本申请根据35u.s.c.第119(e)节要求于2015年6月12日提交的美国临时专利申请号62/175,003的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请涉及癌症领域，特别地涉及包含与用嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)转导的自体t细胞共培养的自体抗原呈递细胞的组合物以及在患者特异性联合免疫治疗中使用的方法，所述自体抗原呈递细胞经表达患者特异性突变之癌症转录物的慢病毒载体转导。
背景技术：
癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，每年癌症就影响近130万新患者，并且是继心血管疾病之后的第二大致死原因，占死亡人数的约四分之一。实体瘤是造成这些死亡中的大多数的原因。尽管在某些癌症的药物治疗方面有显著的进展，但是在过去20年里，所有癌症的总体5年生存率仅提高了约10％。癌症或恶性肿瘤以不受控制的方式快速转移和生长，使治疗变得极为困难。现代癌症治疗的困难之一是癌症的活检和诊断以及患者的有效治疗之间流逝的时间量。在此期间，患者的肿瘤可能会不受阻碍地生长，使得疾病在实施治疗前进一步发展。这负面地影响了癌症的预后和结果。
嵌合抗原受体(car)是包含三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，和(3)胞内t细胞信号传导基序(longah、hasowm、orentasrj.lessonslearnedfromahighly-activecd22-specificchimericantigenreceptor.oncoimmunology.2013；2(4)：e23621)。car的抗原结合基序通常在单链可变片段(scfv)(免疫球蛋白(ig)分子的最小结合结构域)之后形成。还已经工程改造了替代的抗原结合基序，例如受体配体(即，il-13已被工程改造为结合肿瘤表达的il-13受体)、完整的免疫受体、文库来源的肽和先天性免疫系统效应分子(例如nkg2d)。car表达的替代细胞靶标(例如nk或γ-δt细胞)也在开发中(brownce等，clincancerres.2012；18(8)：2199-209；lehnerm等，plosone.2012；7(2)：e31210)。关于限定最活跃的t细胞群体以用car载体转导，确定最佳培养和扩增技术，以及限定car蛋白质结构本身的分子细节，仍然有重要的工作。
car的连接基序可以是相对稳定的结构域，例如igg的恒定结构域，或设计为延伸的柔性接头。可以使用结构基序(例如来源于igg恒定结构域的那些)来使scfv结合结构域延伸远离t细胞质膜表面。这对于其中结合结构域特别接近肿瘤细胞表面膜的某些肿瘤靶标(例如对于双唾液酸神经节苷脂gd2；orentas等，未发表的观察)来说可能是重要的。迄今为止，car中使用的信号传导基序总是包括cd3-ζ链，因为该核心基序是t细胞活化的关键信号。首次报道的第二代car的特征在于cd28信号传导结构域和cd28跨膜序列。该基序也用于含有cd137(4-1bb)信号传导基序的第三代car中(zhaoy等jimmunol.2009；183(9)：5563-74)。随着新技术的出现，具有与抗cd3和抗cd28抗体连接的珠子的t细胞的活化以及来自cd28的经典“信号2”的存在不再需要由car本身编码。使用珠子活化，发现第三代载体在体外测定中并不优于第二代载体，并且它们在白血病的小鼠模型中并不提供优于第二代载体的明显益处(hasow，leedw，shahnn，stetler-stevensonm，yuancm，pastanih，dimitrovds，morganra，fitzgeralddj，barrettdm，wayneas，mackallcl，orentasrj.anti-cd22-chimericantigenreceptorstargetingbcellprecursoracutelymphoblasticleukemia.blood.2013；121(7)：1165-74；kochenderferjn等，blood.2012；119(12)：2709-20)。第二代cd28/cd3-ζ中cd19特异性car的临床成功(leedw等，americansocietyofhematologyannualmeeting.neworleans，la；十二月，7-10，2013)和cd137/cd3-ζ信号传导形式(porterdl等，nengljmed.2011；365(8)：725-33)证实了这一点。除了cd137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如ox40)也能够在car转导的t细胞中提供重要的持久信号(yvone等，clincancerres.2009；15(18)：5852-60)。培养cart细胞群体的培养条件同样重要。
癌症的car治疗的更广泛且更有效的改进中当前的挑战涉及到缺乏吸引人的靶标(compellingtarget)。创建细胞表面抗原的结合物(binder)目前容易实现，但是找到对肿瘤特异同时不伤害(sparing)正常组织的细胞表面抗原仍然是一个艰巨的挑战。使表达car的t细胞具有更高靶细胞特异性的一个可能的方法是使用组合car方法。在一个系统中，cd3-ζ和cd28信号单元被分在同一细胞中表达的两种不同car构建体之间；在另一系统中，两个car被表达在同一t细胞中，但其中一个具有更低的亲和力，因此需要首先接合供替选的car以用于第二个的完整活性(lanitise等，cancerimmunolres.2013；1(1)：43-53；klosscc等，natbiotechnol.2013；31(1)：71-5)。对于产生作为免疫治疗剂的单个基于scfv的car的第二个挑战是肿瘤细胞异质性。至少一个研究小组已经开发了胶质母细胞瘤的car策略，其中效应细胞群同时靶向多种抗原(her2、il-13ra、epha2)，以期避免靶抗原阴性群体的生长(hegdem等，molther.2013；21(11)：2087-101)。
基于t细胞的免疫疗法已成为合成生物学的一个新的前沿；构想多个启动子和基因产物以将这些高度强效的细胞引导至肿瘤微环境，在那里t细胞既可以逃避负调节信号，也可以介导有效的肿瘤杀伤。通过药物诱导的诱导型半胱天冬酶9构建体与ap1903的二聚化作用消除不期望的t细胞证实了一种方式，其中可以药理学地启动可控制t细胞群体的强大开关(distasia等，nengljmed.2011；365(18)：1673-83)。通过诱饵受体的表达来产生对转化生长因子β的负调控作用免疫的效应t细胞群体进一步证明效应t细胞可以被工程改造以达到最佳抗肿瘤活性的程度(fosterae等，jimmunother.2008；31(5)：500-5)。
因此，尽管car似乎能够以类似于内源性t细胞受体的方式触发t细胞活化，但迄今为止这种基于car的技术的临床应用的主要障碍一直限于car+t细胞的体内扩增、输注后细胞的快速消失、令人失望的临床活性以及使用这样的car+t细胞进行癌症的诊断和及时治疗之间过长的时间。
因此，本领域迫切而长期地需要发现使用基于car的疗法用于治疗癌症的组合物和方法，所述基于car的疗法可以显示患者特异性的预期治疗特性而没有上述缺点。
本发明通过提供包含共培养的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞/t细胞的组合物及在可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的患者特异性组合疗法中使用其的方法解决了这些需求。
特别地，如本文中公开和描述的本发明提供了包含用表达患者特异性肿瘤编码的突变的癌抗原的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞的组合物，所述细胞与用表达嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞共培养，其具有或不具有转导到治疗性t细胞群体中的一种或更多种慢病毒表达的肿瘤活检和外周血来源的肿瘤抗原t细胞受体，以产生活性患者特异性抗肿瘤t细胞群体，其能够直接输注回患者体内而以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
技术实现要素：
本文中提供了包含共培养的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞和t细胞的新的过继免疫治疗组合物，以及在可用于治疗癌症和其他疾病和病症的患者特异性联合免疫治疗中使用其的方法。
因此，在一个方面，本文中提供了表达患者特异性的突变癌抗原的慢病毒载体、表达天然t细胞受体(tcr)的慢病毒载体、表达肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的慢病毒载体以及表达嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体以及表达突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的宿主细胞(例如，t细胞)，以及编码突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的核酸分子。还提供了使用所公开的表达患者特异性突变的癌抗原的慢病毒载体、表达天然t细胞受体(tcr)的慢病毒载体、表达肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的慢病毒载体和表达嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体、宿主细胞和核酸分子的方法，例如以在对象中治疗癌症。
在一方面，提供了过继免疫治疗组合物，其包含用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中t细胞与用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体的自身抗原呈递细胞共培养，从而产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在一个实施方案中，自体抗原呈递细胞来源于自体树突细胞或b细胞或混合物或外周血来源的淋巴细胞。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中将含有天然t细胞受体(tcr)的自体患者特异性t细胞用慢病毒载体转导以在与用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞共培养期间或之后表达嵌合抗原受体(car)，以产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中患者来源的肿瘤抗原通过患者活检和核苷酸测序进行鉴定以鉴定突变体组(mutanome)内的突变rna转录物。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中自体抗肿瘤t细胞群体包含含有患者特异性树突细胞或b细胞或混合物或外周血来源的淋巴细胞的自体抗原呈递细胞(antigenpresentationcell，apc)。
在另一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中自体抗肿瘤t细胞群体包含含有用eb病毒(ebv)永生化的活性患者特异性自体b细胞的自体抗原呈递细胞(apc)，其中永生化步骤包括将自体b细胞与含有ebv的细胞培养物上清液一起培养。在一个实施方案中，用于生产用ebv永生化的此类活性患者特异性自体b细胞的商业服务包括，例如但不限于appliedbiologicmaterial，abm，inc.，(https：//www.abmgood.com/ebv-cell-immortalization.html)。在一个实施方案中，ebv永生化的b细胞系包含本领域常规使用的细胞系，包括但不限于ebv永生化的b细胞系b95-8(atcccrl-1612，或者包含ebv的上清液(atcc-br14-92)。
在另一方面，提供了过继免疫治疗组合物，其包含用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中t细胞群体额外用一种或更多种编码肿瘤特异性t细胞受体(tcr)的慢病毒载体转导以产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中肿瘤特异性t细胞受体(tcr)首先通过将用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体转导的抗原呈递细胞(apc)与hla相容的或患者特异性的t细胞共培养来鉴定。
在一个实施方案中，自体抗原呈递细胞来源于自体树突细胞或b细胞或混合物或外周血来源的淋巴细胞。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中肿瘤特异性t细胞受体(tcr)是hla相容的或患者特异性的。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中用慢病毒载体转导含有患者特异性的肿瘤特异性t细胞受体(tcr)的自体患者特异性t细胞以在与用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞共培养期间或之后表达嵌合抗原受体(car)，以产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够识别所述肿瘤特异性t细胞受体(tcr)并且能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中患者来源的肿瘤抗原通过患者活检和核苷酸测序进行鉴定以鉴定突变体组内的突变rna转录物。在一个实施方案中，使用下一代(nextgen)测序进行核苷酸测序。
