本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基、其制备方法以及枯草芽孢杆菌的培养方法。
背景技术：
在我国，由于动物养殖密度大、畜禽疾病复杂多样及监管不到位等诸多原因，普遍存在抗生素滥用的问题，例如在防治畜禽疾病时过量使用抗生素、在畜禽饲料中随意添加抗生素、随意使用抗生素药物滤渣、使用违禁种类抗生素等使得动物养殖和食品安全问题日益严峻，且细菌耐药性的提高也为养殖业的可持续发展埋下隐患。目前相关部门和国家机关已经出台一系列限用禁用部分抗生素的政策方针，市场上常用的耐药性较高的抗生素首当其冲。可是当前复杂多样的畜禽疾病也决定了抗菌抗病药物的必要性，研发和寻找新型抗菌物质成为当务之急，具有抗菌能力的生物活性抗菌肽开始被人类深入研究，伊枯草菌素就是其中之一。
伊枯草菌素是由枯草芽孢杆菌产生的一种有环脂肽结构的小分子多肽，一般包括亲水和疏水两部分，疏水部分是β-氨基脂肪酸，亲水部分是由7-10个α-氨基酸形成的酰胺键环。大部分枯草芽孢杆菌都具有产生伊枯草菌素的能力，伊枯草菌素具有较强的抗菌特性，具有抗菌谱广，无副作用的特点，是一种较好的抗菌制剂。
目前取得伊枯草菌素的方式主要有两种：微生物发酵和化学合成，微生物发酵主要是通过发酵枯草芽孢杆菌获得，化学合成法主要根据氨基酸序列合成，但化学合成法无论在产量和成本上都有很大局限性，很难满足生产需要。枯草芽孢杆菌发酵包括液体发酵(专利ZL200910058559.9)和固体发酵(Mizumoto等人)，伊枯草菌素产量最高可分别达到8g/L和3.3g/Kg。但是这两种方法因为成本控制和污染控制问题无法广泛推广。
本发明人长期从事微生物发酵及次级代谢产物研究工作。在对一株枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究改良过程中，通过对发酵培养基的成分比例、发酵工艺参数和发酵方法进行研究，获得了能够高密度发酵枯草芽孢杆菌进而获得高产量伊枯草菌素的培养基配方和发酵方法，完成了本发明。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的是提供一枯草芽孢杆菌培养基、其制备方法以及枯草芽孢杆菌的培养方法，以解决现有技术中提到的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在第一载体液中的含量为：糖10-30g/L、破壁啤酒酵母5-25g/L、水解羽毛粉1-15g/L、蛋白胨1-5g/L、水解蛋白1-5g/L和第一添加剂0.1-0.6g/L。
进一步地，所述发酵培养基的成分以及各种成分在第一载体液中的含量为：糖15-25g/L、破壁啤酒酵母12-18g/L、水解羽毛粉6-9g/L、蛋白胨3-4g/L、水解蛋白3-4g/L和第一添加剂0.3-0.4g/L。更优选为：糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、蛋白胨4g/L、水解蛋白3g/L和第一添加剂0.3g/L
进一步地，所述种子培养基的成分以及各种成分在第二载体液中的含量为：葡萄糖7～14g/L、圣琪酵母浸出物3～7g/L、蛋白胨3～7g/L和第二添加剂6～10g/L。
进一步地，所述种子培养基的成分以及各种成分在第二载体液中的含量为：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L和第二添加剂8.5g/L。
进一步地，在所述发酵培养基中，所述糖为蔗糖，所述蛋白胨为大豆蛋白胨，所述水解蛋白为小麦水解蛋白。
进一步地，在所述发酵培养基中，所述第一添加剂包括该七水合硫酸镁，其加量为0.1-0.5g/L；
进一步地，在所述种子培养基中，所述第二添加剂包括氯化钠和七水合硫酸镁，其加量为：氯化钠8g/L，七水合硫酸镁0.5g/L。
进一步地，在所述发酵培养基中，所述第一添加剂还包括硫酸亚铁，其加量为0.05-0.1g/L。
进一步地，所述第一载体液和第二载体液优选为水。
一种所述的枯草芽孢杆菌的培养基的制备方法：其特征在于：
发酵培养基的制备方法为：按比例称取糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、蛋白胨、水解蛋白和第一添加剂，然后加入第一载体液中，搅拌均匀；
种子培养基的制备方法为：按比例称取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨和第二添加剂，并将其加入第二载体液中，搅拌均匀。
一种采用所述的培养基进行枯草芽孢杆菌的培养，枯草芽孢杆菌的培养方法包括以下步骤：
S1：种子培养：将枯草芽孢杆菌菌种接种于种子培养基中，于30～35℃下，摇床培养，制得一级种子液；
按10％的接种量将上述制得的一级种子液接种于所述种子培养基中，于30～35℃下，摇床培养，培养至种子液中的OD值为3-4时停止培养，即制得二级种子液；
