本发明属于固相萃取技术领域，特别涉及一种苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱的制备方法及使用方法，并和高效液相色谱方法结合用于选择性分离、富集及检测药品中的核苷类物质的含量。
背景技术：
分子印迹技术是指采用人工方法制备在空间结构和结合位点上对特定分子有专一性结合作用的聚合物技术。分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers,mips)是通过模板分子、功能单体和交联剂三者之间相互作用而合成的一种具有三维空间结构的“受体”，对模板分子具有独特的“记忆”功能，因而表现出特殊的亲和性、高度的选择性以及卓越的分子识别能力。尽管如此，分子印迹聚合物在其制备过程中仍存在印迹位点分布不均一、“包埋”过深，不利洗脱等问题，为了解决这些问题，一些新型的分子印迹材料相继发展起来。
中空分子印迹(hollowmolecularlyimprintedpolymers,h-mips)技术作为一种新型分子印迹技术，是在表面分子印迹技术的基础上，通过化学溶解或刻蚀的方法，去除载体基质，得到具有中空结构的聚合物，这种新型制备技术制得的聚合物使大部分结合位点分布在载体基质材料表面上，有利于模板分子的洗脱和目标物的再结合，有效的解决了在分子印迹技术发展过程中出现的印迹位点分布不均一、“包埋”过深，不利洗脱等问题，同时又减小了聚合物内部存在扩散阻力，提高印迹材料吸附分离效率，因而被广泛应用于固相萃取等方面。
硼酸化学法是利用硼酸基团在碱性水溶液中可以与顺式二醇类物质，如核苷类物质所含的顺式邻位或间位羟基发生可逆反应形成环状二酯，并且在酸性条件下实现可逆地解离，从而对含有顺式二醇结构的核苷进行分离富集。这种ph开关的特性使硼酸成为优良的亲和识别配基。利用硼酸对顺式二醇结构的特异性识别，制备硼酸修饰的h-mips，可以实现对核苷类物质的选择性识别及分离富集。并且，利用苯硼酸和核苷中顺式二醇结构的可逆作用，可以增强材料对特定核苷的选择性。同时，可以利用ph值控制吸附/解吸过程。
苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱制备过程中的粒径、分散性、比表面积及吸附效果的优化是使核苷类物质能有效地被材料富集并与基体溶液快速方便地分离的前提条件。另外，在移除mcm-48基质后，要在聚合物的表面形成一个单孔，从而制得中空分子印迹聚合物，要求中空分子印迹聚合物的大部分吸附位点都位于聚合物的内外表面上，这一特点有利于提高聚合物的质量转移速率同时也将提高聚合物的吸附容量。因此，上述合成条件的控制是本专利拟解决的关键技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种苯硼酸修饰的中空分子印迹聚合物，包含该聚合物的固相萃取柱的制备和使用方法，与高效液相色谱检测方法结合，可实现对药品中含有顺式二醇结构的核苷类物质(胞苷、鸟苷、尿苷及肌苷)含量的同时检测。
具体的，本发明提供的苯硼酸修饰的中空分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
s1：以3-氨基苯硼酸为修饰剂，对甲基丙烯酸单体进行化学修饰，使得甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构，所述甲基丙烯酸单体和3-氨基苯硼酸的物质的量比1：1～3；
具体反应过程如式(1)所示；
s2：以介孔分子筛mcm-48为基质，具有顺式二醇结构的尿苷为模板，s1制得的表面修饰有苯硼酸结构的甲基丙烯酸作为功能单体，加入交联剂和引发剂制备分子印迹材料，对制得的分子印迹材料进行洗脱模板，并采用氢氟酸腐蚀掉基质介孔分子筛mcm-48，制得中空分子印迹聚合物；
其中，模板、功能单体、交联剂、引发剂的物质的量之比为：2.5～4：10：40～100：0.6～5，每1g基质中添加的功能单体为1.5～5mmol。
具体反应过程如式(2)所示；
优选地，所述介孔分子筛mcm-48是以正硅酸乙酯为硅源，以十六烷基三甲基溴化胺为活性剂，采用水热合成法合成得到的；
具体反应过程如式(3)所示；
优选地，所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
优选地，s1的具体过程为：将甲基丙烯酸单体与3-氨基苯硼酸按照物质的量比为1:1～3的比例混合，溶解于乙腈中，室温下搅拌12～18h，得到表面修饰有苯硼酸结构的甲基丙烯酸。
更优选地，s2的具体过程为：向表面修饰有苯硼酸结构的甲基丙烯酸中加入模板尿苷，静置4～6h；依次加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和引发剂偶氮二异丁腈，使模板、功能单体、交联剂和引发剂的物质的量之比为：2.5～4：10：40～100：0.6～5，通n210～30min，40～80℃下搅拌1～2h；之后，向体系中加入介孔分子筛mcm-48，超声15～30min，通n2密封，在40～70℃下搅拌2h，65～80℃下搅拌18～20h，80～100℃下搅拌6～8h，制得聚合物微球；
将制备得到的聚合物微球抽滤乙醇洗涤后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蚀10h，过滤洗涤后，将聚合物微球置于索式提取器中，用甲醇/乙酸混合溶剂洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印迹聚合物；
所述甲醇/乙酸混合溶剂中甲醇与乙酸的体积比为10-x：x，x选自1～3之间的任意数值。
优选地，本发明还提供了一种苯硼酸修饰的中空分子印迹聚合物，具体由上述任一所述的制备方法制得。
优选地，本发明还提供了一种苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱，包括中空固相萃取柱，所述中空固相萃取柱内填充有填充层，所述填充层的底部和顶部均安装有筛板；所述填充层所填材料为上述苯硼酸修饰的中空分子印迹聚合物。
更优选地，本发明还提供了该苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱与高效液相色谱检测方法结合，在药品中检测含有顺式二醇结构的核苷类物质含量的应用。
更优选地，所述核苷类物质为胞苷、鸟苷、尿苷或肌苷。
更优选地，苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱与高效液相色谱检测方法结合，检测药品中含有顺式二醇结构的核苷类物质含量的具体步骤如下：
将所述苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用溶剂甲醇和水在负压状态下活化小柱，之后抽干溶剂，备用；