在一个实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中自体抗肿瘤t细胞群体包含含有患者特异性树突细胞或b细胞或混合物或外周血来源的淋巴细胞的自体抗原呈递细胞(apc)。
在某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体在肿瘤活检的一天、三天、五天、七天、十天、十四天、二十一天或一个月内产生，并且其中所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体可以输注回患有癌症的患者中，并且能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的至少一个胞外抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的至少一个胞外抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个重链可变区。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的至少一个胞外抗原结合结构域、car的至少一个胞内信号传导结构域或两者通过接头或间隔子结合域与跨膜结构域连接。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的胞外抗原结合结构域之前是前导肽。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的胞外抗原结合结构域靶向抗原，所述抗原包含cd19、cd20、cd22、ror1、tslpr、间皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、magea3tcr或其任何组合。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的胞外抗原结合结构域包含抗cd19scfv抗原结合结构域、抗cd20scfv抗原结合结构域、抗cd22scfv抗原结合结构域、抗ror1scfv抗原结合结构域、抗tslprscfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33scfv抗原结合结构域、抗cd38scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2scfv抗原结合结构域、抗gpc3scfv抗原结合结构域、抗fgfr4scfv抗原结合结构域、抗c-metscfv抗原结合结构域、抗pmsascfv抗原结合结构域、抗糖脂f77scfv抗原结合结构域、抗egfrviiiscfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcrscfv抗原结合结构域、抗magea3tcrscfv抗原结合结构域，或其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任何组合。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car的接头或间隔子结构域来源于cd8的胞外结构域，并与跨膜结构域连接。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中car还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd271、tnfrsf19或其任何组合。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域还包含cd3ζ胞内结构域。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域排列在相对于cd3ζ胞内结构域的c末端侧。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、主要信号传导结构域或其任何组合。
在上述提及的两个方面的某些实施方案中，提供了过继免疫治疗组合物，其中所述至少一个共刺激结构域包含ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)的功能性信号传导结构域或其任何组合。
在一方面，本文中提供了编码患者特异性突变的癌抗原的分离的核酸分子、编码天然t细胞受体(tcr)的分离的核酸分子、编码肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的分离的核酸分子，或编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的一个方面，修饰car以表达或含有用于诊断、监测和/或预测治疗结果(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展的可检测标志物。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的一个实施方案中，编码所公开的car的核酸分子可以包含在载体(例如病毒载体)中。载体是dna载体、rna载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体、狒狒内源性病毒(baboonendogenousvirus，baev)或其组合。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的某些实施方案中，慢病毒载体用不同的病毒糖蛋白(gp)进行假型化(pseudotype)，所述病毒糖蛋白包括例如但不限于：双嗜性鼠白血病病毒[mlv-a]、gp164、长臂猿白血病病毒[galv]、rd114、猫内源性病毒逆转录病毒衍生的gp和水泡性口腔炎病毒[vsv]、麻疹病毒、禽瘟病毒[fpv]、埃博拉病毒[ebov]、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒[lcmv])非逆转录病毒衍生的gp以及其嵌合变体，包括例如但不限于：编码与mlv-agp的胞质尾(指定为tr)融合的galv或rd114gp的胞外结构域和跨膜结构域的嵌合gp。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的某些实施方案中，载体还包含启动子，其中启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子、组成型启动子、自杀启动子或其任何组合。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的又一个实施方案中，可以进一步修饰表达car的载体以包括一种或更多种操作元件以控制cart细胞的表达，或者通过自杀开关消除car-t细胞。自杀开关可以包括例如，诱导信号传导级联的细胞凋亡或诱导细胞死亡的药物。在一个优选的实施方案中，可以进一步修饰表达car的载体以表达酶如胸苷激酶(thymidinekinase，tk)或胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，cd)。
在car用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的另一方面，还提供了包括编码car的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是t细胞，例如从对象获得的原代t细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是cd8+t细胞。
在又一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的患有癌症的人的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的群体，其中所述癌症是对一种或更多种化学治疗剂无响应的难治性癌症。癌症包括造血系统癌症、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)中的轻微后遗症(minimalresidualdisease，mrd)、急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia，aml)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血液癌症和实体瘤，或其任何组合。
在又一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的患有癌症的人的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的群体，其中所述癌症包括血液癌症，例如白血病(例如，慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)或慢性髓性白血病(cml)、淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)或多发性骨髓瘤，或其任何组合。
在又一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的患有癌症的人的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的群体，其中所述癌症包括成人上皮癌，其包括口咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、小儿肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤)、中枢神经系统肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤)和乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眼眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任何组合。
在另一方面，提供了制备活性患者特异性自体抗肿瘤含car的t细胞的方法。所述方法包括用编码以下的载体或核酸分子转导t细胞：i)一种或更多种患者特异性的突变癌抗原；ii)一种或更多种患者特异性和肿瘤特异性的tcr；和iii)特异性结合抗原的一种或更多种嵌合抗原受体(car)或其任何组合，从而制备活性患者特异性自体抗肿瘤含car的t细胞。
在另一方面，提供了产生rna工程化的t细胞的群体的方法，其包括将编码以下的核酸分子的体外转录的rna或合成rna引入对象的细胞中：i)一种或更多种患者特异性突变的癌抗原；ii)一种或更多种患者特异性和肿瘤特异性的tcr；和iii)一种或更多种嵌合抗原受体(car)或其任何组合，从而产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
另一方面，提供了药物组合物，其包含用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中所述t细胞与用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体转导的自身抗原呈递细胞共培养，从而产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在另一方面，提供了药物组合物，其包含用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中所述t细胞群体额外用一种或更多种编码肿瘤特异性t细胞受体(tcr)的慢病毒载体转导以产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够识别所述肿瘤特异性t细胞受体(tcr)并且能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在一个实施方案中，提供了药物组合物，其中所述t细胞是具有血液癌症的人的t细胞。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中血液癌症是白血病或淋巴瘤。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中白血病是慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)或慢性粒细胞白血病(cml)。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中淋巴瘤是套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中血液癌症是多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌，其包括口咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、小儿肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤)、中枢神经系统肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤)和乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眼眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任何组合。
