagggttgat ttgtattctg 10140
gatggtatca ggaacatgca aaaatggttt gtagacataa ggatctgaaa tatgactttg 10200
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gttgattcat acccagaagc aatacgcgca ctatcttcac aggtggaagg attcaaggac 10320
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gtaggacagc acgatgaaaa agcgtggcaa tgtgcaaagg aagtgaggat tattccaatt 10440
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gcgcgttgcg cggctttttt tttgcccgta taattcaaca aatcaaatag cacaaaaggt 10860
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accagatccc taacatttca atcaagaaga aatggaagct gattaacgtt ccgagtaact 11640
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cgaacaatcc ggcgtgggtt ctttatgaca ttatcacaaa ccagcgatac ggattagatc 11760
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atcagaaagt gccggatgga aaaggcggta cagagccgcg ttatctatgc gacgttgtga 11880
ttcaaagcca gattgaggct tatcagctta ttcgtgatat ttgctcaatc ttccgaggca 11940
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taacagcgat cggatgtaca cgcaggagtg aggctaatcg gcgcggtcga tggatactaa 12240
aaaccaactt gcgcagcact acggtaaact ttgctactgg actggaaggc atgatcccat 12300
caataggtga tgtgattgct attgctgaca actttcacag cagcaacctg aagttaaacc 12360
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ttaaacctga cacggttttt gcaatcgacc gcactgatat tgcattgcag caatacgttg 12600
taacgagtat cggcaaaggt gatgatgatg atgaatttac atactccatc acggctgttg 12660
aatatgaccc gaacaaatac gacgagattg attacggagt aaacattgac gacagaccaa 12720
cctcaattgt ccagcctgac acaatggcag caccggaaaa tgtgcaaata tcctcatact 12780
cgcgaattgt ccagggtgca agcgttgaaa caatggttgt gtcgtgggat aaagtacctt 12840
acgcatcgct gtatgaaatg caatggcgaa aaggtgatgg caactggctg aatacaccac 12900
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ttagatctgt ttctgcttcc ggttcaacgt cgccatggtc cagaattgtg acagcttcac 13020
tgactggtaa ggtaggagag ccaggcgcgc cagttaactt aactgcatca gataatgagg 13080
tgtttggcat tcgtgttaag tgggggatgc cagaaggtag cggagacacg gcatacattg 13140
agcttcatca gtcgccagat ggaacggcgg aaaactcaag tctgttaacg ctggtcccat 13200
atccacaata tgaatactgg cacgggacgc ttccggctgg tcatgttgtc tggtatagaa 13260
tccgcagcgt tgacagaatc ggcaacgttt ccggatggac tgattttgtt agaggcatgg 13320
cttcagatga tgtggaggct gttttaggcg atattcttga taagattttt gataccgaag 13380
caggaaagga tctgaaagag aatgccattg atagcgcaaa caaaatcaag gatcaggcac 13440
aaagcatcat tcaaaacgca ttggcgaatg atgcagacgt taggattatg aggaaggaaa 13500
acggaaaacg caaagccgag tttagacaat caatccaatt gatcgcaagt gaaactgagg 13560
cgcgcgttac cgcaatgacg caacttaagg ctgaatttga cgaggaaata actagcgaag 13620
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atgttgaatc agcgcttaca gaaaaacttg attcatgggc tggcgttaat ggagttggcg 13860
cacagtacgc aatgaaactt ggattgacat acaacgggca gaagtacagc gccggaatgg 13920
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