将待检测的样品溶液在负压状态下连续通过所述苯硼酸修饰的中空分子印迹固相萃取柱，抽干样品溶液；
用正已烷做淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；
采用1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶剂做洗脱剂在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂，所述1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶剂中，1～5％三氟乙酸和乙腈的体积比为10-y：y，y选自1～5之间的任意数值；
将洗脱液过滤后进入高效液相色谱仪进行检测，测定药品中含有顺式二醇结构的核苷类物质含量。
本发明提供的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱对核苷类物质具有明显的富集效果，主要是由于分子印迹对模板分子及结构类似物的选择性吸附、并且中空分子印迹的大部分结合位点分布在载体基质材料表面及中空腔内，提高了吸附效率，此外，硼酸基团对含有顺式二醇结构的核苷类物质能实现可逆的吸附和解离。这种ph开关的特性使硼酸成为优良的亲和识别配体。以上三种效果的共同作用，使得固相萃取柱具有明显的吸附效果。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的载体基质mcm-48及制备得到的硼亲和的中空分子印迹聚合物的扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
需要说明的是，以下实施例中所用到的试剂若无特别说明，均为常规试剂，可在市场上购买得到，所涉及的相关化合物的制备方法或检测方法，若无特别说明，均为常规方法。
实施例1
一种硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的制备
分别称取1.00mmol的单体甲基丙烯酸和1.00mmol的3-氨基苯硼酸，将二者混合均匀，之后溶解于40ml乙腈中，室温下搅拌12h，得到甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构；
向上述苯硼酸结构中加入模板尿苷，添加量为0.25mmol，0℃下静置4h；加入5.00mmol的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引发剂偶氮二异丁腈0.457mmol，通n210min，40℃下搅拌1h；之后，向体系中加入200mg的介孔分子筛mcm-48，超声15min，通n2密封，在40℃下搅拌2h，65℃下搅拌18h，80℃下搅拌6h，制得聚合物微球；
将上述制备得到的聚合物微球抽滤乙醇洗涤后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蚀6h，过滤洗涤后，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为9:1的甲醇/乙酸混合溶剂洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印迹聚合物，该中空分子印迹聚合物的扫描电镜图如图1所示；
称取200mg上述中空分子印迹聚合物材料，填充至5ml底部装有筛板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，完成。
上述制备得到的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的应用
以银杏达莫注射液作为实际样品，进行实际样品的富集和净化，具体的步骤为，精密量取实际样品2ml，置50ml容量瓶中，加流动相稀释至50ml刻度，摇匀，取适量溶液至具塞离心管中，于4000r·min-1条件下离心10min后，过滤，取滤液，并将此滤液作为实际样品上样溶液；
将硼亲和的中空分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用3ml甲醇，3ml水在负压状态下活化，并抽干活化溶剂；
将上述实际样品上样溶液2ml在负压状态下连续通过固相萃取柱，使实际样品中的核苷类成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上样溶液；再以3ml正已烷做淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；以0.5ml体积比为7:3的5％三氟乙酸/乙腈的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；将洗脱液过滤后进高效液相色谱检测。
对比例1
一种硼亲和中空非分子印迹固相萃取柱的制备，其制备方法和实施例1相同，不同之处仅在于，在反应的过程中不加入模板分子尿苷。
对比例2
以银杏达莫注射液作为实际样品，直接采用高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例1相同。
对比例3
以银杏达莫注射液作为实际样品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18结合高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例1相同。
实施例2
一种硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的制备
分别称取1.00mmol的单体甲基丙烯酸和2.00mmol的3-氨基苯硼酸，将二者混合均匀，之后溶解于50ml乙腈中，室温下搅拌16h，得到甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构；
向上述苯硼酸结构中加入模板尿苷，添加量为0.4mmol，20℃下静置4h；加入4mmol的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引发剂偶氮二异丁腈0.061mmol，通n220min，60℃下搅拌2h；之后，向体系中加入400mg的介孔分子筛mcm-48，超声20min，通n2密封，在60℃下搅拌3h，80℃下搅拌20h，100℃下搅拌6h，制得聚合物微球；
将上述制备得到的聚合物微球抽滤乙醇洗涤后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蚀10h，过滤洗涤后，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为8:2的甲醇/乙酸混合溶剂洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印迹聚合物；