在另一方面，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含抗肿瘤有效量的用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中所述t细胞与用一种或更多种表达患者来源的肿瘤抗原的慢病毒载体转导的自体抗原呈递细胞共培养，从而产生活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在另一方面，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含抗肿瘤有效量的用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体转导的自体t细胞群体，其中所述t细胞群体额外用一种或更多种编码肿瘤特异性t细胞受体(tcr)的慢病毒载体转导以产生能够识别所述肿瘤特异性t细胞受体(tcr)的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，所述活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体能够直接输注回患者体内而以患者特异性方式促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
在某些实施方案中，本文中提供了一种方法，t细胞通过表达特异性活化或记忆相关表面标志物已进行了预先选择。
在某些实施方案中，本文中提供了一种方法，其中t细胞和树突细胞来源于造血干细胞供体，并且其中所述方法在造血干细胞移植的情况下进行。
在又一个方面，提供了用于在诊断患有癌症的人中产生遗传工程化的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的持续存在群体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有此需要的人患者施用本文中所述的一种或更多种活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体，其中活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的持续存在群体或t细胞的后代的群体在施用后在人中持续至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
在一个实施方案中，人中的子代t细胞包含记忆t细胞。在另一个实施方案中，t细胞是自体t细胞。
在本文中所述的方法的所有方面和实施方案中，可以使用一种或更多种包含本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的组合物治疗或预防或改善与肿瘤抗原表达升高相关的上述癌症、疾病、障碍或病症。
在另一方面，提供了用于制备包含如上所述的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体或用于预防、治疗或改善与上文所述的对象中肿瘤抗原表达升高相关的任何癌症、疾病、障碍或病症的组合物的试剂盒，所述试剂盒包含含有上述核酸分子、载体、宿主细胞或组合物中的任一种或其任何组合的容器，以及使用所述试剂盒的说明书。
应理解，活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体、表达患者特异性突变癌抗原的慢病毒载体、表达天然t细胞受体(tcr)的慢病毒载体、表达肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的慢病毒载体和表达嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体，以及表达突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的宿主细胞(例如t细胞)，以及编码突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的核酸分子，上文所述的宿主细胞和方法在本文中详细描述的具体方面和实施方案之外是有用的。从下面参照附图进行的详细描述中，本公开内容的前述特征和优点将变得更加明显。
附图简述
当结合附图阅读时，将会更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应理解，本发明不限于附图中所示的实施方案的精确安排和手段。
图1描绘了用于治疗癌症的第一示例性方法，其中指定用于免疫治疗的t细胞(再输注回患者中)用表达car的lv转导，并通过其天然tcr刺激以识别由下一代测序鉴定的患者特异性突变蛋白。
图2描述了用于治疗癌症的第二示例性方法，其中指定用于免疫治疗的t细胞(再输注回患者中)用表达car的lv和来源于肿瘤活检或血液的tcr序列转导，并通过由肿瘤的下一代测序鉴定的表达dc的转录物刺激。
发明详述
定义
除非上下文另外明确指出，否则如本文中使用的无数量词修饰的名词均指单数以及复数形式二者。例如，术语“抗原”包括单个或多个抗原，并且可以认为与短语“至少一个抗原”等同。如本文中使用的术语“包含”意指“包括”。因此，“包含抗原”意指“包括抗原”而不排除其他要素。短语“和/或”意指“和”或“或”。进一步应理解，除非另有说明，否则对于核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似的，并且是出于描述的目的而提供。虽然可以使用与本文中描述的那些类似或等同的许多方法和材料，但是下文描述了特定的合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书(包括对术语的解释)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。为了便于查阅多个实施方案，提供了以下对术语的解释：
当提及可测量值(例如量、短的持续时间等)时，术语“约”意指涵盖与特定值有+/-20％、+/-10％或更优选+/-5％，或+/-1％，或者还更优选+/-0.1％的变异，因为这样的变异适合于执行所公开的方法。
除非另有说明，否则根据常规用法使用本文中的技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于oxforduniversitypress，1999年出版的benjaminlewin，genesvii；blackwellscienceltd.1994出版的kendrew等(编)，theencyclopediaofmolecularbiology；和vchpublishers，inc.，1995年出版的roberta.meyers(编)，molecularbiologyandbiotechnology：acomprehensivedeskreference；以及其他类似的参考文献。
本发明涉及用于治疗癌症(包括但不限于血液恶性肿瘤和实体瘤)的组合物和方法。本发明涉及过继性细胞转移经转导以表达嵌合抗原受体(car)的t细胞的患者特异性肿瘤特异性策略。
本发明更具体地涉及表达患者特异性突变癌抗原的慢病毒载体、表达天然t细胞受体(tcr)的慢病毒载体、表达肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的慢病毒载体，并且表达本文中提供的嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体，以及表达突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的宿主细胞(例如t细胞)，以及编码突变的癌抗原、天然t细胞受体、t细胞tcr转录物和受体的核酸分子。还提供了使用所公开的表达患者特异性突变的癌抗原的公开的慢病毒载体、表达天然t细胞受体(tcr)的慢病毒载体、表达肿瘤特异性反应性t细胞tcr转录物的慢病毒载体和表达嵌合抗原受体(car)的慢病毒载体、宿主细胞和核酸分子的方法，例如以在对象中治疗癌症。
令人惊讶和意外的是，本发明人现在已经发现，如果除表达肿瘤特异性tcr(通过选择天然t细胞群体或分子克隆并通过慢病毒载体转移肿瘤特异性tcr)之外，还伴随表达嵌合抗原受体(car)，则t细胞的活性抗肿瘤群体更加有效。car令人惊讶和意外地允许携带肿瘤特异性tcr的t细胞群体的持续存在，这通过在遇到患者可以耐受其损失并且还用于为不存在于肿瘤组织本身的治疗性细胞群体提供刺激信号的自身抗原(例如cd19)时，通过刺激该t细胞群体而实现。如本文中所述的这样的活性患者特异性抗肿瘤t细胞群体能够直接输注回患者中以促进患者特异性抗肿瘤t细胞的体内扩增、持续存在，从而以患者特异性的方式导致肿瘤稳定、减少和/或消除，和/或癌症的缓解和/或消除。
因此，在最广泛的方面，这种过继免疫治疗的新颖性在于通过用肿瘤特异性突变基因转导apc，然后用患者t细胞进行培养，来使用慢病毒载体以鉴定患者tcr。这包括对所述患者中的突变的抗原进行测序和鉴定，然后通过lv在apc中表达突变的蛋白，以及共培养t细胞并鉴定患者tcr。然后可以分离和表征突变体组特异性tcr和t细胞。另外，然后添加car以增强免疫应答(ir)。区别特征在于car不是主要的免疫治疗剂，而是用于增强高度特异性的tcr应答。它以两种不同的方式增强了ir：首先，通过为t细胞提供额外信号来扩增并在体内存活；其次，通过靶向免疫抑制细胞抗原。
在另一方面，这种过继免疫治疗的新颖性在于通过使用lv用肿瘤编码的突变基因转导apc，然后与患者细胞进行培养，来使用慢病毒载体以鉴定患者来源的肿瘤特异性tcr。这包括对来自患者的突变抗原进行测序和鉴定，然后通过lv表达apc中的突变的蛋白，并共培养患者t细胞以鉴定突变体组特异性tcr。在另一方面，使用car来增强对由治疗性t细胞群体介导的肿瘤的免疫应答。以至少三种方式增强免疫应答。首先，通过为t细胞提供额外的信号以在体内扩增和存活，car允许携带肿瘤特异性tcr的治疗性t细胞群体的持续存在，这通过在遇到患者可以耐受其丧失并且还用于为不存在于肿瘤组织本身的治疗性细胞群体提供刺激信号的自身抗原(例如cd19)时，通过刺激该t细胞群体而实现。在第二方面，car可靶向除介导免疫抑制作用的肿瘤以外的细胞类型。例如，如果表达cd19的b细胞存在于肿瘤损伤中并且还介导抗肿瘤作用，则对表达car的肿瘤特异性t细胞群体的第二个益处在于免疫抑制性细胞群体也被去除。在第三方面，car靶向肿瘤远端的免疫抑制群体，即，存在于体内另一个隔室中的免疫抑制群体。例如，使用靶向可能存在于肿瘤病变本身或区域性淋巴结或骨髓中的骨髓来源的抑制性细胞(mdsc)的car。
接下来是可用于本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的详细描述，包括其胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的描述以及car、使用所公开的car的抗体及其抗原结合片段、缀合物、核苷酸、表达、载体和宿主细胞、治疗方法、组合物和试剂盒的另外的描述。
a.嵌合抗原受体(car)
本文中公开的car包含至少一个能够与抗原结合的胞外结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内结构域。
嵌合抗原受体(car)是人工构建的杂交蛋白或多肽，其含有通过跨膜结构域与t细胞信号传导结构域连接的抗体(例如，单链可变片段(scfv))的抗原结合结构域。car的特征包括其能够以非mhc限制性方式对所选靶标重定向t细胞特异性和反应性，以及利用单克隆抗体的抗原结合性质。非mhc限制性抗原识别赋予表达car的t细胞独立于抗原加工的识别抗原的能力，从而绕过了主要的肿瘤逃逸机制。此外，当在t细胞中表达时，car有利地不与内源性t细胞受体(tcr)α和β链二聚化。
如本文中公开的，car的胞内t细胞信号传导结构域可以包括例如t细胞受体信号传导结构域、t细胞共刺激信号传导结构域或两者。t细胞受体信号传导结构域是指包含t细胞受体胞内结构域的car的一部分，例如但不限于cd3ζ蛋白的胞内部分。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的car的一部分，其是除抗原受体或其配体以外淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子。
1.胞外结构域
在一个实施方案中，如本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体中使用的car包含靶特异性结合元件，所述靶特异性结合元件另外称为抗原结合结构域或部分。结构域的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域来识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可充当car中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个实施方案中，可以通过工程改造与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的期望的抗原结合结构域来工程改造car以靶向目的肿瘤抗原。肿瘤抗原是由引起免疫应答(特别是t细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白质。抗原结合结构域的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、α-甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆转录酶，ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、lage-1a、p53、prostein、psma、her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰岛素生长因子(igf)-i、igf-ii、igf-i受体和间皮素。本文中公开的肿瘤抗原仅作为实例包括在内。该列表并不是排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员而言将是明显的。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一种或更多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的mart-1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其他靶分子属于转化相关分子(例如致癌基因her-2/neu/erbb-2)的组。另一组靶抗原是癌-胚抗原(onco-fetalantigen)例如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型(idiotype)免疫球蛋白构成对个体肿瘤独特的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。b细胞分化抗原例如cd19、cd20、cd22和cd37是b细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(cea、her-2、cd19、cd20、cd22，独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但成效有限。
肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa对于肿瘤细胞是独特的，并且不会在体内的其他细胞上出现。taa对于肿瘤细胞并不是独特的，相反在不能诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。当免疫系统不成熟并且不能应答时，taa可以是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是在正常细胞中通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
tsa或taa的非限制性实例包括以下：分化抗原例如mart-1/melana(mart-1)、gp100(pmei17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2和肿瘤特异性多谱系抗原例如mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、p15；过表达的胚胎抗原例如cea；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因例如p53、ras、her-2/neu；由染色体易位造成的独特的肿瘤抗原；例如bcr-abl、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；和病毒抗原例如eb病毒抗原ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其他大的基于蛋白质的抗原包括tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、nm-23h1、psa、tag-72、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、β-连环蛋白、cdk4、mum-1、p15、p16、43-9f、5t4、791tgp72、α甲胎蛋白、β-hcg、bca225、btaa、ca125、ca15-3/ca27.29/bcaa、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\p1、co-029、fgf-5、g250、ga733\epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90\mac-2结合蛋白\亲环蛋白c-相关蛋白、taal6、tag72、tlp和tps。
在一个优选的实施方案中，car的抗原结合结构域部分靶向包括但不限于以下的抗原：cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、my-eso-1tcr、magea3tcr等。
根据待靶向的期望的抗原，可以工程化改造car以包含对所期望的抗原靶标特异性的适当的抗原结合结构域。例如，如果cd19是待靶向的期望的抗原，则可以使用cd19的抗体作为抗原结合结构域并入car中。
在一个示例性实施方案中，car的抗原结合结构域部分靶向cd19。优选地，car中的抗原结合结构域是抗cd19scfv，其中抗cd19scfv的核酸序列包含seqidno：27中所示的序列。在一个实施方案中，抗cd19scfv包含编码seqidno：28的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，car的抗cd19scfv部分包含seqidno：28中所示的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，提供了能够与非tsa或非taa结合的car，所述非tsa或非taa包括例如但不限于：来源于逆转录病毒科(retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒例如hiv-1和hiv-lp)、小核糖核酸病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科[例如1型和2型单纯疱疹病毒(hsv)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)和疱疹病毒]、痘病毒科(例如，天花病毒、牛痘病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒，或其任何组合的抗原。
在本发明的另一方面，提供了能够与来自葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococcus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、假单胞菌(pseudomonas)或沙门氏菌(salmonella)的细菌菌株的抗原结合的car。特别地，提供了能够与来自感染性细菌(例如幽门螺杆菌(helicobacterpyloris)、嗜肺军团菌(legionellapneumophilia)、分枝杆菌属细菌菌株(例如，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、m.kansaii或m.gordonea))金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitides)、单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、a组链球菌、b组链球菌(无乳链球菌)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)或破伤风梭菌(clostridiumtetani)，或其组合的抗原结合的car。
2.跨膜结构域
在本文中公开的用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体中的car中，car包含一个或更多个与car的胞外结构域融合的跨膜结构域。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中编码的接头结构域来源于cd8的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中编码的接头结构域来源于跨膜结构域的胞外结构域，并与跨膜结构域连接。
在一些情况下，可以选择跨膜结构域或通过氨基酸替换来避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可以来源于(即，包含至少以下的跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd271、tnfrsf19。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个末端发现。任选地，短的寡肽接头或多肽接头，优选2至10个氨基酸长度可以在car的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，本发明的car中的跨膜结构域是cd8跨膜结构域。在一个实施方案中，cd8跨膜结构域包含seqidno：11的核酸序列。在一个实施方案中，cd8跨膜结构域包含编码seqidno：12的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，cd8跨膜结构域包含seqidno：12的氨基酸序列。
在一些情况下，car的跨膜结构域包含cd8.α.铰链结构域。在一个实施方案中，cd8铰链结构域包含seqidno：13的核酸序列。在一个实施方案中，cd8铰链结构域包含编码seqidno：14的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，cd8铰链结构域包含seqidno：14的氨基酸序列。
不旨在限制任何特定的作用机制，认为与如本发明的本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体中使用的示例性car有关的增强的治疗功能的可能原因在于，包括例如但不限于：a)质膜内的改进的横向运动允许更有效的信号转导，b)质膜微结构域(例如脂筏)内的优越位置以及更好的与t细胞活化相关的跨膜信号级联相互作用的能力，c)通过优先移动而远离抑制性或下调性相互作用(例如较少接近或与例如cd45的磷酸酶相互作用)的质膜内的优异位置，以及d)优异组装成t细胞受体信号传导复合物(即，免疫突触)，或其任何组合。
在本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的一个实施方案中，可使用用于本文中公开的car的非限制性示例性跨膜结构域(包括tnfrsf16和tnfrsf19跨膜结构域)来获得如2015年10月9日提交的标题为chimericantigenreceptorsandmethodsofuse的申请人的共同未决临时专利申请no.62/239,509中所公开的并且转让给miltenyibiotechtechnology，inc.的物质号len_015pro的tnfrsf跨膜结构域和/或接头或间隔子结构域，包括，特别是其中如表1中列出的肿瘤坏死因子受体超家族中列出的那些其他tnfrsf成员。
3.间隔子结构域
在本文中所公开的用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car中，可以在胞外结构域和tnfrsf跨膜结构域之间，或胞内结构域和tnfrsf跨膜结构域之间布置间隔子结构域。间隔子结构域意指用于将tnfrsf跨膜结构域与胞外结构域和/或tnfrsf跨膜结构域与胞内结构域连接的任何寡肽或多肽。间隔子结构域包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。
在数个实施方案中，接头可以包括间隔子元件，其在存在时增加接头的大小，使得效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离增加。示例性间隔子是本领域普通技术人员已知的，并包括在美国专利号7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414以及美国专利公开号20110212088和20110070248中所列出的那些，其各自通过引用整体并入本文。
间隔子结构域优选具有促进car与抗原结合并增强信号传导进入细胞的序列。预期促进结合的氨基酸的实例包括在可能的糖基化位点中的半胱氨酸(一种带电荷的氨基酸)以及丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可以用作构成间隔子结构域的氨基酸。
作为间隔子结构域，可以使用为cd8.α(ncbirefseq：np.sub.--001759.3)的铰链区的第118至178位氨基酸(seqidno：15)的全部或一部分，cd8.β(genbank：aaa35664.1)的第135至195氨基酸，cd4(ncbirefseq.np.sub.--000607.1)的第315至396位氨基酸，或cd28(ncbirefseq.np.sub.--006130.1)的第137至152位氨基酸。此外，作为间隔子结构域，可以使用抗体h链或l链(ch1区或cl区，例如，具有seqidno.：16所示氨基酸序列的肽)的恒定区的一部分。此外，间隔子结构域可以是人工合成的序列。
此外，在car中，信号肽序列可以与n末端连接。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的n末端，长度为15至30个氨基酸。由于上述作为胞内结构域的许多蛋白质分子具有信号肽序列，信号肽可以用作car的信号肽。在一个实施方案中，信号肽包含seqidno：6中所示的氨基酸序列。
4.胞内结构域
car的胞质结构域或其他胞内信号传导结构域负责活化其中已置入car的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白质的部分。尽管通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于car中的胞内信号传导结构域的优选实例包括t细胞受体(tcr)的胞质序列和在抗原受体接合后共同起作用以引发信号转导的共同受体，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能性能力的任何合成序列。
