本发明涉及多糖提取领域，尤其涉及一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法。
背景技术：
柑橘皮又称陈皮，是芸香料植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，其味苦、辛，性温，有理气健脾和燥湿化痰等作用，资料显示，柑橘皮中果胶多糖含量可达10% ～ 30%。多糖是指10 个以上单糖分子通过糖苷键连接的高分子聚合物，可以包括几百甚至几千个单糖分子，在多糖结构中除单糖外，有时还含糖醛酸、氨基糖和糖醇等。多糖广泛存在于自然界中的动物、植物、微生物和海洋生物等机体内，既是生物体的贮能物质，也是生物体的结构物质，参与多种重要的生命活动。自1950 年以来，科技工作者相继从真菌、高等植物及动物中分离提取出300 余种多糖，并对其进行了一系列生物活性及临床应用的研究。研究表明，多糖除了具有抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等作用外，还有免疫调节与抗肿瘤的生物学功效，且对机体的毒副作用小。因此提取多糖并纯化制备高纯度的多糖对于开发生物活性产品具有十分重要的意义。
目前，对柑橘皮的研究主要集中于黄酮类和挥发油成分，对柑橘皮多糖的研究较少。中国专利CN 101850010 A公开了一种柑橘皮活性提取物及其提取工艺和应用，较传统的提取实验优化方法往往使用提取产率或提取物的成分含量作为评价指标而言，此发明通过提取物的体外抗氧化能力结合提取产率作综合评价指标，使提取物的功效稳定性更好。但不足的是，此发明柑橘皮活性提取物含有大量蛋白质、色素以及其他小分子杂质，产品纯度低，并且此发明柑橘皮活性提取物主要是柑橘类黄酮物质和果胶多糖的混合物，并没有公开从柑橘皮单独提取及纯化多糖的技术方案。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明中提供一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，通过简单高效的实验方法从柑橘皮得到高纯度的多糖，制得的多糖具有一定的抗氧化活性，且产品纯度高、能耗低，高纯度的多糖在医药、保健品、食品等领域具有巨大的应用价值。
本发明的技术方案如下：
一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，包括以下步骤：
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水，室温下静置，在微波设备中处理2～3h，然后置于恒温水浴槽内，加热回流提取，滤渣反复提取，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩，加入无水乙醇密封，静置，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
将多糖粗品置于烧杯中，用蒸馏水溶解，加入活性炭，水浴锅中搅拌30～45 min后过滤，重复脱色，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液，加入氯仿溶液，混合均匀后再加入正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡20～30 min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3～5次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖样品。
所述一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，所述步骤1）中柑橘皮粉末与蒸馏水的质量比为1: 1～1：2，微波设备的功率设定为700～1000W，加热回流时间为1～2h，温度为78~85℃，滤渣反复提取次数为2次，提取时间分别为3～4h和1～2h，浓缩至原体积的1 /3～1/5，加入无水乙醇的体积为浓缩液体积的3～5倍。
所述一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，所述步骤2）A中活性炭与多糖粗品的质量比为1: 10～1: 20，水浴搅拌的温度为70~80℃，重复脱色次数为2～3次。
所述一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，所述步骤2）B中氯仿溶液与多糖水溶液的体积比为1: 10～1：15，正丁醇溶液与多糖水溶液的体积比为1: 20～1：30，干燥时间为1～2h。
所述一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，所述所述步骤2）B中加入氯仿后调节溶液的酸性值PH在5~6之间。
所述一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，所述所述步骤2）A中在水浴锅中搅拌30～45 min后再加入质量为活性炭0.5~0.7倍的生姜片。
高纯度的多糖在医药、保健品、食品等领域具有巨大的应用价值，而在纯化多糖的技术领域中，并没有任何现有技术能将多糖高度纯化，影响多糖纯度的主要因素为色素含量和蛋白质含量，因此本发明人通过对多糖纯化方法的研究，发现在多糖的脱色过程中，仅仅加入活性炭脱色得到的多糖仍含有少量色素，脱色效果不理想，于是经过发明人大量实验验证，在如何不影响多糖纯度以及有效除去色素的条件下，加入活性炭以及生姜片采用物理吸附可以达到最优的实验效果。在除去蛋白质的过程中，发明人发现在多糖水溶液中加入氯仿溶液，并调节溶液的PH在5～6之间，通过加入氯仿溶液且调节溶液呈弱酸性这一步骤，可以使溶液离心非常彻底，进而能高效的除去多糖中的蛋白质。 因此，发明人在反应步骤2）A中加入一定质量的生姜片以及在步骤2）B中加入氯仿并调节溶液的PH在5~6之间来实现上述技术效果。
有益效果：本发明中提供一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，通过简单高效的实验方法从柑橘皮得到高纯度的多糖，制得的多糖具有一定的抗氧化活性，且产品纯度高、能耗低，高纯度的多糖在医药、保健品、食品等领域具有巨大的应用价值。
具体实施方式
本发明提供了一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种从柑橘皮中提取及纯化多糖的方法，其中，包括以下步骤：
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水，室温下静置，在微波设备中处理2～3h，然后置于恒温水浴槽内，加热回流提取，滤渣反复提取，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩，加入无水乙醇密封，静置，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