称取200mg上述中空分子印迹聚合物材料，填充至5ml底部装有筛板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。
上述制备得到的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的应用
以香丹注射液作为实际样品，进行实际样品的富集和净化，具体的步骤为，精密量取实际样品5ml，置50ml容量瓶中，加流动相稀释至50ml刻度，摇匀，取适量溶液至具塞离心管中，于4000r·min-1条件下离心20min后，过滤，取滤液，并将此滤液作为实际样品上样溶液；
将硼亲和的中空分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用3ml乙腈，3ml水在负压状态下活化，并抽干活化溶剂；
将上述上样溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，使实际样品中的核苷类成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上样溶液；再以5ml丙酮做淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；以1.0ml体积比为6:4的2％三氟乙酸/乙腈的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；将洗脱液过滤后进高效液相检测。
对比例4
一种硼亲和中空非分子印迹固相萃取柱的制备，其制备方法和实施例2相同，不同之处仅在于，在反应的过程中不加入模板分子尿苷。
对比例5
以香丹注射液作为实际样品，直接采用高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例2相同。
对比例6
以香丹注射液作为实际样品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18结合高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例2相同。
实施例3
一种硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的制备
分别称取1.00mmol的单体甲基丙烯酸和3.00mmol的3-氨基苯硼酸，将二者混合均匀，之后溶解于60ml乙腈中，室温下搅拌18h，得到甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构；
向上述苯硼酸结构中加入模板尿苷，添加量为0.25mmol，30℃下静置6h；加入10mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引发剂偶氮二异丁腈0.12mmol，通n230min，80℃下搅拌1h；之后，向体系中加入600mg的介孔分子筛mcm-48，超声30min，通n2密封，在70℃下搅拌4h，80℃下搅拌20h，90℃下搅拌8h，制得聚合物微球；
将上述制备得到的聚合物微球抽滤乙醇洗涤后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蚀10h，过滤洗涤后，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为7:3的甲醇/乙酸混合溶剂洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印迹聚合物；
称取200mg上述中空分子印迹聚合物材料，填充至5ml底部装有筛板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。
上述制备得到的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱的应用
以红花口服液作为实际样品，进行实际样品的富集和净化，具体的步骤为，精密量取实际样品2ml，置50ml容量瓶中，加流动相稀释至50ml刻度，摇匀，取适量溶液至具塞离心管中，于4000r·min-1条件下离心30min后，过滤，取滤液；
将硼亲和的中空分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用5ml乙腈，5ml水在负压状态下活化，并抽干活化溶剂；
将上述滤液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂；再以1ml正丁烷做淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；以1.0ml体积比为5:5的1％三氟乙酸/乙腈的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；将洗脱液过滤后进高效液相检测。
对比例7
一种硼亲和中空非分子印迹固相萃取柱的制备，其制备方法和实施例3相同，不同之处仅在于，在反应的过程中不加入模板分子尿苷。
对比例8
以红花口服液作为实际样品，直接采用高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例3相同。
对比例9
以红花口服液作为实际样品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18结合高效液相色谱对药品中的核苷类物质进行检测，其具体分析方法和实施例3相同。
上述实施例1-3所得的检测溶液，以及对比例1-9的检测溶液的液相检测条件均为：色谱柱：diamonsilc18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：水-甲醇(v:v＝90∶10)；流速：0.9ml·min-1；检测波长：260nm；柱温：30℃；进样量：10μl。所得的液相色谱分析结果见下表1所示。
表1各实施例液相色谱分析结果
本发明实施例1-3提供的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱与对比例中空非分子印迹固相萃取柱、商品化固相萃取柱uf-c18对核苷类物质的吸附效果进行比较，结果表明，本发明提供的硼亲和中空分子印迹固相萃取柱对核苷类物质具有明显的富集效果，主要是由于分子印迹对模板分子及结构类似物的选择性吸附、并且中空分子印迹的大部分结合位点分布在载体基质材料表面及中空腔内，提高了吸附效率，此外硼酸基团对含有顺式二醇结构的核苷类物质能实现可逆的吸附和解离。这种ph开关的特性使硼酸成为优良的亲和识别配体。以上三种效果共同作用，使得本发明合成的h-mips固相萃取柱具有明显的吸附效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。