血管平滑肌细胞的培养方法与流程

本发明涉及血管平滑肌细胞的培养技术。

背景技术：

构成血管的血管内皮细胞及血管平滑肌细胞(以下称为血管细胞)常常作为原代培养细胞而被用于体外(invitro)试验，几乎不存在已确立的细胞株。原代培养血管细胞与确立的细胞不同，残留了较多的生物体内血管细胞本来的性质，另一方面，报道了若进行传代培养、冷冻保存则容易发生形态性质变化的性质。尤其是，对于血管平滑肌细胞而言，若进行利用通常的培养板的培养(单层培养：二维培养)，则会导致增殖、收缩能力下降等形态性质的变化。作为避免这样的形态性质变化的措施，开发了以下的3种方法。(1)在i型胶原凝胶上的培养。能在使增殖停止的状态下培养血管平滑肌细胞(非专利文献1)。(2)使用了以i型胶原蛋白为主成分的三维基体的培养(非专利文献2)。这种情况下，细胞增殖停止，血管平滑肌细胞本来的收缩能力恢复。(3)血管内皮细胞的培养通常通过明胶包被(gelatincoat)而进行。

然而，各培养方法存在各自的问题。(1)的方法存在不适于长期培养的问题。因此，在培养第3～5天，需要将胶原凝胶溶解从而将血管平滑肌细胞分离。若不进行分离而保持原状态进行培养，则细胞会开始增殖，从而变得等同于通常的二维培养。因此，无法维持与生物体相近的性质。(2)的使用了i型胶原蛋白三维基体的培养存在下述问题：到血管平滑肌细胞具有与生物体相近的性质为止需要约1周左右。此外，不能在经过培养的状态下进行保存，因此难以进行临床应用。(3)的使用了明胶包被的培养与通常的二维培养法没有太大区别。

如上所述，当前实施的血管细胞的培养技术中，由于无法避免细胞的形态性质变化(二维培养法)、长期培养的困难性、烦杂性(三维培养法)，因而在利用血管细胞的评价方法的开发、血管细胞运输方法、血管细胞的生物体移植等方面有较大限制。此外，即使通过利用抑制细胞粘附的材料涂覆培养容器表面、或对培养容器表面实施特殊的加工来抑制细胞粘附并培养血管平滑肌细胞，其存活率也快速下降。因此，期望开发下述培养方法：在将培养基材对血管细胞的刺激抑制在最小限度的同时，可实现能简便地进行药剂等的评价的培养环境、细胞不容易发生形态性质变化从而便于细胞回收及细胞运输的非冷冻环境。

本申请的发明人已成功开发了能在不实质性地提高液体培养基中的粘度的情况下、维持悬浮状态而对细胞、组织进行培养的培养基组合物(专利文献1及2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：wo2014/017513a1

专利文献2：us2014/0106348a1

非专利文献

非专利文献1：koyama等,cell1996；87:1069-78

非专利文献2：ishii等,atherosclerosis2001；158:377-84

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供一种在不使血管平滑肌细胞增殖的情况下、在避免形态性质变化的同时进行长期培养的技术。

用于解决课题的手段

本申请的发明人已经发现，在能在不实质地提高液体培养基中的粘度的情况下、维持悬浮状态而对细胞、组织进行培养的培养基的组合物中悬浮培养癌细胞等时，与在培养板上进行粘附培养的情况相比，可促进细胞增殖(专利文献1)；但是，在能维持悬浮状态而对细胞、组织进行培养的培养基组合物中悬浮培养血管平滑肌细胞时，意外地发现，细胞周期反而在维持良好的存活性的状态下中止，细胞增殖被抑制，从而能在避免形态性质变化的风险的同时长期维持。

基于这样的见解而进一步进行研究，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

[1]血管平滑肌细胞的培养方法，所述方法包括下述步骤：在含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞。

[2]如[1]所述的方法，其中，悬浮培养处于已停止细胞增殖的状态的血管平滑肌细胞。

[3]抑制血管平滑肌细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括下述步骤：在含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞。

[4]如血管平滑肌细胞的保存方法，所述方法包括下述步骤：使血管平滑肌细胞悬浮于含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述结构体包含脱酰基结冷胶。

[6]如[5]所述的方法，其中，培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.005～0.3％(w/v)。

[7]血管平滑肌细胞的培养方法，所述方法包括下述步骤：能使细胞或组织悬浮而进行培养的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞，所述培养基组合物以0.005～0.3％(w/v)的浓度包含脱酰基结冷胶。

[8]血管平滑肌细胞的保存方法，所述方法包括下述步骤：使血管平滑肌细胞悬浮于能使细胞或组织悬浮而进行培养的培养基组合物中，所述培养基组合物以0.005～0.3％(w/v)的浓度包含脱酰基结冷胶。

发明的效果

通过本发明，能在细胞增殖被抑制的状态下，在体外(invitro)长期维持血管平滑肌细胞。通过本发明，可期待能在无需冷冻操作的条件下运输血管平滑肌细胞，并且使在冷冻、粘附中所观察到的细胞的形态性质变化为最小限度。本发明有助于利用血管平滑肌细胞的再生医疗的发展。

附图说明

[图1]基于western印迹法(westernblotting)的、血管平滑肌细胞中的细胞周期相关蛋白表达的分析。

[图2]基于western印迹法的、血管平滑肌细胞中的细胞周期相关蛋白表达的分析。

[图3]基于western印迹法的、nih3t3细胞中的细胞周期相关蛋白表达的分析。

[图4]基于western印迹法的、血管平滑肌细胞中的细胞周期相关蛋白表达的分析。

[图5]基于western印迹法的、nih3t3细胞中的细胞周期相关蛋白表达的分析。

[图6]血管平滑肌细胞的增殖及存活率的经时变化。a：总细胞数，b：存活率。白圆：将在培养板上进行了粘附培养而得到的细胞接种于培养板上，进一步进行粘附培养。黑圆：将在含有脱酰基结冷胶的培养基中进行了悬浮培养而得到的细胞接种于培养板上，进行粘附培养。

具体实施方式

(1)本发明中使用的培养基组合物

本发明中使用的培养基组合物是含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物。该培养基组合物可在维持悬浮的状态下而培养作为培养对象的细胞(即，血管平滑肌细胞)或包含其的组织。该培养基组合物可按照wo2014/017513a1及us2014/0106348a1中的记载来制备。以下，有时将该培养基组合物称为培养基组合物i。

细胞是构成动物的最基本的单位，作为其要素，在细胞膜的内部具有细胞质和各种细胞器。

本发明中所谓的细胞及/或组织的悬浮，是指细胞及/或组织不粘附于培养容器的状态(非粘附)。此外，本发明中，将下述状态称为“悬浮静置”：在使细胞及/或组织增殖、分化或维持时，不伴有从外部向液体培养基组合物施加的压力、振动、或在该组合物中的振荡、旋转操作等，使细胞及/或组织在该液体培养基组合物中均匀分散、进而成为悬浮状态；将在该状态下培养细胞及/或组织的操作称为“悬浮静置培养”。另外，作为“悬浮静置”中可进行悬浮的时间，包括5分钟以上、1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上等，只要保持悬浮状态即可，不限于这些时间。

本发明中使用的培养基组合物能够于可进行细胞、组织的维持、培养的温度范围(例如，0～40℃)中的至少1点进行细胞及/或组织的悬浮静置。本发明中使用的培养基组合物能够于优选为25～37℃的温度范围中的至少1点、最优选为37℃进行细胞及/或组织的悬浮静置。

对于是否能进行悬浮静置，可通过例如以下方法进行评价：使培养对象的细胞以2×10⁴个细胞/ml的浓度均匀分散于作为评价对象的培养基组合物中，向15ml锥形管中注入10ml，于37℃静置至少5分钟以上(例如，1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上)，观察该细胞是否维持悬浮状态。在全部细胞中的70％以上为悬浮状态的情况下，可作出维持了悬浮状态的结论。也可将细胞替换为聚苯乙烯珠(尺寸500-600μm，polysciencesinc.制)而进行评价。