已知仅通过tcr产生的信号不足以完全活化t细胞并且还需要第二信号或共刺激信号。因此，可以说t细胞活化是由两种不同类型的胞质信号传导序列介导的：通过tcr引发抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif)的信号传导基序。
特别用于本文中公开的cars中的含有itam的初级胞质信号传导序列的实例包括来源于tcrζ(cd3ζ)、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。itam的具体的非限制性实例包括具有以下序列的多肽：cd3ζ(ncbirefseq：np.sub.--932170.1)的第51至164位氨基酸，fc.ε.ri.γ(ncbirefseq：np.sub.--004097.1)的第45至86氨基酸，fc.ε.ri.β(ncbirefseq：np.sub.--000130.1)的第201至244位氨基酸，cd3.γ(ncblrefseq：np.sub.--000064.1)的第139至182位氨基酸，cd3δ(ncbirefseq：np.sub.--000723.1)的第128至171位氨基酸，cd3.ε(ncbirefseq：np.sub.--000724.1)的第153至207位氨基酸，cd5(ncbirefseq：np.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，0022(ncbirefseq：np.sub.--001762.2)的第707至847位氨基酸，cd79a(ncbirefseq：np.sub._001774.1)的第166至226位氨基酸，cd79b(ncbirefseq：np.sub._000617.1)的第182至229位氨基酸，cd66d(ncbirefseq：np.sub._001806.2)的第177至252位氨基酸，以及与这些肽具有相同功能的它们的变体。基于本文中所述的ncbirefseqid或genbank的氨基酸序列信息的氨基酸号是基于每种蛋白质的前体(包含信号肽序列等)的全长进行编号。在一个实施方案中，car中的胞质信号传导分子包含来源于cd3ζ的胞质信号传导序列。
在一个优选的实施方案中，可以将car的胞内结构域设计为自身包含cd3-ζ信号传导结构域，或者将其与在car的情况下可用的任何其他期望的胞质结构域组合。例如，car的胞内结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内结构域的car的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外，淋巴细胞对抗原有效应答所需的细胞表面分子。这样的共刺激分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体等。这样的共刺激分子的具体非限制性实例包括具有以下序列的多肽：cd2((ncbirefseq：np.sub.--001758.2)的236至351位氨基酸，cd4(ncbirefseq：np.sub.--000607.1)的第421至458位氨基酸，cd5(ncbirefseq：np.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，cd8.α.(ncbirefseq：np.sub.--001759.3)的第207至235氨基酸，cd83(genbank：aaa35664.1)的第196至210位氨基酸，cd28(ncbirefseq：np.sub.--006130.1)的第181至220位氨基酸，cd137(4-1bb，ncbirefseq：np.sub.--001552.2)的第214至255氨基酸，cd134(ox40，ncbirefseq：np.sub.--003318.1)的第241至277位氨基酸和icos(ncbirefseq：np.sub.--036224.1)的第166至199位氨基酸，以及与这些肽相具有同功能的它们的变体。因此，尽管本文中的公开内容主要以4-1bb作为共刺激信号传导元件来举例说明，但其他共刺激元件也在本公开内容的范围内。
car的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选在2至10个氨基酸长度之间)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，胞内结构域被设计为包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计为包含cd3-ζ的信号传导结构域和4-1bb的信号传导结构域。在又一个实施方案中，胞内结构域被设计为包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd28和4-1bb的信号传导结构域。
在一个实施方案中，car中的胞内结构域被设计为包含4-1bb的信号传导结构域和cd3-ζ的信号传导结构域，其中4-1bb的信号传导结构域包含seqidno：17中所示的核酸序列并且cd3-ζ的信号传导结构域包含seqidno：19中所示的核酸序列。
在一个实施方案中，car中的胞内结构域被设计成包含4-1bb的信号传导结构域和cd3-ζ的信号传导结构域，其中4-1bb的信号传导结构域包含编码seqidno：18的氨基酸序列的核酸序列并且cd3-ζ的信号传导结构域包含编码seqidno：20的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，car中的胞内结构域被设计成包含4-1bb的信号传导结构域和cd3-ζ的信号传导结构域，其中4-1bb的信号传导结构域包含seqidno：18所示的氨基酸序列并且cd3-ζ的信号传导结构域包含seqidno：20所示的氨基酸序列。
5.car的附加描述
本发明范围内还明确包括用于本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体中的car的功能性部分。当在提及car使用时，术语“功能性部分”是指本文中所公开的一个或更多个car的任何部分或片段，所述部分或片段保留作为其一部分的car(亲本car)的生物学活性。功能性部分包括例如，与亲本car在相似程度上，或在相同程度上，或在更高程度上保留识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的car的那些部分。提及亲本car，功能性部分可以包含例如亲本car的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能性部分可以在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含额外的氨基酸，所述额外的氨基酸在亲本car的氨基酸序列中没有发现。期望地，额外的氨基酸不干扰功能性部分的生物学功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本car的生物学活性相比，额外的氨基酸增强了生物学活性。
包括在本公开内容的范围内的是本文中公开的car的功能性变体。如本文中使用的术语“功能性变体”是指与亲本car具有实质或显著序列同一性或相似性的car、多肽或蛋白质，所述功能性变体保留其变体car的生物学活性。功能性变体包括，例如，本文中所述的car(亲本car)的那些变体，其与亲本car在相似程度、相同程度或更高程度上保留识别靶细胞的能力。提及亲本car，功能性变体可以例如与亲本car在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多的同一性。
功能性变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸替换的亲本car的氨基酸序列。替选地或另外地，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸替换的亲本car的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸替换不干扰或抑制功能性变体的生物学活性。非保守氨基酸替换可以增强功能性变体的生物学活性，以使得与亲本car相比，功能性变体的生物学活性提高。
car的氨基酸替换优选为保守的氨基酸替换。保守的氨基酸替换是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸替换，其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理性质的另一个氨基酸。例如，保守的氨基酸替换可以是酸性/带负电的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电的极性氨基酸(例如，asp或glu)，具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，ala、gly、val、he、leu、met、phe、pro、trp、cys、val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，lys、his、arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，asn、gin、ser、thr、tyr等)，具有β分支侧链的氨基酸替换另一个具有β分支侧链的氨基酸(例如，he、thr和val)，具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，his、phe、trp和tyr)等。
car可以基本上由本文中所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他氨基酸)实质上不改变功能性变体的生物学活性。
car(包括功能性部分和功能性变体)可以具有任何长度，即，可以包含任何数目的氨基酸，条件是car(或其功能性部分或功能性变体)保留其生物学活性，例如，与抗原特异性结合、检测哺乳动物中的患病细胞，或治疗或预防哺乳动物中的疾病等的能力。例如，car可以是约50至约5000个氨基酸长，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
car(包括本发明的功能性部分和功能性变体)可以包含合成氨基酸来代替一种或更多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、氨基正癸酸、高丝氨酸、s-乙酰氨基甲基-半胱氨酸，反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、n′-苄基-n′-甲基-赖氨酸、n′，n′-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
可以通过例如二硫桥将car(包括功能性部分和功能性变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、n-酰化、环化或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合，或缀合。
可以通过本领域已知的方法获得car(包括其功能性部分和功能性变体)。car可以通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适方法描述于参考文献中，例如chan等，fmocsolidphasepeptidesynthesis，oxforduniversitypress，oxford，unitedkingdom，2000；peptideandproteindruganalysis，编辑.reid，r.，marceldekker，inc.，2000；epitopemapping，编辑.westwood等，oxforduniversitypress，oxford，unitedkingdom，2001；和u.s.专利5,449,752。产生嵌合抗原受体，包括该受体的t细胞的方法及其用途(例如，用于治疗癌症)的方法是本领域已知的并且在本文中进一步描述(参见，例如，brentjens等，2010，moleculartherapy，18：4，666-668；morgan等，2010，moleculartherapy，2010年2月23日在线公开，2010，第1至9页；till等，2008，blood，112：2261-2271；park等，trendsbiotechnol.，29：550-557，2011；grupp等，nengljmed.，368：1509-1518，2013；han等，j.hematoloncol.，6：47，2013；tumaini等，cytotherapy，15，1406-1417，2013；haso等，(2013)blood，121，1165-1174；pct公开wo2012/079000、wo2013/126726；和美国公开2012/0213783，其各自通过引用整体并入本文)。例如，编码公开的嵌合抗原结合受体的核酸分子可包括在用于转导宿主细胞(例如t细胞)的表达载体(例如慢病毒载体)中以制备所公开的car。在一些实施方案中，使用嵌合抗原受体的方法包括从对象中分离t细胞、用编码嵌合抗原受体的表达载体(例如慢病毒载体)转导t细胞，并向对象施用表达car的t细胞进行治疗，例如用于在对象中治疗肿瘤。
b.抗体和抗原结合片段
一个实施方案还提供了用于本文中公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car、表达car的t细胞、与本文中公开的一个或更多个抗原特异性结合的抗体或其抗原结合结构域或其部分。如本文中使用的“表达car的t细胞”或“cart细胞”是指表达car的t细胞，并且具有通过例如car的抗体来源的靶向结构域确定的抗原特异性。