将多糖粗品置于烧杯中，用蒸馏水溶解，加入活性炭，水浴锅中搅拌30～45 min后过滤，重复脱色，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液，加入氯仿溶液，混合均匀后再加入正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡20～30 min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3～5次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖样品。
在实际应用中，步骤1）中柑橘皮粉末与蒸馏水的质量比为1: 1～1：2，微波设备的功率设定为700～1000W，加热回流时间为1～2h，温度为78~85℃，滤渣反复提取次数为2次，提取时间分别为3～4h和1～2h，浓缩至原体积的1 /3～1/5，加入无水乙醇的体积为浓缩液体积的3～5倍。
在实际应用中，步骤2）A中活性炭与多糖粗品的质量比为1:10～1：20，水浴搅拌的温度为70~80℃，重复脱色次数为2～3次。
在实际应用中，步骤2）B中氯仿溶液与多糖水溶液的体积比为1: 10～1：15，正丁醇溶液与多糖水溶液的体积比为1: 20～1：30，干燥时间为1～2h。
在实际应用中，所述步骤2）B中加入氯仿后调节溶液的酸性值PH在5～6之间。
在实际应用中，所述所述步骤2）A中在水浴锅中搅拌30～45 min后再加入质量为活性炭0.5~0.7倍的生姜片。
以下通过具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取100g柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水100ml，室温下静置12h，在功率设定为900W的微波设备中处理3h，然后置于温度设置为78℃恒温水浴槽内，加热回流2h提取，滤渣反复提取2次，提取时间分别为3h和1h，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩至原体积的1 /3，加入为浓缩液体积的3倍无水乙醇密封，静置12h，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
称取多糖粗品20g置于烧杯中，用50ml蒸馏水溶解，加入1.8g活性炭，在78℃的水浴锅中搅拌45 min后过滤，重复脱色2次，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液30ml，加入氯仿溶液2ml，调节溶液PH值为5.7，混合均匀后再加1.2ml正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡30 min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖，多糖纯度为93%。
本实施例为最优选实施例。
实施例2
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取100g柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水150ml，室温下静置12h，在功率设定为800W的微波设备中处理2h，然后置于温度设置为80℃恒温水浴槽内，加热回流1h提取，滤渣反复提取2次，提取时间分别为4h和1h，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩至原体积的1 /4，加入为浓缩液体积的4倍无水乙醇密封，静置12h，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
称取多糖粗品20g置于烧杯中，用50ml蒸馏水溶解，加入2g活性炭，在80℃的水浴锅中搅拌40 min后过滤，重复脱色3次，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液30ml，加入氯仿溶液3ml，调节溶液PH值为5，混合均匀后再加1.5ml正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡20min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖，多糖纯度为87%。
实施例3
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取100g柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水120ml，室温下静置12h，在功率设定为1000W的微波设备中处理2.5h，然后置于温度设置为85℃恒温水浴槽内，加热回流2h提取，滤渣反复提取2次，提取时间分别为4h和2h，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩至原体积的1 /5，加入为浓缩液体积的5倍无水乙醇密封，静置12h，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
称取多糖粗品20g置于烧杯中，用50ml蒸馏水溶解，加入1.5g活性炭，在85℃的水浴锅中搅拌30 min后过滤，重复脱色2次，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液30ml，加入氯仿溶液2.5ml，调节溶液PH值为6，混合均匀后再加1.2ml正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡25 min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖，多糖纯度为83%。
实施例4
1）、柑橘皮多糖粗品的制备
将柑橘皮粉碎，称取100g柑橘皮粉末于蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水80ml，室温下静置12h，在功率设定为900W的微波设备中处理3h，然后置于温度设置为78℃恒温水浴槽内，加热回流2h提取，滤渣反复提取2次，提取时间分别为3h和1h，提取液合并，用旋转蒸发器浓缩至原体积的1 /3，加入为浓缩液体积的3倍无水乙醇密封，静置12h，经抽滤后得多糖粗品；
2）、柑橘皮多糖粗品的提纯
A、活性炭脱色
称取多糖粗品20g置于烧杯中，用50ml蒸馏水溶解，加入1.8g活性炭，在78℃的水浴锅中搅拌45 min后过滤，重复脱色2次，得脱色后的多糖粗品溶液；
B、Sevag 法脱蛋白
取A中多糖水溶液30ml，加入氯仿溶液2ml，调节溶液PH值为5.7，混合均匀后再加1.3ml正丁醇溶液，将混合物剧烈振荡30 min，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白，重复3次，将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得高纯度多糖，多糖纯度为90%。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。