本发明中使用的培养基组合物是含有能使细胞或组织悬浮而进行培养(优选能进行悬浮静置培养)的结构体和培养基的组合物。

对于本发明中使用的培养基组合物而言，优选的是，在培养时的培养基组合物的更换处理及培养结束后，能够从培养基组合物中回收细胞或组织，更优选的是，在从培养基组合物中回收细胞或组织时，无需温度变化、化学处理、酶处理、剪切力中的任一者。

本发明中的所谓结构体，是指由特定化合物形成的、呈现使细胞及/或组织均匀悬浮的效果的物质。更详细而言，包括高分子化合物介由离子进行聚集而形成的产物、或高分子化合物形成三维的网络而得到的产物等。另外，多糖类介由金属离子形成微凝胶是已知的(例如，日本特开2004-129596号公报)，本发明的结构体也包括该微凝胶作为一种方式。另外，作为高分子化合物介由离子进行聚集而形成的产物，可举出膜状的结构体作为一种方式。

对于本发明中的结构体的大小而言，在用过滤器进行过滤的情况下，通过孔径为0.2μm至200μm的过滤器的结构体是优选的。作为该孔径的下限，更优选大于1μm，从使细胞或组织稳定地悬浮的方面考虑，进一步优选大于5μm。作为该孔径的上限，更优选为100μm以下，从细胞或组织的大小考虑，进一步优选为70μm以下。

本发明中的特定化合物是指具有下述效果的化合物：在将特定化合物与液体培养基混合时，形成无定形的结构体，该结构体在该液体中均匀分散，在实质上不提高该液体的粘度的情况下，实质地保持细胞及/或组织，防止其沉降。“实质上不提高液体的粘度”是指液体的粘度不超过8mpa·s。此时的该液体的粘度(即，本发明中使用的培养基组合物的粘度)于37℃为8mpa·s以下，优选为4mpa·s以下，更优选为2mpa·s以下。此外，特定化合物的化学结构、分子量、物性等没有任何限制，只要呈现下述效果即可：在液体培养基中形成该结构体，在实质上不提高该液体的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀地悬浮(优选悬浮静置)。

包含结构体的液体的粘度可利用例如后述的实施例中记载的方法测定。具体而言，可在37℃条件下，使用e型粘度计(东机产业株式会社制，tv-22型粘度计，型号：tve-22l，锥形转子：标准转子1°34′×r24，转速为100rpm)进行测定。

作为本发明中使用的特定化合物的例子，没有特别限制，可举出高分子化合物，可优选举出具有阴离子性的官能团的高分子化合物。

作为阴离子性的官能团，可举出羧基、磺基、磷酸基及它们的盐，优选羧基或其盐。

本发明中使用的高分子化合物可使用具有选自前述阴离子性的官能团的组中的1种或2种以上的化合物。

作为本发明中使用的高分子化合物的优选的具体例，没有特别限制，可举出10个以上的单糖类(例如，丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合而成的多糖类，可更优选举出具有阴离子性的官能团的酸性多糖类。此处所谓的酸性多糖类，只要在其结构中有具有阴离子性的官能团即可，没有特别限制，例如，为具有糖醛酸(例如，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖类、在结构中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多糖类、或具有这两种结构的多糖类，不仅包括天然来源的多糖类，还包括由微生物生产的多糖类、通过基因工程而生产的多糖类、或使用酶人工合成的多糖类。更具体而言，可举出通过由透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶(以下有时也称为dag)、鼠李聚糖胶(rhamsangum)、迪特胶(diutangum)、黄原胶(xanthangum)、卡拉胶、汉生胶、己糖醛酸、岩藻依多糖(fucoidan)、果胶、果胶酸(pectinacid)、果胶酯酸(pectinicacid)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitinsulfate)、硫酸角质(keratosulfate)、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、硫酸皮肤素(dermatansulfate)、硫酸鼠李聚糖(rhamnansulfate)及它们的盐组成的组中的1种或2种以上构成的多糖类。多糖类优选为透明质酸、dag、迪特胶、黄原胶、卡拉胶或它们的盐，考虑到能通过低浓度的使用而使细胞或组织悬浮、且容易回收细胞或组织，最优选为dag。

此处所谓盐，例如，可举出锂、钠、钾这样的碱金属的盐、钙、钡、镁这样的碱土金属的盐或铝、锌、铜、铁、铵、有机碱及氨基酸等的盐。

这些高分子化合物(多糖类等)的重均分子量优选为10,000～50,000,000，更优选为100,000～20,000,000，进一步优选为1,000,000～10,000,000。例如，该分子量可利用凝胶渗透色谱法(gpc)并基于普鲁兰多糖(pullulan)换算来测定。

此外，dag也可使用经磷酸化的制品。该磷酸化可利用已知的方法进行。

本发明中，也可组合多种(优选2种)上述多糖类而使用。多糖类的组合的种类只要是能在液体培养基中形成上述的结构体，在实质上不提高该液体培养基的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀地悬浮(优选悬浮静置)的种类即可，没有特别限制，优选该组合至少包含dag或其盐。即，优选的多糖类的组合包括dag或其盐、及dag或其盐以外的多糖类(例如黄原胶、藻酸、卡拉胶、迪特胶、甲基纤维素、刺槐豆胶(locustbeangum)或它们的盐)。作为具体的多糖类的组合，可举出dag和鼠李聚糖胶、dag和迪特胶、dag和黄原胶、dag和卡拉胶、dag和汉生胶、dag和刺槐豆胶、dag和κ-卡拉胶、dag和藻酸钠、dag和甲基纤维素等，但不限于这些组合。

作为本发明中使用的特定化合物的进一步优选的具体例，可举出透明质酸、脱酰基结冷胶、迪特胶、卡拉胶及黄原胶、以及它们的盐，从能降低培养基组合物的粘度方面和细胞或组织的回收的容易性方面考虑，作为最优选的例子，可举出脱酰基结冷胶或其盐。

本发明中所谓的脱酰基结冷胶，是以1-3键合的葡萄糖、1-4键合的葡糖醛酸、1-4键合的葡萄糖及1-4键合的鼠李糖这4个分子的糖作为结构单元的直链状的高分子多糖类，并且是以下的通式(i)中，r1、r2均为氢原子、n为由2以上的整数表示的多糖类。其中，r1可包含甘油基，r2可包含乙酰基，乙酰基及甘油基的含量优选为10％以下，更优选为1％以下。

本发明中的结构体根据特定化合物而形成各种形态，对脱酰基结冷胶的情况进行记载，则脱酰基结冷胶与液体培养基混合时，其获取液体培养基中的金属离子(例如，钙离子)，形成介由该金属离子而得到的无定形的结构体，使细胞及/或组织悬浮。由脱酰基结冷胶制备的本发明中使用的培养基组合物的粘度为8mpa·s以下，优选为4mpa·s以下，从细胞或组织的回收的容易性方面考虑，更优选为2mpa·s以下。

[化学式1]

本发明中的特定化合物虽然也可利用化学合成方法得到，但该化合物为天然物的情况下，优选通过利用惯用技术，从含有该化合物的各种植物、各种动物、各种微生物中提取及分离纯化而得到。上述提取中，若利用水、超临界气体，则可高效地提取该化合物。例如，作为结冷胶的制造方法，用发酵培养基培养生产微生物，利用通常的纯化方法回收在菌体外生产的粘膜物，进行干燥、粉碎等工序后，形成粉末状即可。另外，在脱酰基结冷胶的情况下，在回收粘膜物时实施碱处理，将与1-3键合的葡萄糖残基键合的甘油基和乙酰基进行脱酰基化，然后回收即可。作为纯化方法，例如，可通过单独利用或以任意的顺序组合利用、或者反复利用液-液提取、分级沉淀、结晶化、各种离子交换色谱法、使用了sephadexlh-20等的凝胶过滤色谱法、利用基于活性炭、硅胶等的吸附色谱法或薄层色谱法进行的活性物质的吸附解吸处理、或使用了反相柱的高效液相色谱法等，从而将杂质除去而进行纯化。作为结冷胶的生产微生物的例子，可举出少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonaselodea)及对该微生物的基因进行了改造而得到的微生物，但不受其限制。