如本文使用的“抗原结合结构域”可以包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和其抗原结合片段，只要它们显示出所期望的抗原结合活性。抗体的非限制性实例包括例如保留对抗原的结合亲和力的本领域已知的完整的免疫球蛋白以及其变体和片段。
“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变以外，包含该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。修饰语“单克隆的”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。在一些实例中，单克隆抗体是由b淋巴细胞或已经被编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体的轻链和重链可变区的核酸转染的细胞或其后代的单个克隆产生的抗体。在一些实例中，从对象分离单克隆抗体。单克隆抗体可具有保守的氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本无影响。生产单克隆抗体的示例性方法是已知的，例如，参见harlow&lane，antibodies，alaboratorymanual，第2版.coldspringharborpublications，newyork(2013)。
通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(h)和轻链(l)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变结构域基因。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。存在五种主要的重链种类(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。
每个重链和轻链含有恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域；参见，例如kindt等kubyimmunology，6.sup.thed.，w.h.freeman和co.，第91页(2007))。在数个实施方案中，重链和轻链可变区组合以特异性结合抗原。在另外的一些实施方案中，仅需要重链可变区。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是有功能的和稳定的(参见，例如，hamers-casterman等，nature，363：446-448，1993；sheriff等，nat.struct.biol.，3：733-736，1996)。提及“vh”或“vh”是指抗体重链的可变区，包括抗原结合片段，例如fv、scfv、dsfv或fab的可变区。提及“vl”或“vl”是指抗体轻链的可变结构域，包括fv、scfv、dsfv或fab的可变结构域。
轻链和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“cdr”)中断的“框架”区(参见，例如，kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区(即组成型轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和排列cdr。
cdr主要负责与抗原的表位结合。给定cdr的氨基酸序列边界可以使用许多公知的方案中的任一种来容易地确定，包括由kabat等描述的那些(“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，”第5版.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1991；“kabat”编号方案)，al-lazikani等，(jmb273，927-948，1997；“chothia”编号方案)，和lefranc等，(“imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomains，”dev.comp.immunol.，27：55-77，2003；“imgt”编号方案)。每条链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3(从n末端到c末端)，并且通常也由其中特定cdr所定位的链来鉴定。因此，vhcdr3是来自其中位于所在抗体的重链的可变结构域的cdr3，而vlcdr1是其中位于所在抗体的轻链的可变结构域的cdr1。轻链cdr有时被称为lcdr1、lcdr2和lcdr3。重链cdr有时被称为lcdr1、lcdr2和lcdr3。
“抗原结合片段”是保留了特异性识别同源抗原的能力的全长抗体的一部分以及这些部分的多种组合。抗原结合片段的非限制性实例包括fv、fab、fab′、fab′-sh、f(ab′)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰完整抗体产生的抗原结合片段或使用重组dna方法从头合成的抗原结合片段(参见，例如，kontermann和dubel(编)，antibodyengineering，第1至2卷，第2版，springerpress，2010)。
单链抗体(scfv)是含有一个或更多个抗体的vh和vl结构域的遗传工程化分子，所述一个或更多个抗体通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子(参见，例如，bird等，science，242：423426，1988；huston等，proc.natl.acad.sci.，85：58795883，1988；ahmad等，clin.dev.immunol.，2012，doi：10.1155/2012/980250；marbry，idrugs，13：543-549，2010)。scfv中的vh结构域和vl结构域的分子内定向对于scfv通常不是决定性的。因此，可以使用具有两种可能的排列(vh-结构域-接头结构域-vl-结构域；vl-结构域-接头结构域-vh-结构域)的scfv。
在dsfv中，重链和轻链可变链已被突变以引入二硫键从而稳定链的缔合。还包括双体抗体，其是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但是使用太短而不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，holliger等，proc.natl.acad.sci.，90：64446448，1993；poljak等，structure，2：11211123，1994)。
抗体还包括遗传工程形式例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。另参见piercecatalogandhandbook，1994-1995(piercechemicalco.，rockford，il)；kuby，j.，immunology，第3版.，w.h.freeman&co.，newyork，1997。
非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生，或者可以例如如huse等，science246：1275-1281(1989)(其通过引入并入本文)所述通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库而获得。制备例如嵌合的、人源化的、cdr移植的、单链和双功能性抗体的这些和其他方法是本领域技术人员熟知的(winter和harris，immunol.today14：243-246(1993)；ward等，nature341：544-546(1989)；harlow和lane，见上文，1988；hilyard等，proteinengineering：apracticalapproach(irlpress1992)；borrabeek，antibodyengineering，第2版.(oxforduniversitypress1995)；其各自通过引用并入本文。
“与相同表位结合的抗体”作为参照抗体是指在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原的结合50％或更多的抗体，反之，参照抗体在竞争性测定中阻断抗体与其抗原结合50％或更多。抗体竞争测定是已知的，并且本文中提供了示例性的竞争测定。
“人源化”抗体或抗原结合片段包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的一个或更多个cdr。提供cdr的非人抗体或抗原结合片段被称为“供体”，而提供框架的人抗体或抗原结合片段被称为“接受者”。在一个实施方案中，所有cdr都来自人源化的免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但是如果存在的话，它们可以与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如至少约85％至90％，例如约95％或更高的同一性。因此，除了可能的cdr之外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分都与天然人抗体序列的相应部分基本上相同。
“嵌合抗体”是包括来源于两种不同抗体(其通常是不同的物种的)的序列的抗体。在一些实例中，嵌合抗体包括来自一个人抗体的一个或更多个cdr和/或框架区以及来自另一人抗体的cdr和/或框架区。
“完全人抗体”或“人抗体”是包括来自(或来源于)人基因组的序列的抗体，但不包括来自另一物种的序列。在一些实施方案中，人抗体包括来自(或来源于)人基因组的cdr、框架区和fc区(如果存在的话)。人抗体可以使用用于基于来源于人基因组的序列产生抗体的技术来鉴定和分离，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物(参见，例如，barbas等phagedisplay：alaboratorymanuel.第1版.newyork：coldspringharborlaboratorypress，2004.print.；lonberg，nat.biotech.，23：1117-1125，2005；lonenberg，curr.opin.immunol.，20：450-459，2008)。
抗体可以具有一个或更多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或者可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。
测试抗体结合car的任何功能性部分的能力的方法是本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(ria)、elisa、western印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定法(参见，例如，janeway等，见下文，美国专利申请公开号2002/0197266a1和美国专利号7,338,929)。
此外，car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分可以包含可检测标记，例如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
c.缀合物
可使用任意数目的本领域技术人员已知的方法将用于本文公开的活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car、表达car的t细胞、或对本文公开的一种或更多种抗原具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段与试剂如效应分子或可检测标志物缀合。可使用共价连接方式和非共价连接方式两者。缀合物包括但不限于其中存在效应分子或可检测标志物与同本文公开的一种或更多种抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段的共价连接的分子。本领域技术人员将理解，可使用多种效应分子和可检测标志物，包括(但不限于)化学治疗剂、抗血管生成剂、毒素、放射性试剂如125i、32p、14c、3h和35s及其他标记、靶部分和配体等。
特定效应分子或可检测标志物的选择取决于特定的靶分子或细胞以及期望的生物学效应。因此，例如，效应分子可以是用于导致特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。