S2：发酵培养：将所述发酵培养基装在发酵罐中，将步骤S1中制得的二级种子液按10％的比例加入发酵罐中进行发酵培养；
S3：检测：步骤S2中发酵结束以后，取发酵液，并对发酵液进行处理，然后检测发酵液中的伊枯草菌素。
进一步地，步骤S2中，所述发酵培养的过程包括増菌培养阶段、发酵表达中前期和发酵表达后期；
増菌培养阶段：0-8h进行増菌培养，増菌培养中的参数为：温度：30～35℃，pH：6.8-7.0，转速：180～250rpm，发酵罐罐压：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
发酵表达中前期：发酵培养至8-60h时进行中前期的发酵表达，中前期的发酵表达中的参数为：温度：28～33℃，pH：6.5-6.8，转速：150～200rpm，发酵罐罐压：0.2-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
发酵表达后期：发酵培养至60-72h时进行后期的发酵表达，后期的发酵表达中的参数为：温度：28～33℃，pH：6.5-6.8，转速：180～220rpm，发酵罐罐压：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％。
进一步地，步骤S3中，所述检测的具体过程为：发酵结束后，取发酵上清用0.45μm滤膜过滤除菌后，采用10KD超滤管进行二次超滤分离，再选用截留分子量为1000Da的透析袋进行处理，真空冷冻干燥，然后以冷冻前样品体积的1/10的比例加双蒸水溶解，0.45μm滤膜过滤得到处理后的发酵液；对测定处理后的发酵液中的伊枯草菌素含量。
本发明至少具有以下有益效果：
①本发明提供了一种培育枯草芽孢杆菌的培养基，该培养基能够有效培养枯草芽孢杆菌，其增值快、存活率高，所培育的菌种活性高，培养基对枯草芽孢杆菌的的生长和次级代谢产物的产生有着重要的影响，并能够通过本发明的培养基(特别是发酵培养基)和优化后的培育方法共同作用使得枯草芽孢杆菌产生伊枯草菌素的量提高，每升发酵液能够获得11g左右的伊枯草菌素，试验过程中最高达到了将近12g，远远高出现有技术中的产量。
②本发明中的发酵培养基营养成分丰富，无需后期补料即可获得高密度菌体和高产伊枯草菌素。
③本发明的发酵工艺简单，操作方便，有利于伊枯草菌素大规模发酵生产；而且该培养基和培养过程不会产生污染以及二次污染问题，并且其成本较现有技术低。
综上，本发明的培养基以及培养方法具有极其重要和广泛的市场应用价值和前景。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种培育高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：
蔗糖10g/L、破壁啤酒酵母25g/L、水解羽毛粉1g/L、大豆蛋白胨5g/L、小麦水解蛋白1g/L、七水合硫酸镁0.5g/L和硫酸亚铁0.05g/L。
实施例2
一种培育高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：
蔗糖30g/L、破壁啤酒酵母5g/L、水解羽毛粉15g/L、大豆蛋白胨1g/L、小麦水解蛋白5g/L、七水合硫酸镁0.1g/L和硫酸亚铁0.1g/L。
实施例3
一种培育高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：
蔗糖15g/L、破壁啤酒酵母18g/L、水解羽毛粉6g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麦水解蛋白3g/L、七水合硫酸镁0.5g/L和硫酸亚铁0.05g/L。
实施例4
一种培育高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：
蔗糖25g/L、破壁啤酒酵母12g/L、水解羽毛粉9g/L、大豆蛋白胨3g/L、小麦水解蛋白4g/L、七水合硫酸镁0.1g/L和硫酸亚铁0.1g/L。
实施例5
一种培育高产伊枯草菌素的枯草芽孢杆菌的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：
蔗糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麦水解蛋白3g/L、七水合硫酸镁0.24g/L和硫酸亚铁0.06g/L。
实施例6
实施例1～5中的任意一个中所述的种子培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：葡萄糖7g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨3g/L、氯化钠8g/L和七水合硫酸镁0.5g/L。