而且，在脱酰基结冷胶的情况下，可使用市售的脱酰基结冷胶，例如，可使用三晶株式会社制“kelcogel(cpkelco公司的注册商标)cg-la”、san-eigenf.f.i.,inc.制“kelcogel(cpkelco公司的注册商标)”等。另外，作为天然型结冷胶，可使用san-eigenf.f.i.,inc.制“kelcogel(cpkelco公司的注册商标)ht”等。

培养基中的特定化合物的浓度取决于特定化合物的种类，可在下述范围内适当设定：所述范围能够使特定化合物在液体培养基中形成上述的结构体，且在实质上不提高该液体培养基的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)；通常为0.0005％～1.0％(w/v)、优选为0.001％～0.4％(w/v)、更优选为0.005％～0.1％(w/v)、进一步优选为0.005％～0.05％(w/v)即可。例如，在脱酰基结冷胶的情况下，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、优选0.003％～0.5％(w/v)、更优选0.005％～0.3％(w/v)、进一步优选0.01％～0.05％(w/v)、最优选0.01％～0.03％(w/v)即可。在黄原胶的情况下，向培养基中添加0.001％～5.0％(w/v)、优选0.01％～1.0％(w/v)、更优选0.05％～0.5％(w/v)、最优选0.1％～0.2％(w/v)即可。在κ-卡拉胶及刺槐豆胶混合系的情况下，向培养基中添加0.001％～5.0％(w/v)、优选0.005％～1.0％(w/v)、更优选0.01％～0.1％(w/v)、最优选0.03％～0.05％(w/v)培养基即可。在天然型结冷胶的情况下，向培养基中添加0.05％～1.0％(w/v)、优选0.05％～0.1％(w/v)即可。

组合使用多种(优选2种)上述多糖类的情况下，该多糖类的浓度可在下述范围内适当设定：所述范围能够使该多糖类的组合在液体培养基中形成上述的结构体，且在实质上不提高该液体培养基的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)。例如，在使用dag或其盐、与dag或其盐以外的多糖类的组合的情况下，作为dag或其盐的浓度，可例示0.005～0.02％(w/v)、优选0.01～0.02％(w/v)，作为dag或其盐以外的多糖类的浓度，可例举0.0001～0.4％(w/v)、优选0.005～0.4％(w/v)、更优选0.1～0.4％(w/v)。作为具体的浓度范围的组合，可例示下述组合。

dag或其盐：0.005～0.02％(优选0.01～0.02％)(w/v)

dag以外的多糖类

黄原胶：0.1～0.4％(w/v)

藻酸钠：0.0001～0.4％(w/v)(优选0.1～0.4％(w/v))

天然结冷胶：0.0001～0.4％(w/v)

刺槐豆胶：0.1～0.4％(w/v)

甲基纤维素：0.1～0.4％(w/v)(优选0.2～0.4％(w/v))

卡拉胶：0.05～0.1％(w/v)

迪特胶：0.05～0.1％(w/v)

需要说明的是，该浓度可利用下式算出。

浓度[％(w/v)]＝特定化合物的重量(g)/培养基组合物的容量(ml)×100

前述化合物也可利用化学合成方法进一步转化成其他衍生物，这样地得到的该衍生物也可在本发明中有效地使用。具体而言，在脱酰基结冷胶的情况下，将相当于该通式(i)表示的化合物的r1及/或r2的羟基取代为c1-3烷氧基、c1-3烷基磺酰基、葡萄糖或果糖等单糖残基、蔗糖、乳糖等寡糖残基、甘氨酸、精氨酸等氨基酸残基等而成的衍生物也可用于本发明。另外，也可使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)等交联剂将该化合物交联。

本发明中使用的特定化合物或其盐可根据制造条件而能以任意的晶型的形式存在，并可以任意的水合物的形式存在，这些晶型、水合物及它们的混合物也被包含在本发明的范围内。另外，有时也以包含丙酮、乙醇、四氢呋喃等有机溶剂的溶剂合物的形式存在，这些形式均被包含在本发明的范围内。

本发明中可使用的特定化合物也可以以通过环内或环外异构化而生成的互变异构体、几何异构体、互变异构体或几何异构体的混合物、或它们的混合物的形式存在。对于本发明的化合物而言，不论是否通过异构化而产生，在具有手性中心的情况下，可以以经拆分的光学异构体或以任意的比率包含它们的混合物的形式存在。

本发明中使用的培养基组合物中，可存在金属离子、例如2价的金属离子(钙离子、镁离子、锌离子、铁离子及铜离子等)，优选含有钙离子。对于该金属离子而言，例如可以如钙离子和镁离子、钙离子和锌离子、钙离子和铁离子、钙离子和铜离子这样，组合2种以上而使用。本领域技术人员可适当确定其组合。在一种方式中，通过在培养基组合物中包含金属离子(例如钙离子)，从而高分子化合物介由该金属离子进行聚集，高分子化合物形成三维网络，由此，(例如，通过多糖类介由金属离子(例如钙离子)形成微凝胶)可形成本发明的结构体。金属离子的浓度可在下述范围内适当设定：所述范围能够使特定化合物在液体培养基中形成上述的结构体，且在实质上不提高该液体培养基的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)。金属离子浓度为0.1mm～300mm，优选为0.5mm～100mm，但不限于此。该金属离子可与培养基一同混合，或预先另行制备盐溶液，再添加至培养基中。另外，本发明中使用的培养基组合物中可包含后述的细胞外基质、粘附分子等。

在生物体外培养细胞及/或组织时，由本发明中使用的特定化合物构成的结构体呈现使该细胞及/或组织在含有该特定化合物的结构体的液体中悬浮的效果(优选使其悬浮静置的效果)。通过该悬浮效果，与单层培养相比，可增加特定单位体积的细胞数及/或组织数而进行培养。另外，在以往的悬浮培养方法中伴有旋转、振荡操作的情况下，作用于细胞及/或组织的剪切力产生作用，因此，存在细胞及/或组织的增殖率、回收率低、或者损害细胞的功能的情况，但通过使用含有本发明的特定化合物的结构体的培养基组合物，能在不进行振荡等操作的情况下使细胞及/或组织均匀分散，因此，能在不损失细胞功能的情况下，容易且大量地获得目标细胞及/或组织。另外，在以往的包含凝胶基材的培养基中悬浮培养细胞及/或组织时，难以进行细胞及/或组织的观察、回收，或者，在回收时存在损害其功能的情况，但通过使用含有本发明的特定化合物的结构体的培养基组合物，能够悬浮培养细胞及/或组织，在不损害其功能的情况下进行观察、回收。另外，对于以往的包含凝胶基材的培养基而言，粘度高，存在培养基的更换困难的情况，但含有本发明的特定化合物的结构体的培养基组合物由于为低粘度，因而能使用移液器、泵等容易地更换培养基。

使用本发明中的特定化合物培养细胞及/或组织时，可将培养细胞及/或组织时使用的培养基和特定化合物混合，而制备培养基组合物。对于这样的培养基而言，在基于组成的类别中，可举出天然培养基、半合成培养基、合成培养基，另外，在基于形状的类别中，可举出半固态培养基、液态培养基、粉末培养基(以下，有时也称为粉培养基)等。细胞及/或组织为动物来源时，只要是可用于动物细胞的培养的培养基，则均可使用。作为这样的培养基，例如，可举出dulbecco改良eagle培养基(dulbecco’smodifiedeagles’smedium；dmem)、hamf12培养基(ham’snutrientmixturef12)、dmem/f12培养基、mccoy5a培养基(mccoy’s5amedium)、eaglesmem培养基(eagles’sminimumessentialmedium；emem)、αmem培养基(alphamodifiedeagles’sminimumessentialmedium；αmem)、mem培养基(minimumessentialmedium)、rpmi1640培养基、iscove改良dulbecco培养基(iscove’smodifieddulbecco’smedium；imdm)、mcdb131培养基、williams培养基e、ipl41培养基、fischer’s培养基、stempro34(invitrogen公司制)、x-vivo10(cambrexcorporation制)、x-vivo15(cambrexcorporation制)、hpgm(cambrexcorporation制)、stemspanh3000(stemcelltechnologies公司制)、stemspansfem(stemcelltechnologies公司制)、stemlineii(sigmaaldrich公司制)、qbsf-60(qualitybiological公司制)、stemprohescsfm(invitrogen公司制)、essential8(注册商标)培养基(gibco公司制)、mtesr1或2培养基(stemcelltechnologies公司制)、reproff或reproff2(reprocell公司制)、psgrohesc/ipsc培养基(systembiosciences公司制)、nutristem(注册商标)培养基(biologicalindustries公司制)、csti-7培养基(细胞科学研究所公司制)、mesenprors培养基(gibco公司制)、mf-medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(东洋纺株式会社制)、sf-900ii(invitrogen公司制)、opti-pro(invitrogen公司制)等。