用于将效应分子或可检测标志物附接至抗体或抗原结合片段的方法根据效应子的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；例如羧酸(cooh)、游离胺(-nh2)或巯基(-sh)基团，其可用于与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子或可检测标志物的结合。或者，将抗体或抗原结合片段衍生化以暴露或附接另外的反应性官能团。衍生化可涉及附接若干已知接头分子(例如，可获自piercechemicalcompany，rockford，il的那些)中的任意一种。接头可以是用于将抗体或抗原结合片段连接至效应分子或可检测标志物的任何分子。接头能够与抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物形成共价键。合适的接头是本领域技术人员熟知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物是多肽时，接头可以通过其侧基连接至组成氨基酸(例如通过二硫键连接至半胱氨酸)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在多个实施方案中，接头可以包括间隔子元件，其在存在时增加接头的大小，从而增加效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离。示例性间隔子是本领域普通技术人员已知的，包括以下中列出的那些：美国专利号7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414，以及美国专利公开号20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，使得在细胞内环境下接头的切割从抗体或抗原结合片段释放效应分子或可检测标志物。在另一些实施方案中，接头不可切割，并且例如通过抗体降解释放效应分子或可检测标志物。在一些实施方案中，接头可被存在于细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝(caveolea)内)中的切割剂切割。接头可以是例如肽接头，其被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割。在一些实施方案中，肽接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。然而，接头可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长，例如1至2、1至3、2至5、3至10、3至15、1至5、1至10、1至15个氨基酸长。蛋白酶可以包括组织蛋白酶b和d以及纤溶酶，已知所有这些均水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见例如dubowchik和walker，1999，pharm.therapeutics83：67-123)。例如，可使用可被巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶b切割的肽接头(例如，苯丙氨酸-亮氨酸或甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸接头)。这样的接头的其他实例描述在例如美国专利号6,214,345中，其通过引用并入本文。在一个具体的实施方案中，可被胞内蛋白酶切割的肽接头是缬氨酸-瓜氨酸接头或苯丙氨酸-赖氨酸接头(参见例如美国专利号6,214,345，其描述了具有缬氨酸-瓜氨酸接头的多柔比星的合成)。
在另一些实施方案中，可切割接头是ph敏感的，即在某些ph值下对水解敏感。通常，ph敏感接头在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见例如美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929；dubowchik和walker,1999，pharm.therapeutics83：67-123；neville等，1989，biol.chem.264：14653-14661.)。这样的接头在中性ph条件(例如在血液中)下相对稳定，但在低于ph5.5或5.0(溶酶体的近似ph)时不稳定。在某些实施方案中，可水解接头是硫醚接头(例如，通过酰腙键与治疗剂连接的硫醚(参见例如美国专利号5,622,929)。
在另一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域中已知的，包括例如使用以下可形成的那些：sata(n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫代乙酸酯)、spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、spdb和smpt。(参见例如thorpe等，1987，cancerres.47：5924-5931；wawrzynczak等，inimmunoconjugates：antibodyconjugatesinradioimageryandtherapyofcancer(c.w.vogel编辑，oxfordu.press，1987)；phillips等，cancerres.68：92809290，2008).还参见美国专利号4,880,935)。
在另一些具体的实施方案中，接头是丙二酸酯接头(johnson等，1995，anticancerres.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(lau等，1995，bioorg-med-chem.3(10)：1299-1304)或3′-n-酰胺类似物(lau等，1995，bioorg-med-chem.3(10)：1305-12)。
在另一些实施方案中，接头不可切割，并且通过抗体降解释放效应分子或可检测标志物(参见美国公开号2005/0238649，其通过引用整体并入本文)。
在多个实施方案中，接头对胞外环境中的切割具有抗性。例如，当缀合物存在于胞外环境(例如血浆)中时，缀合物的样品中不大于约20％、不大于约15％、不大于约10％、不大于约5％、不大于约3％、或不大于约1％的接头被切割。可以例如通过将包含目标接头的缀合物与血浆孵育预定时间段(例如，2、4、8、16或24小时)然后定量血浆中存在的游离效应分子或可检测标志物的量来确定接头是否对胞外环境中的切割具有抗性。可以用在缀合物中的多种示例性接头描述在wo2004-010957、美国公开号2006/0074008、美国公开号20050238649和美国公开号2006/0024317中，其各自通过引用整体并入本文。
在多个实施方案中，提供了car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分与一种或更多种小分子毒素(例如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞斯他汀(auristatin)、单端孢菌烯(trichothecene)和cc1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
适合用作美登木素生物碱毒素部分的美登素化合物是本领域公知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离，使用基因工程技术产生(参见yu等(2002)pnas99：7968-7973)，或根据已知方法合成制备美登醇和美登醇类似物。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首先从东非灌木maytenusserrata分离(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和c-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物例如公开以下中：美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533，其各自通过引用并入本文。包含美登木素生物碱的缀合物、其制备方法及其治疗用途公开在例如美国专利公开号5,208,020、5,416,064、6,441,163以及欧洲专利ep0425235b1中，其同开内容明确地通过引用并入本文。
另外的毒素可与car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分一起使用。示例性毒素包括假单胞菌外毒素(pe)、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素及其亚基、核毒素(ribotoxin)、核糖核酸酶、皂草素和加利车霉素以及肉毒杆菌毒素a至f。这些毒素是本领域中周知的，并且许多可从商业来源容易地获得(例如sigmachemicalcompany，st.louis，mo)。所考虑的毒素还包括毒素的变体(参见，例如，参见美国专利号5,079,163和4,689,401)。
皂草素是来自石碱草(saponariaofficinalis)的毒素，其通过使核糖体复合物的60s部分失活而破坏蛋白质合成(stirpe等，bio/technology，10：405-412，1992)。然而，毒素不具有特异性进入细胞的机制，因此需要与识别细胞表面蛋白质的抗体或抗原结合片段结合，所述细胞表面蛋白质被内化以被细胞有效摄取。
白喉毒素分离自白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)。通常，使用于免疫毒素的白喉毒素突变以降低或消除非特异性毒性。具有完全酶活性但显著降低的非特异性毒性的crm107突变体自二十世纪七十年代就已知(laird和groman，j.virol.19：220，1976)，并已被用于人临床试验。参见美国专利号5,792,458和美国专利号5,208,021。
蓖麻毒素是来自蓖麻(ricinuscommunis)(蓖麻籽)的凝集素rca60。对于蓖麻毒素的实例，参见美国专利号5,079,163和美国专利号4,689,401。根据其分子量分别为约65和120kd(nicholson&blaustein，j.biochim.biophys.acta266：543，1972)，蓖麻凝集素(rca)以被称为rca60和rca120的两种形式存在。a链负责灭活蛋白质合成和杀死细胞。b链使蓖麻毒素与细胞表面半乳糖残基结合，并有助于a链转运到细胞质基质中(olsnes等，nature249：627-631，1974和美国专利号3,060,165)。
核糖核酸酶也与靶向分子结合以用作免疫毒素(参见suzuki等，nat.biotech.17：265-70，1999)。示例性核毒素如α-八叠球菌(α-sarein)和局限曲菌素(restrictocin)在例如rathore等，gene190：31-5，1997；andgoyalandbatra，biochem.345pt2：247-54，2000中讨论。加利车霉素首次分离自棘孢小单孢(micromonosporaechinospora)，并且是烯二炔类抗肿瘤抗生素家族的成员，其造成dna双链断裂，导致凋亡(参见例如lee等，j.antibiot.42：1070-87，1989)。该药物是临床试验中免疫毒素的毒性部分(参见例如gillespie等，ann.oncol.11：735-41，2000)。
相思豆毒素包含来自相思豆(abrusprecatorius)的毒性凝集素。毒素原理，相思豆毒素a、b、c和d的分子量为约63至67kd，并且由两个二硫键连接的多肽链a和b组成。a链抑制蛋白质合成；b链(相思豆毒素-b)与d-半乳糖残基结合(参见funatsu等，agr.biol.chem.52：1095，1988；和olsnes，methodsenzymol.50：330-335，1978)。
用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car、表达car的t细胞、对本文公开的一种或更多种抗原具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段也可与可检测标志物缀合；例如能够通过elisa、分光光度法、流式细胞术、显微镜检查或诊断成像技术(例如计算机断层扫描(ct)、计算机轴向断层扫描(cat)扫描、磁共振成像(mri)、核磁共振成像nmri)、磁共振断层扫描(mtr)、超声、纤维镜检查和腹腔镜检查)检测的可检测标志物。可检测标志物的具体的非限制性实例包括荧光团、化学发光剂，酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过mri检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。生物发光标记也是有用的，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)。car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分也可与可用于检测的酶缀合，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当car、表达car的t细胞、抗体或其抗原与可检测酶结合时，可通过添加该酶用来产生可辨别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生视觉上可检测的有色反应产物。car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分也可与生物素结合，并通过间接测量抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合来检测。应该注意的是，抗生物素蛋白本身可与酶或荧光标记缀合。
car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分可与顺磁性试剂如钆缀合。顺磁性试剂如超顺磁性氧化铁也可用作标记。抗体也可与镧系元素(例如铕和镝)和锰结合。抗体或抗原结合片段还可用被第二报道物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。
car、表达car的t细胞、抗体或其抗原结合部分也可与放射性标记的氨基酸缀合。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过x射线、发射光谱或其他诊断技术来检测本文公开的一种或更多种抗原和表达抗原的细胞。此外，放射性标记可以在治疗上用作毒素以用于治疗对象中的肿瘤，例如用于治疗成神经细胞瘤。多肽标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3h、14c、15n、35s、90y、99te、111in、125i、131i.