实施例7
实施例1～5中的任意一个中所述的种子培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：葡萄糖14g/L、圣琪酵母浸出物3g/L、蛋白胨7g/L、氯化钠8g/L和七水合硫酸镁0.5g/L。
实施例8
实施例1～5中的任意一个中所述的种子培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：葡萄糖9g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨4g/L、氯化钠8g/L和七水合硫酸镁0.5g/L。
实施例9
实施例1～5中的任意一个中所述的种子培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：葡萄糖12g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠8g/L和七水合硫酸镁0.5g/L。
实施例10
实施例1～5中的任意一个中所述的种子培养基的成分以及各种成分在水中的含量为：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠8g/L和七水合硫酸镁0.5g/L。
实施例11
培育枯草芽孢杆菌的发酵培养基的制备方法为：根据发酵培养基中载体水的体积量，然后按上述实施例1～5中任意一个实施例所述的比例称取蔗糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、大豆蛋白胨、小麦水解蛋白、七水合硫酸镁和硫酸亚铁，然后将这些成分加至水中，搅拌均匀，灭菌处理；
培育枯草芽孢杆菌的种子培养基的制备方法为：根据种子培养基中载体水的体积量，然后按上述实施例6～10中任意一个实施例所述的比例称取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨、氯化钠和七水合硫酸镁，然后将这些成分加至水中，搅拌均匀，灭菌处理。
实施例12
11、一种枯草芽孢杆菌的培养方法，其包括以下步骤：
S1：种子培养：取斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，将枯草芽孢杆菌菌种接种于装有300ml种子培养基的1L三角瓶中，接种后，种子培养基中的芽孢含量约为106cfu/ml，于33℃下，160rpm摇床培养8-10h，培养至种子液中的OD值为1-2时停止培养，即制得一级种子液；
按10％的接种量将上述制得的一级种子液接种于装有400ml种子培养基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm摇床培养12h左右，培养至种子液中的OD值为3-4时停止培养，即制得二级种子液；
上述的种子培养基为按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,5g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化钠/1L水，0.5g七水合硫酸镁/1L水。
S2：发酵培养：将30L的所述发酵培养基装在50L发酵罐中，将步骤S1中制得的二级种子液按10％的体积比例加入发酵罐中进行发酵培养，该发酵培养的过程包括前8小时的増菌培养阶段、8-60小时时的中前期的发酵表达阶段和60-72小时的后期的发酵表达阶段；
该发酵培养基中为按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麦水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸镁/1L水、0.05g硫酸亚铁/1L水。
具体发酵中的具体参数如下表1所示。
表1 发酵罐中发酵工艺的参数
S3：检测：步骤S2中发酵结束以后，取发酵上清用0.45μm滤膜过滤除菌后，采用10KD超滤管进行二次超滤分离；由于超滤分离得到的是截留后的滤出液，而小分子的盐类也随之在滤出液中存在，故需要对滤出液进行脱盐处理,该脱盐处理选用截留分子量为1000Da的透析袋除去盐分而保留目的多肽，然后真空冷冻干燥，再以冷冻前样品体积的1/10的比例加双蒸水溶解，0.45μm滤膜过滤备用。
采用高效液相色谱法测定伊枯草菌素含量(标品有上海佑隆生物技术有限公司提供，纯度99.9％)。色谱条件为：色谱柱C18×150mm，流动相为45％乙腈：5％甲醇：50％水，流速为0.8ml/min，波长为280nm。经检测，经过72h发酵，发酵液上清中的伊枯草菌素含量为8.64g/L，伊枯草菌素含量较高，其说明了本发明中的培养基和优化后的培养方法对枯草芽孢杆菌的的生长较好以及其次级代谢产物的产生量较大。
实施例13
一种枯草芽孢杆菌的培养方法，其包括以下步骤：