作为用于培养血管平滑肌细胞的培养基，可在上述培养基中包含细胞粘附因子。作为其例子，可举出基质胶、胶原凝胶、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白。也可组合2种以上这些细胞粘附因子而添加。另外，可在用于培养血管平滑肌细胞的培养基中进一步混合瓜尔豆胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素等增稠剂。

本领域技术人员可根据目的而自由地在上述的培养基中添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。在对动物来源的细胞及/或组织进行培养时，本领域技术人员也可根据目的而组合添加一种以上的其他化学成分或生物体成分。

作为可在动物来源的细胞及/或组织的培养基中添加的成分，可举出胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种增殖因子、各种胞外基质、各种细胞粘附分子等。

作为可在培养基中添加的抗生素的例子，可举出磺胺制剂、青霉素、苯氧乙基青霉素、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄西林、青霉素、阿莫西林、环己西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、andinocillin、头孢菌素及其衍生物、奥索利酸、氨氟沙星、替马沙星、萘啶酸、吡咯米酸、环丙沙星、西诺沙星、诺氟沙星、甲氟哌酸、rosaxacin、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、克拉维酸、β-溴青霉烷酸、β-氯青霉烷酸、6-乙酰基亚甲基-青霉烷酸、头孢噁唑、sultampicillin、adinocillin及舒巴坦的甲醛水合物酯(日文：ホルムアルデヒド·フードラートエステル，英文：formaldehydehydrateester)、三唑巴坦、氨曲南、sulfazethin、isosulfazethin、诺卡霉素、间羧基苯酚、苯基乙酰胺基磺酸甲酯、氯四环素、土霉素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素、以及米诺环素。

将本发明中的特定化合物添加至上述的培养基中的情况下，首先，在使用时用适当的溶剂将该特定化合物溶解或分散(将其作为培养基添加剂)。然后，以培养基中的特定化合物浓度成为下述浓度的方式，将该培养基添加剂添加至培养基中即可：如上文中详细说明的那样，能在实质上不提高该液体培养基的粘度的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)的浓度，例如0.0005％～1.0％(w/v)，优选0.001％～0.4％(w/v)，更优选0.005％～0.1％(w/v)，进一步优选0.005％～0.05％(w/v)。例如，在脱酰基结冷胶的情况下，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、优选0.003％～0.5％(w/v)、更优选0.005％～0.3％(w/v)、最优选0.01％～0.05％(w/v)即可。在黄原胶的情况下，向培养基中添加0.001％～5.0％(w/v)、优选0.01％～1.0％(w/v)、更优选0.05％～0.5％(w/v)、最优选0.1％～0.2％(w/v)即可。在κ-卡拉胶和刺槐豆胶混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～5.0％(w/v)、优选0.005％～1.0％(w/v)、更优选0.01％～0.1％、最优选0.03％～0.05％(w/v)即可。在脱酰基结冷胶和迪特胶的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.005％～0.01％(w/v)即可。在脱酰基结冷胶和甲基纤维素的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.005％～0.2％(w/v)即可。在脱酰基结冷胶和刺槐豆胶的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.01％～0.1％(w/v)即可。在脱酰基结冷胶和藻酸钠的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.01％～0.1％(w/v)即可。在脱酰基结冷胶和黄原胶的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.01％～0.1％(w/v)添加即可。在脱酰基结冷胶和κ-卡拉胶的混合类的情况下，以两种化合物的总和计，向培养基中添加0.001％～1.0％(w/v)、最优选0.01％～0.1％(w/v)即可。需要说明的是，该浓度可利用下式算出。

浓度[％(w/v)]＝特定化合物的重量(g)/培养基组合物的容量(ml)×100

此处，作为用于培养基添加剂的适当的溶剂的例子，可举出水、二甲基亚砜(dmso)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各种醇等水性溶剂，但不受它们的限制。此时，优选使特定化合物浓度为0.001％～5.0％(w/v)、优选0.01％～1.0％(w/v)、更优选0.1％～0.6％(w/v)。此时，也可进一步添加提高该特定化合物的效果、或者降低使用时的浓度这样的添加物。作为这样的添加剂的例子，可添加1种以上的瓜尔豆胶、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子胶、普鲁兰多糖等多糖类。另外，在培养该特定化合物时，也可在载体表面上固定化或载带于载体内部而使用。该特定化合物在提供时或保存时可以是任意的形状。该特定化合物可以以片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂之类的经制剂化的固体、在适当的溶剂以及溶解剂中溶解而得到的溶液或混悬液之类的液体、或结合于基板、单体的状态而得到。作为经制剂化时的添加物，可举出对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等赋形剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物不限于上述的物质，只要本领域技术人员能利用即可，可自由选择，。另外，本发明中的特定化合物可根据需要而实施灭菌处理。灭菌方法没有特别限制，例如，可举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。进行过滤器灭菌(以下，有时也称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质没有特别限制，例如，可举出玻璃纤维、尼龙、pes(聚醚砜)、亲水性pvdf(聚偏氟乙烯)、纤维素混合酯、纤维素乙酸酯、聚四氟乙烯等。过滤器的细孔的大小没有特别限制，优选为0.1μm～10μm，更优选为0.1μm～1μm，最优选为0.1μm～0.5μm。对于这些灭菌处理而言，特定化合物可以是固态，也可以是溶液的状态。

通过利用上述制备将特定化合物的溶液或分散液添加至液体培养基中，从而可在液体培养基中形成上述结构体，得到本发明中使用的培养基组合物。培养基中通常含有对于高分子化合物介由离子进行聚集、或高分子化合物形成三维的网络而言充分的浓度的金属离子(例如钙离子等2价金属离子)，因此，仅通过将本发明的特定化合物的溶液或分散液添加至液体培养基中，即可得到本发明中使用的培养基组合物。或者，也可将培养基添加至培养基添加剂(特定化合物的溶液或分散液)中。此外，本发明中使用的培养基组合物也可通过使特定化合物和培养基成分在水性溶剂(例如，包括离子交换水、超纯水等的水)中混合而制备。作为混合的方式，可举出下述方式：(1)将液体培养基和培养基添加剂(溶液)混合，(2)在液体培养基中混合上述高分子化合物(粉末等固体)，(3)在培养基添加剂(溶液)中混合粉末培养基，将(4)粉末培养基及上述高分子化合物(粉末等固体)与水性溶剂混合，等等；但不限于这些方式。为了防止本发明中使用的培养基组合物中的特定化合物的分布变得不均匀，优选(1)或(4)或(1)或(3)的方式。

在将特定化合物溶解于溶剂(例如水、液体培养基等水性溶剂)中、或将特定化合物及粉末培养基溶解于溶剂中时，为了促进溶解，优选对该混合液进行加热。作为进行加热的温度，例如，可举出80℃～130℃，优选可进行加热灭菌这样的100℃～125℃(例如121℃)。加热后，将得到的特定化合物的溶液冷却至室温。通过在该溶液中添加(例如，将该溶液添加至液体培养基中)上述的金属离子(例如钙离子等2价金属离子)，可形成由该特定化合物构成的上述结构体。或者，也可通过在将特定化合物溶解于含有上述的金属离子(例如钙离子等2价金属离子)的溶剂(例如水、液体培养基等水性溶剂)中时，进行加热(例如80℃～130℃，优选100℃～125℃(例如121℃))，将得到的溶液冷却至室温，从而形成由该特定化合物构成的上述结构体。

例举了本发明中使用的培养基组合物的制备方法，但本发明不受其限制。将特定化合物添加至离子交换水或超纯水中。而后，于可将该特定化合物溶解的温度(例如，60℃以上、80℃以上、90℃以上)进行搅拌，使其溶解，直至成为透明的状态。溶解后，一边搅拌，一边放置冷却，进行灭菌(例如，于121℃进行20分钟的高压釜灭菌)。恢复至室温后，一边搅拌(例如，均质搅拌机(homomixer)等)静置培养中使用的任意的培养基，一边向该培养基中添加前述灭菌后的水溶液，进行混合以使得与该培养基变得均匀。该水溶液与培养基的混合方法没有特别限制，例如，可举出吹吸(pippeting)等利用手动进行的混合、使用了磁力搅拌器、机械搅拌器、均质搅拌机、均化器(homogenizer)等设备的混合。另外，也可在混合后用过滤器对本发明中使用的培养基组合物进行过滤。进行过滤处理时使用的过滤器的细孔的大小为5μm～100μm，优选为5μm～70μm，更优选为10μm～70μm。

或者，通过将粉末培养基及上述高分子化合物(粉末等固体)与水性溶剂混合，于上述温度进行加热，从而制备本发明中使用的培养基组合物。

例如，在制备脱酰基结冷胶的情况下，以成为0.1％～1％(w/v)、优选0.2％～0.5％(w/v)、更优选0.3％～0.4％(w/v)的量，将脱酰基结冷胶添加至离子交换水或超纯水中。另外，在其他情况下，在制备脱酰基结冷胶的情况下，以成为0.1％～1％(w/v)、优选0.2％～0.8％(w/v)、更优选0.3％～0.6％(w/v)的量，将脱酰基结冷胶添加至离子交换水或超纯水中。

而且，通过例如于60℃以上、优选80℃以上、更优选90℃以上(例如80～130℃)(只要是能使前述脱酰基结冷胶溶解的温度即可)进行搅拌，从而使其溶解至成为透明的状态。溶解后，一边搅拌一边放置冷却，例如于121℃进行20分钟高压釜灭菌。恢复至室温后，例如，一边用均质搅拌机等对dmem/f12培养基进行搅拌，一边向该培养基中添加上述水溶液，使得成为所期望的最终浓度(例如，最浓度为0.015％的情况下，0.3％水溶液：培养基的比率为1：19)，使其均匀混合。该水溶液与培养基的混合方法没有特别限制，例如，可举出吹吸等利用手动进行的混合、使用了磁力搅拌器、机械搅拌器、均质搅拌机、均化器(homogenizer)等机器的混合。另外，也可在混合后用过滤器对本发明中使用的培养基组合物进行过滤。进行过滤处理时使用的过滤器的细孔的大小为5μm～100μm，优选为5μm～70μm，更优选为10μm～70μm。

以下记载本发明中使用的培养基组合物及其制造方法的优选方式。

本发明中使用的培养基组合物优选为下述培养基组合物，所述培养基组合物的特征在于，能使细胞或组织悬浮而进行培养，其粘度为8mpa·s以下(37℃条件下)，并且含有脱酰基结冷胶或其盐。在一种方式中，培养基组合物中的脱酰基结冷胶或其盐的浓度为0.005～0.3％(w/v)(优选为0.01～0.05％(w/v))。在一种方式中，该培养基组合物还含有脱酰基结冷胶或其盐以外的多糖类。在一种方式中，该培养基组合物中含有对于脱酰基结冷胶形成能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体而言充分的浓度的2价金属离子(例如钙离子)。该浓度例如为0.1mm～300mm，优选为0.5mm～100mm。

该培养基组合物可通过将脱酰基结冷胶或其盐与培养基混合而制造。在一种方式中，该培养基为液体培养基。在一种方式中，该液体培养基中含有对于脱酰基结冷胶形成能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体而言充分的浓度的2价金属离子(例如钙离子)。该浓度例如为0.1mm～300mm，优选为0.5mm～100mm。在一种方式中，将溶解或分散于溶剂中的脱酰基结冷胶或其盐、与培养基混合。在一种方式中，溶解或分散于溶剂中的脱酰基结冷胶或其盐为经灭菌的状态。在一种方式中，灭菌通过高压釜灭菌进行。在其他方式中，灭菌通过过滤灭菌进行。在一种方式中，过滤灭菌通过从0.1～0.5μm的过滤器通过而实施。

(2)血管平滑肌细胞的培养

本发明提供一种包括在培养基组合物i中悬浮培养血管平滑肌细胞的步骤的血管平滑肌细胞的体外(invitro)培养方法。通过在培养基组合物i中悬浮培养血管平滑肌细胞，能使细胞周期在维持良好的存活性的状态下中止，抑制细胞增殖，从而能在避免形态性质变化的风险的同时长期维持。本发明还包括：抑制这样的血管平滑肌细胞的细胞增殖的方法、抑制血管平滑肌细胞的形态性质变化的方法、及维持处于细胞增殖停止状态的血管平滑肌细胞的存活性的方法(抑制存活率下降的方法)

本发明中可使用的血管平滑肌细胞是哺乳动物的血管平滑肌细胞。作为哺乳动物，例如，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔等兔类、猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类、狗、猫等猫类、人、猴、猕猴、食蟹猕猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等。哺乳动物优选为啮齿类(小鼠等)、兔类或灵长类(人等)，优选为人。

本发明中使用的血管平滑肌细胞优选经过分离。“分离”是指，实施将目标成分、细胞以外的因子除去的操作，从而脱离天然存在的状态。“经分离的血管平滑肌细胞”的纯度(血管平滑肌细胞的细胞数在全部细胞中所占的百分率)通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。在一种方式中，本发明的培养方法中的培养物中，包含的血管平滑肌细胞的细胞数在全部细胞中所占的百分率通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。

血管平滑肌细胞例如可通过下述方式从生物体分离：从大动脉中仅将中膜剥离，铺展于培养板底面，进行1～2周培养，或用胶原酶、弹性蛋白酶处理血管中膜，从而将其从生物体分离。血管平滑肌细胞的分离方法记载于论文(may-jun等，1984；arteriosclerosis，4(3)：183-188，orekhov等，medbiol.1984；62(4)：255-259.)中，在该技术领域中是公知的。也可使用市售的血管平滑肌细胞。

在一种方式中，本发明中使用的血管平滑肌细胞是原代培养细胞。所谓原代培养细胞，是指从生物体中分离、进行传代操作之前的细胞。使用本发明的培养方法时，能在维持良好的存活性的状态下中止血管平滑肌细胞的细胞周期，抑制细胞增殖，从而能在避免形态性质变化的风险的同时长期维持，因此，可在维持生物体内的形态性质的状态下长期培养原代培养的血管平滑肌细胞。

在悬浮培养血管平滑肌细胞时，可使用通常用于培养细胞的培养皿、烧瓶、塑料袋、teflon(注册商标)袋、皿(dish)、有盖培养皿(petridish)、组织培养用皿、多用途培养皿(multi-dish)、微量培养板(microplate)、微孔板、多用途培养板(multiplate)、多孔板、腔室培养玻片(chamberslide)、细胞培养瓶、旋转瓶(spinnerflask)、管(tube)、盘(tray)、培养袋、滚瓶(rollerbottle)等培养容器进行培养。为了降低供于培养的血管平滑肌细胞的一部分粘附于培养容器，进行增殖，发生形态性质变化的风险，在一种方式中，本发明的培养方法中使用的培养容器为细胞非粘附性。作为细胞非粘附性的培养容器，可使用不对培养容器的表面进行以提高与细胞的粘附性为目的的人工处理(例如，利用细胞外基质等的涂覆处理)的培养容器、或对培养容器的表面以降低与细胞的粘附性为目的而进行人工处理的培养容器。