S1：种子培养：同实施例12的步骤S1，这里不再重复限定；
S2：发酵培养：将30L的所述发酵培养基装在50L发酵罐中，将步骤S1中制得的二级种子液按10％的体积比例加入发酵罐中进行发酵培养，该发酵培养的过程包括前8小时的増菌培养阶段、8-60小时时的中前期的发酵表达阶段和60-72小时的后期的发酵表达阶段；具体发酵中的具体参数如下表1所示。
该发酵培养基中为按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、12g破壁啤酒酵母/1L水、8g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、2.5g小麦水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸镁/1L水、0.075g硫酸亚铁/1L水。
S3：检测：具体过程同实施例12步骤S3，这里不再重复限定。经检测，经过72h发酵，发酵液上清中的伊枯草菌素含量为9.33g/L，伊枯草菌素含量较高，其也同时说明了本发明中的发酵培养基对枯草芽孢杆菌的的生长和次级代谢产物的产生有着重要的影响。
实施例14
一种枯草芽孢杆菌的培养方法，其包括以下步骤：
S1：种子培养：同实施例12的步骤S1，这里不再重复限定；
S2：发酵培养：将30L的所述发酵培养基装在50L发酵罐中，将步骤S1中制得的二级种子液按10％的体积比例加入发酵罐中进行发酵培养，该发酵培养的过程包括前8小时的増菌培养阶段、8-60小时时的中前期的发酵表达阶段和60-72小时的后期的发酵表达阶段；具体发酵中的具体参数如下表1所示。
该发酵培养基中为按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、20g破壁啤酒酵母/1L水、13g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、4g小麦水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸镁/1L水、0.075g硫酸亚铁/1L水。
S3：检测：具体过程同实施例12步骤S3，这里不再重复限定。经检测，经过72h发酵，发酵液上清中的伊枯草菌素含量为10.95g/L，伊枯草菌素的含量极高，其说明了发酵培养基对枯草芽孢杆菌的的生长和次级代谢产物的产生有着重要的影响。
实施例15
一种枯草芽孢杆菌的培养方法，其包括以下步骤：
S1：种子培养：取斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，将枯草芽孢杆菌菌种接种于装有300ml种子培养基的1L三角瓶中，接种后，种子培养基中的芽孢含量约为106cfu/ml，于33℃下，160rpm摇床培养8-10h，培养至种子液中的OD值为1-2时停止培养，即制得一级种子液；
按10％的接种量将上述制得的一级种子液接种于装有400ml种子培养基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm摇床培养12h左右，培养至种子液中的OD值为3-4时停止培养，即制得二级种子液；
上述的种子培养基为按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,7g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化钠/1L水，0.5g七水合硫酸镁/1L水。
S2：发酵培养：将30L的所述发酵培养基装在50L发酵罐中，将步骤S1中制得的二级种子液按10％的体积比例加入发酵罐中进行发酵培养，该发酵培养的过程包括前8小时的増菌培养阶段、8-60小时时的中前期的发酵表达阶段和60-72小时的后期的发酵表达阶段；具体发酵中的具体参数如下表1所示。
该发酵培养基中为按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麦水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸镁/1L水、0.05g硫酸亚铁/1L水
S3：检测：具体过程同实施例12步骤S3，这里不再重复限定。经检测，经过72h发酵，发酵液上清中的伊枯草菌素含量为9.05g/L，该实施例也说明了种子培养基对枯草芽孢杆菌的生长和次级代谢产物的产生有重要作用，尤其是圣琪酵母浸出物。
具体实施时，本发明中的培养量可根据种子培养基和发酵培养基中各种成分的之间的比值按比例扩大，但不管规模如何，只要比例在本发明的范围内，便在本发明的保护范围内，且本发明扩大生产后不会影响最终的结果。
本发明中的七水合硫酸镁可用硫酸镁代替，但需要根据分子量适当减少加量便可。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。