本领域技术人员可任意选择进行培养的血管平滑肌细胞的形态、状态。作为其优选的具体例，没有特别限制，可举出血管平滑肌细胞以单一细胞的状态在培养基组合物i中分散的状态、血管平滑肌细胞粘附于载体表面上的状态、血管平滑肌细胞包埋于载体内部的状态、多个血管平滑肌细胞聚集而形成细胞团(细胞球(sphere))的状态等。为了降低由于粘附于固相，而发生细胞增殖及形态性质变化的风险，血管平滑肌细胞优选在以单一细胞的状态在培养基组合物i中分散的状态、或多个细胞聚集而形成细胞团(细胞球)的状态下，在培养基组合物i中进行悬浮培养(优选悬浮静置培养)。即，优选不使用用于粘附、包埋血管平滑肌细胞的载体。这些状态中，对于形成了细胞团(细胞球)的状态而言，能重新构建接近于生物体内环境的细胞-细胞间相互作用及细胞结构体，在长期维持细胞功能的状态下进行培养，而且较容易进行细胞的回收，因而优选。

形成细胞团块(细胞球)的方法没有特别限制，本领域技术人员可适当选择。作为其例子，可举出：使用了具有细胞非粘附表面的培养容器的方法、悬滴(hangingdrop)法、旋转培养法、三维支架法、离心法、利用了基于电场、磁场的凝集的方法等。

也可使用培养组合物i，形成细胞球。例如，细胞球可通过以下方式制备：使已解离至单一细胞状态的目标血管平滑肌细胞在培养组合物i中均匀分散，静置3天～10天，进行悬浮培养。此处制备的细胞球可通过进行离心、过滤处理而回收。

在一种方式中，将已停止细胞增殖的血管平滑肌细胞供于培养。使用本发明的培养方法时，能在维持良好的存活性的状态下，以已停止细胞增殖的状态，长期维持血管平滑肌细胞。“已停止细胞增殖的状态”是指细胞的比增殖速率(div/day)为0.1以下、优选0.001以下、更优选0以下。已停止细胞增殖的血管平滑肌细胞的细胞周期通常中止于g0或g1期。在一种方式中，供于培养的血管平滑肌细胞的70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、更进一步优选99％以上的细胞周期中止于g0或g1期。中止于g0或g1期的细胞的比例可通过以下方式确定：用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚将细胞染色，利用流式细胞术分析细胞内dna量(cell，vol.87，pages1069-1078，1996)。

在一种方式中，将增殖中的血管平滑肌细胞供于培养。利用本发明的培养方法，培养增殖中的血管平滑肌细胞时，在维持良好的存活性的状态下抑制其增殖，细胞增殖停止。本发明还提供抑制这样的血管平滑肌细胞的细胞增殖的方法。“增殖中的状态”是指细胞的比增殖速率(div/day)高于0.1。

在培养血管平滑肌细胞时，向培养组合物i中添加另行制备的血管平滑肌细胞，进行混合以使其均匀分散即可。此时的混合方法没有特别限制，例如，可举出吹吸等利用手动进行的混合、使用了搅拌器(stirrer)、旋涡混合器(vortexmixer)、微量培养板混合器(microplatemixer)、振荡机等设备的混合。混合后，可在静置下培养得到的血管平滑肌细胞混悬液，根据需要，可对培养液进行旋转、振荡或搅拌。其转速和频率根据本领域技术人员的目的适当设定即可。另外，在静置培养期间，需要更换培养基组合物时，在通过进行离心、过滤处理而将血管平滑肌细胞和培养基组合物分离后，向细胞添加新鲜的培养基组合物即可。或者，通过进行离心、过滤处理，而适当地将血管平滑肌细胞浓缩后，向该浓缩液中添加新鲜的上述培养基组合物i即可。

在一种方式中，将从生物体分离的原代血管平滑肌细胞、或另行在体外(invitro)培养的血管平滑肌细胞(例如，经粘附培养的血管平滑肌细胞)分散至单一细胞、或接近于单一细胞的状态。血管平滑肌细胞的分散可使用适当的细胞解离液进行。作为细胞解离液，例如，可单独使用或适当组合使用edta；胰蛋白酶、胶原酶iv、金属蛋白酶等蛋白分解酶等。将经分散的血管平滑肌细胞混悬于培养基组合物i中，对其进行悬浮培养(优选悬浮静置培养)。培养物中，血管平滑肌细胞以单一细胞的状态、或以细胞球的状态，在培养基组合物i中悬浮。

对于培养物中的血管平滑肌细胞的浓度而言，只要能在细胞增殖被抑制的状态下维持血管平滑肌细胞，则没有特别限定，通常为3.0x10⁴～3.0x10⁶个细胞/ml，优选为1.0x10⁵～1.0x10⁶个细胞/ml，更优选为3.0x10⁵～5.0x10⁵个细胞/ml。

对于在培养基组合物i中培养血管平滑肌细胞的培养时间而言，只要能在细胞增殖被抑制的状态下维持血管平滑肌细胞，则没有特别限定，例如可以是12小时以上、24小时以上、48小时以上、70小时以上的培养。理论上，培养时间没有上限值，但如果在细胞增殖被抑制的状态下过于长期地培养血管平滑肌细胞，则可能导致存活率下降，因此，优选将培养时间限制为例如30天以下、优选14天以下、更优选211小时以下左右。使用本发明的方法，能在这样的长时间内，在细胞增殖被抑制的状态下，在体外(invitro)维持血管平滑肌细胞。

在一种方式中，在培养基组合物i中悬浮培养(优选静置悬浮培养)增殖中的血管平滑肌细胞，直至该细胞的细胞增殖停止。增殖中的血管平滑肌细胞停止细胞增殖为止所需要的时间通常为3小时以上，优选为12小时以上，更优选为24小时以上。

培养血管平滑肌细胞时的温度通常为25～39℃，优选为37℃。对于co2浓度而言，通常，在培养的气氛中，为4～10体积％，优选为5体积％。对于氧浓度而言，在培养的气氛中，为15～50体积％，优选为20体积％。

通过这样的培养操作，从而能在细胞增殖被抑制的状态下，在体外(invitro)长期维持血管平滑肌细胞。

(3)血管平滑肌细胞的保存或运输方法

本发明提供使用了上述培养基组合物i的、血管平滑肌细胞的保存方法及运输方法。本发明的保存或运输方法的特征在于，使血管平滑肌细胞悬浮于上述培养基组合物i中。本发明的保存或运输方法中，通过使用培养基组合物i，从而能在非冷冻条件下，以悬浮状态(优选以悬浮静置状态)保存或运输细胞或组织。

用于保存或运输的培养基组合物i中，除了包含上述(1)中记载的组成之外，在细胞的非冷冻状态下进行保存时，还可包含具有延长细胞寿命的效果的各种成分。作为该成分，可举出糖类(其中不包括多糖类)(例如单糖类、二糖类)、抗氧化剂(例如sod、维生素e或谷胱甘肽)、亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如edta)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、甘油等。

血管平滑肌细胞优选经过分离。在一种方式中，将原代培养的血管平滑肌细胞供于保存·运输。在一种方式中，将已停止细胞增殖的血管平滑肌细胞供于保存·运输。在一种方式中，供于保存·运输的血管平滑肌细胞的70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选99％以上的细胞周期中止于g0或g1期。在一种方式中，将增殖中的血管平滑肌细胞供于保存·运输。使用本发明的方法时，能在非冷冻条件下，以维持高存活性的状态，抑制血管平滑肌细胞的细胞增殖，维持停止细胞增殖的状态，因此，能在避免由于冷冻、细胞增殖而导致的形态性质变化的风险的同时，长期地保存或运输血管平滑肌细胞。

本发明的保存或运输方法中，将血管平滑肌细胞在分散于培养基组合物i中后，装入到可密封的容器中。作为该容器，可举出烧瓶、塑料袋、teflon(注册商标)袋、管(tube)、培养袋等，但不受它们的限制。为了避免在保存或运输中内容物泄漏、或被外界的细菌等污染，优选将装有血管平滑肌细胞分散于培养基组合物i而得到的分散物的容器密封。

对于保存或运输中的温度而言，只要能维持血管平滑肌细胞的存活即可，没有特别限制，通常为37℃以下。温度低时，虽然能避免保存或运输中的血管平滑肌细胞的存活性的下降，但为了不使血管平滑肌细胞冷冻，通常，于高于培养基组合物i的熔点的温度进行保存或运输。因此，可将保存或运输中的温度维持为通常-5～42℃、优选1～37℃、更优选4～32℃、进一步优选18～30℃。

为了能进行悬浮静置状态下的血管平滑肌细胞的保存或运输，保存或运输中的温度优选为培养基组合物i能使血管平滑肌细胞悬浮静置的温度。

对于保存或运输的期间而言，只要在能在培养基组合物i中将血管平滑肌细胞维持为存活状态的范围内，则没有特别限定，通常为12小时以上且10天以内，优选为1～8天，更优选为1～3天。优选在保存或运输期间，使细胞或组织在培养基组合物i中维持悬浮静置状态。

使用本发明的保存或运输方法时，可期待能在无需冷冻操作的条件运输血管平滑肌细胞、并且使确认为冷冻、增殖的血管平滑肌细胞的形态性质变化抑制为最小限度。

只要没有特别说明，则(3)项中的各术语的定义与上述(1)及(2)中记载的定义相同。

通过在本说明书中引用包括本说明书中记载的专利及专利申请说明书在内的全部出版物中的记载内容，从而将其以等同于全部公开的程度而并入本说明书中。

[实施例]

以下，通过具体地记载本发明中使用的培养基组合物的分析例、试验例作为实施例，而进一步详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

[试验例1]

血管平滑肌细胞及nih3t3细胞的存活维持试验

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对得到的脱酰基结冷胶水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该溶液，制备含有最终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，得到培养基组合物。接着，将兔血管平滑肌细胞(由千叶大学药学研究院病院药学研究室制备)及小鼠成纤维细胞株nih3t3(atcc制)添加至上述的培养基组合物，使其成为1.0×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种5ml。需要说明的是，作为阴性对照，将兔血管平滑肌细胞或nih3t3细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem中，分注得到的混悬液。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内静置，由此，在静置状态下悬浮培养细胞最长211小时。向培养12小时、24小时、36小时、48小时、70小时、115小时及211小时后的培养物中，添加台盼蓝试剂(lifetechnologies公司制)，在显微镜下计数活细胞数及总细胞数。由总细胞数和活细胞数计算存活率。

结果，对于阴性对照的各细胞的存活率而言，兔血管平滑肌细胞在12小时、nih3t3细胞在36小时时低于50％。另一方面，在含有脱酰基结冷胶的培养基中，两种细胞的存活率直至115小时为止均显示了50％以上的值。将兔血管平滑肌细胞的活细胞数及存活率示于表1及表2，将nih3t3细胞的活细胞数及存活率示于表3及表4。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[试验例2]

血管平滑肌细胞的细胞周期(cellcycle)分析

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对得到的脱酰基结冷胶水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该溶液，制备含有最终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，得到培养基组合物。接着，将兔血管平滑肌细胞(由千叶大学药学研究院病院药学研究室制备)添加至上述的培养基组合物，使其成为4×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种9ml。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内静置，由此，在静置状态下悬浮培养细胞最长5天。需要说明的是，作为对照，将兔血管平滑肌细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem(和光纯药公司制)中，在常规的单层培养用的培养皿上进行培养。

使用细胞裂解液(ipbuffer)从各细胞回收蛋白质，利用bca法(thermoscientific)实施蛋白质定量。使用20μg的蛋白质，进行western印迹法(westernblot)分析。作为一抗(santacruzbiotechnology公司制)，以200倍稀释使用多克隆抗p27抗体(c-19)、多克隆抗p21抗体(m-19)、多克隆抗cdk2抗体(m-2)、及多克隆抗β-肌动蛋白抗体(i-19)。另外，作为二抗，以10,000倍稀释使用抗兔igg-hrp抗体(amershambioscience)。利用eclwestern印迹法检测试剂(westernblottingdetectionreagents)(amershambioscience)或immobilonwestern(millipore)，用las4000(fujifilm)进行检测。

在在含有脱酰基结冷胶的培养基中的悬浮培养、与在不含脱酰基结冷胶的培养基中的单层培养之间，比较兔血管平滑肌细胞的细胞周期(cellcycle)因子的表达。在含有脱酰基结冷胶的培养基中培养兔血管平滑肌细胞时，促进细胞周期(cellcycle)中的g1/s期转换的cdk2的表达和抑制g1/s转换的p21及p27的表达均下降(图1)。在单层培养中的兔血管平滑肌细胞中未确认到该现象。由g1/s期的促进因子及抑制因子均下降的结果表明，在含有脱酰基结冷胶的培养基中的悬浮培养使兔血管平滑肌细胞的细胞周期中止于g0期停。

[试验例3]

血管平滑肌细胞的细胞周期分析

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对该水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该溶液，制备最终浓度为0.015％(w/v)的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，制备培养基组合物。接着，将兔血管平滑肌细胞(由千叶大学药学研究院病院药学研究室制备)添加至上述的培养基组合物，使其成为3×10⁵个细胞/ml(兔血管平滑肌细胞)，然后在15ml管中接种5ml。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内静置，由此，在静置状态下悬浮培养细胞最长3天。需要说明的是，作为对照，使用下述细胞：将兔血管平滑肌细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem(和光纯药公司制)中，在常规的单层培养用的培养皿上进行培养而得到的细胞。

使用细胞裂解液(ipbuffer)从各细胞回收蛋白质，利用bca法(thermoscientific)实施蛋白质定量。使用10～15μg的蛋白质，进行western印迹法(westernblot)分析。作为一抗，以200倍稀释使用santacruzbiotechnology公司制的多克隆抗细胞周期蛋白(cyclin)e1抗体(m-20)、多克隆抗cdk2抗体(m-2)、多克隆抗p27抗体(c-19)、多克隆抗p21抗体(m-19)、多克隆抗β-肌动蛋白抗体(i-19)，以250倍稀释使用单克隆抗细胞周期蛋白d1抗体(hd11)，以1000倍稀释使用bdbiosciences公司制的单克隆抗细胞周期蛋白d3抗体，以250倍稀释单克隆抗cdk4抗体。另外，作为二抗，以50,000倍稀释使用抗小鼠igg-hrp抗体(gehealthcare)，以10,000倍稀释使用抗兔igg-hrp抗体(cellsignalingtechnology)。利用eclwestern印迹法检测试剂(westernblottingdetectionreagents)(gehealthcare)或immobilonwestern(millipore)，用las4000(fujifilm)进行检测。

对含有脱酰基结冷胶的培养基中和单层培养中的兔血管平滑肌细胞的细胞周期(cellcycle)因子进行比较。在含有脱酰基结冷胶的培养基中培养兔血管平滑肌细胞时，促进细胞周期中的g1/s期转换的cdk2的表达和抑制g1/s转换的p21的表达均下降，并确认了重现性(图2)。在在单层培养中的兔血管平滑肌细胞中未确认到该现象。由g1/s期的促进因子及抑制因子均下降的结果表明，含有脱酰基结冷胶的培养基使兔血管平滑肌细胞进入g0期。

[试验例4]

nih3t3细胞的细胞周期分析

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对该水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该溶液，制备最终浓度为0.015％(w/v)的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，制备培养基组合物。接着，将小鼠成纤维细胞株nih3t3(atcc公司制)添加至上述的培养基组合物中，使其成为3×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种5ml。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内以静置状态悬浮培养细胞最长5天。需要说明的是，作为对照，使用下述细胞：将nih3t3细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem(和光纯药公司制)中，在常规的单层培养用的培养皿上进行培养而得到的细胞。

使用细胞裂解液(ipbuffer)从各细胞回收蛋白质，利用bca法(thermoscientific)实施蛋白质定量。使用10～15μg的蛋白质，进行western印迹法(westernblot)分析。作为一抗，以200倍稀释使用santacruzbiotechnology公司制的多克隆抗细胞周期蛋白e1抗体(m-20)、多克隆抗cdk2抗体(m-2)、多克隆抗p27抗体(c-19)、多克隆抗p21抗体(m-19)、多克隆抗β-肌动蛋白抗体(i-19)，以250倍稀释使用单克隆抗细胞周期蛋白d1抗体(hd11)，以1000倍稀释使用bdbiosciences公司制的单克隆抗细胞周期蛋白d3抗体，以250倍稀释使用单克隆抗cdk4抗体。另外，作为二抗，以50,000倍稀释使用抗小鼠igg-hrp抗体(gehealthcare)，以10,000倍稀释使用抗兔igg-hrp抗体(cellsignalingtechnology)。利用eclwestern印迹法检测试剂(westernblottingdetectionreagents)(gehealthcare)或immobilonwestern(millipore)，用las4000(fujifilm)进行检测。

对含有脱酰基结冷胶的培养基中和单层培养中的nih3t3细胞的细胞周期因子进行比较。在含有脱酰基结冷胶的培养基中培养nih3t3细胞时，促进细胞周期中的g1/s期转换的cdk2的表达下降，与兔血管平滑肌细胞的结果相同。然而，未确认到抑制g1/s转换的p21的表达下降，与兔血管平滑肌细胞的结果不同(图3)。这表明，在含有脱酰基结冷胶的培养基中培养兔血管平滑肌细胞和nih3t3细胞时，呈现不同的细胞周期模式。

[试验例5]

血管平滑肌细胞的磷酸化erk及磷酸化fak的蛋白分析

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对该水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该溶液，制备最终浓度为0.015％(w/v)的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，制备培养基组合物。接着，将兔血管平滑肌细胞(由千叶大学药学研究院病院药学研究室制备)添加至上述的培养基组合物，使其成为3×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种5ml。需要说明的是，作为对照，使用下述细胞：将兔血管平滑肌细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem(和光纯药公司制)中，在常规的单层培养用的培养皿上进行培养而得到的细胞。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内以静置状态悬浮培养细胞最长3天。

使用细胞裂解液(ipbuffer)从各细胞回收蛋白质，利用bca法(thermoscientific)实施蛋白质定量。使用10～15μg的蛋白质，进行western印迹法(westernblot)分析。作为一抗，以100倍稀释使用upstatebiotechnology公司制的单克隆抗磷酸化fak(p125)抗体，以200倍稀释使用bdbiosciences公司制的单克隆抗fak抗体，以500倍稀释使用cellsignaling公司制的多克隆抗磷酸化p44/42mapk(erk1/2)抗体(thr202/tyr204)，以500倍稀释使用zymed公司制的单克隆抗map激酶(erk1+erk2)抗体。另外，作为二抗，以50,000倍稀释使用抗小鼠igg-hrp抗体(gehealthcare)，以10,000倍稀释使用抗兔igg-hrp抗体(cellsignalingtechnology)。利用eclwestern印迹法检测试剂(westernblottingdetectionreagents)(gehealthcare)或immobilonwestern(millipore)，用las4000(fujifilm)进行检测。

对含有脱酰基结冷胶的培养基中和单层培养中的兔血管平滑肌细胞的信号转导因子(erk及fak)进行比较。在单层培养中，培养开始1小时后，磷酸化erk的表达量为无法检测的水平。在含有脱酰基结冷胶的培养基中培养兔血管平滑肌细胞时，与单层培养相比，磷酸化erk表达量未显示变化。另一方面，关于磷酸化fak量，显示了表达量较之单层培养而言更低的倾向(图4)。

[试验例6]

nih3t3细胞的磷酸化erk及磷酸化fak的蛋白分析

按照wo2014/017513a1中记载的制造方法，制备用于细胞的悬浮培养的培养基组合物。即，将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对该水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该水溶液，制备最终浓度为0.015％(w/v)的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，制备培养基组合物。接着，将小鼠成纤维细胞株nih3t3(atcc公司制)添加至上述的培养基组合物中，使其成为3×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种5ml。需要说明的是，作为对照，使用下述细胞：将nih3t3细胞混悬于不含脱酰基结冷胶的dmem(和光纯药公司制)中，在常规的单层培养用的培养皿上进行培养而得到的细胞。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内以静置状态悬浮培养细胞最长5天。

使用细胞裂解液(ipbuffer)从各细胞回收蛋白质，利用bca法(thermoscientific)实施蛋白质定量。使用10～15μg的蛋白质，进行western印迹法(westernblot)分析。作为一抗，以100倍稀释使用upstatebiotechnology公司制的单克隆抗磷酸化fak(p125)抗体，以200倍稀释使用bdbiosciences公司制的单克隆抗fak抗体，以500倍稀释使用cellsignaling公司制的多克隆抗磷酸化p44/42mapk(erk1/2)抗体(thr202/tyr204)，以500倍稀释使用zymed公司制的单克隆抗map激酶(erk1+erk2)抗体。另外，作为二抗，以50,000倍稀释使用抗小鼠igg-hrp抗体(gehealthcare)，以10,000倍稀释使用抗兔igg-hrp抗体(cellsignalingtechnology)。利用eclwestern印迹法检测试剂(westernblottingdetectionreagents)(gehealthcare)或immobilonwestern(millipore)，用las4000(fujifilm)进行检测。

对含有脱酰基结冷胶的培养基中和单层培养中的nih3t3细胞的信号转导因子(erk及fak)进行比较。在单层培养中，磷酸化erk的表达量为无法检测的水平。在含有脱酰基结冷胶的培养基中进行培养时，与单层培养时相比，磷酸化erk的表达显示更高的表达量。另一方面，关于磷酸化fak量，显示了表达量较之单层培养时而言更低的倾向(图5)。这暗示了，由于兔血管平滑肌细胞与nih3t3细胞的erk及fak的磷酸化模式不同，因此两种细胞的信号传递不同。

[试验例7]

将脱酰基结冷胶(kelcogelcg-la，三晶株式会社制)悬浮于超纯水(milli-q水)中，使其成为0.3％(w/v)，然后，通过一边于90℃进行加热一边进行搅拌而进行溶解，针对该水溶液，于121℃进行20分钟高压釜灭菌。使用该水溶液，制备最终浓度为0.015％(w/v)的dmem/f12(kohjinbio.,co.ltd.公司制)，进而添加10％(v/v)胎牛血清，制备培养基组合物。接着，将兔血管平滑肌细胞(由千叶大学药学研究院病院药学研究室制备)添加至上述的培养基组合物，使其成为1×10⁵个细胞/ml，然后在15ml管中接种。接着，将该管在co2培养箱(37℃、5％co2)内以静置状态培养2天。然后，使用dmem(和光纯药工业制)，将经过胰蛋白酶处理的细胞以9×10⁴个细胞/3cm培养皿进行接种，继续培养。在培养3天、5天及7天后，更换培养基。回收培养1天、3天、5天、7天及10天后的细胞，添加台盼蓝试剂(lifetechnologies公司制)使其混悬，在显微镜下计数活细胞数、总细胞数。由总细胞数和活细胞数计算存活率。

维持悬浮状态，在含有脱酰基结冷胶的培养基中悬浮培养血管平滑肌细胞时，在维持良好的存活性的状态的情况下抑制了细胞增殖。在将血管平滑肌细胞从悬浮培养转移至在培养板上的粘附培养而进行传代后，虽然其形态性质也维持了一定期间，但随后血管平滑肌细胞增殖(图6)。

产业上的可利用性

通过本发明，能在细胞增殖被抑制的状态下，在体外(invitro)长期维持血管平滑肌细胞。通过本发明，可期待能在无需冷冻操作的条件下运输血管平滑肌细胞，并且使在冷冻、粘附中所观察到的细胞的形态性质变化为最小限度。本发明有助于利用血管平滑肌细胞的再生医疗的发展。

通过在本说明书中引用包括本说明书中记载的专利、专利申请说明书、科学文献在内的全部出版物中的记载内容，从而将其以等同于全部公开的程度而并入本说明书中。

本申请以于日本提出申请的日本特愿2015-017839(申请日：2015年1月30日)、日本特愿2015-065007(申请日：2015年3月26日)及日本特愿2015-183940(申请日：2015年9月17日)为基础，将其全部内容并入本说明书中。