检测这种可检测标志物的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用光电检测器检测荧光标记以检测发射的照射。通常通过向酶提供底物并检测酶在底物上作用产生的反应产物来检测酶标记，并通过简单地显现有色标记来检测比色标记。
d.核苷酸、表达、载体和宿主细胞
本发明的实施方案还提供了核酸，所述核酸包含编码本文所述的任何car、抗体或其抗原结合部分(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列。本发明的核酸可包含编码本文所述的任何前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或胞内t细胞信号传导结构域的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子，其从n端到c端包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含抗体的与抗原结合的至少一个单链可变片段。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含抗体的与抗原结合的至少一个重链可变区。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的car胞外抗原结合结构域包含与抗原结合的至少一个基于脂质运载蛋白的抗原结合抗原(anticalin)。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域通过接头结构域连接到跨膜结构域。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域的前面是编码前导或信号肽的序列。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域靶向抗原，所述抗原包括但不限于：cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33/il3ra、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、magea3tcr或其任意组合。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的某些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含抗cd19scfv抗原结合结构域、抗cd20scfv抗原结合结构域、抗cd22scfv抗原结合结构域、抗ror1scfv抗原结合结构域、抗tslprscfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33/il3rascfv抗原结合结构域、抗cd38scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2scfv抗原结合结构域、抗gpc3scfv抗原结合结构域、抗fgfr4scfv抗原结合结构域、抗c-metscfv抗原结合结构域、抗pmsascfv抗原结合结构域、抗糖脂f77scfv抗原结合结构域、抗egfrvihscfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcrscfv抗原结合结构域、抗magea3tcrscfv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个方面中，本文提供的car还包含接头结构域。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中胞外抗原结合结构域、胞内信号传导结构域或其两者通过接头结构域连接到跨膜结构域。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的接头结构域来自cd8的胞外结构域，并且连接到跨膜结构域。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码跨膜结构域的核酸序列包括其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含含有至少一个但不超过10个修饰的氨基酸序列，或其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的car还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154或其组合。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域还包含cd3ζ胞内结构域。
在本文公开的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域相对于cd3ζ胞内结构域设置在c末端侧。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、主要信号传导结构域或其组合。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的另一些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)或其组合。
在用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car的一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其还包含前导序列或信号肽序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列可以是密码子修饰的。不受特定理论的约束，认为核苷酸序列的密码子优化提高了mrna转录本的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及将天然密码子替换成编码相同氨基酸但可被细胞内更容易获得的trna翻译的另一密码子，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可减少干扰翻译的二级mrna结构，从而提高翻译效率。
在本发明的一个实施方案中，核酸可包含编码本发明car的抗原结合结构域的经密码子修饰的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，核酸可包含编码本文所述的任何car(包括其功能部分和功能变体)的经密码子修饰的核苷酸序列。
本文中使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指dna或rna的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(分离和/或纯化)的，其可包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可包含天然、非天然或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，而不是存在于未经修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，如本文所讨论的，在一些情况下，可能合适的是核酸包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过两个序列区段的人工组合(否则的话其将是分开的)制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成完成，或者更常见地通过分离的核酸区段的人工操作，例如基因工程技术完成，例如sambrook等(同上)所述。可使用本领域已知的方法基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如sambrook等(同上)和ausubel等(同上)。例如，可使用天然存在的核苷酸或多种经修饰核苷酸来化学合成核酸，所述经修饰核苷酸被设计为提高分子的生物学稳定性或提高杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基queosine、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2--二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，本发明的一种或更多种核酸可从公司购买，例如integrateddnatechnologies(coralville，ia，usa)。
核酸可包含编码任何car或其功能部分或功能变体的任何分离的或纯化的核苷酸序列。或者，核苷酸序列可包含简并成任何序列或简并序列的组合的核苷酸序列。
实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高度严格条件下杂交。“高度严格条件”是指核苷酸序列与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交，其量比非特异性杂交可检测地更强。高度严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅含有少数分散错配的多核苷酸与碰巧具有少数与核苷酸序列匹配的小区域(例如，3至10个碱基)的随机序列区分开的条件。这样的互补小区域比14至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，高度严格杂交使得它们易于区分。相对高度严格条件将包括例如低盐和/或高温条件，例如通过在约50至70℃的温度由约0.02至0.1mnacl或等同物来提供。这样的高度严格条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间小的(如果有的话)错配，并且特别适合于检测任何本发明car的表达。通常认识到，通过添加提高量的甲酰胺可以使条件变得更加严格。
还提供了包含与本文所述的任何核酸具有至少约70％或更多，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，可以将核酸并入到重组表达载体中。在这一点上，实施方案提供了包含任何核酸的重组表达载体。为了本文的目的，术语“重组表达载体”是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mrna、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且在足以使mrna、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时，允许宿主细胞表达mrna、蛋白质、多肽或肽。载体作为整体不是天然存在的。
但是，载体的部分可以是天然存在的。重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于dna和rna，其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源获得的，并且其可包含天然、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接或两种类型的连接。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于其两者的载体，如质粒和病毒。载体可选自puc系列(fermentaslifesciences，glenburnie，md)、pbluescript系列(stratagene，lajolla，ca)、pet系列(novagen，madison，wi)、pgex系列(pharmaciabiotech，uppsala，sweden)和pex系列(clontech，paloalto，ca)。
也可使用噬菌体载体，例如
许多转染技术通常是本领域已知的(参见例如graham等，virology，52：456-467(1973)；sambrook等(同上)；davis等，basicmethodsinmolecularbiology，elsevier(1986)；以及chu等，gene，13：97(1981)。
转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见例如graham等，同上)，直接微量注射到培养的细胞中(参见例如capecchi，cell，22：479-488(1980))、电穿孔(参见例如shigekawa等，biotechniques，6：742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(参见例如mannino等，biotechniques，6：682-690(1988))、脂质介导的转导(参见例如feigner等，proc.natl.acad.sci.usa，84：7413-7417(1987))和使用高速微粒的核酸递送(参见例如klein等，nature，327：70-73(1987))。
在一个实施方案中，可使用以下中描述的标准重组dna技术来制备重组表达载体：例如，sambrook等，同上，和ausubel等，同上。可制备环状或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可以来自例如colel、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，如适当地，其对于将引入载体的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型是特异性的，并考虑载体是基于dna还是rna。重组表达载体可包含限制性位点以促进克隆。
重组表达载体可以包括一个或更多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主细胞。标记基因包含杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。用于本发明表达载体的合适标记基因包括例如新霉素/g418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可包含天然或非天然启动子，所述启动子与编码car的核苷酸序列(包括其功能部分及其功能变体)或与和编码car的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。启动子(例如，强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性)的选择在技术人员的普通技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域技术人员的技术范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
重组表达载体可以设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于它们两者。此外，可使重组表达载体用于组成型表达或用于诱导型表达。
此外，可使重组表达载体包含自杀基因。本文使用的术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达基因的细胞对试剂(例如，药物)的敏感性，并且当细胞接触或暴露于试剂时造成细胞死亡的基因。自杀基因是本领域中已知的(参见例如，suicidegenetherapy：methodsandreviews，springer，carolinej.(cancerresearchukcentreforcancertherapeutics，instituteofcancerresearch，sutton，surrey，uk)，humanapress，2004)，并且包括例如单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)基因、胞嘧啶脱氨酶(cytosinedaminase)、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
一个实施方案还提供了包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文使用的术语“宿主细胞”是指可包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即从生物体例如人直接分离的。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如dh5α大肠杆菌(e.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴vero细胞、cos细胞、hek293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞可以是原核细胞，例如dh5α细胞。为了产生重组car，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段，但宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。宿主细胞可以是t细胞。
为了本文的目的，t细胞可以是任何t细胞，例如培养的t细胞，如原代t细胞，或来自培养的t细胞系(例如jurkat、suptl等)的t细胞，或获自哺乳动物的t细胞。如果获自哺乳动物，则t细胞可获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。t细胞也可以是富集或纯化的。t细胞可以是人t细胞。t细胞可以是从人分离的t细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞，并且可以是任何发育阶段，包括但不限于cd4+/cd8+双阳性t细胞、cd4+辅助t细胞如th1和th2细胞、cd8+t细胞(例如，细胞毒t细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞等。t细胞可以是cd8+t细胞或cd4+t细胞。
在一个实施方案中，本文所述的car可用于合适的非t细胞。这样的细胞是具有免疫效应功能的细胞，例如nk细胞和由多能干细胞产生的t样细胞。
一个实施方案还提供了包含至少一个本文所述的宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以是异质群体，其包含含有本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞，此外还包含至少一个不含任何重组表达载体的其他细胞(例如宿主细胞，如t细胞)，或者t细胞以外的细胞，例如b细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。或者，细胞群体可以是基本上同质群体，其中群体主要包含(例如，基本上由其组成))含有重组表达载体的宿主细胞。群体也可以是细胞的克隆群体，其中群体的所有细胞都是含有重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，使得群体的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
可以分离和/或纯化car(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)。例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比体内天然环境中细胞的纯度更高的制备物。这样的宿主细胞可以例如通过标准纯化技术来生产。在一些实施方案中，纯化宿主细胞的制备物，使得宿主细胞占制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％、约70％或约80％，或者可以是约100％。
e.治疗方法
预期用于活性患者特异性自体抗肿瘤t细胞群体的car可用于治疗或预防哺乳动物疾病的方法中。在这点上，一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，包括向哺乳动物施用有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量的car、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和/或其抗原结合部分，和/或药物组合物。
一个实施方案还包括在施用本文公开的car之前淋巴对哺乳动物进行淋巴细胞消融(lymphodepleting)。淋巴细胞消融的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞消融化学治疗、清髓性淋巴细胞消融化学治疗、全身照射等。
为了其中施用宿主细胞或细胞群体的方法，细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。本文使用的同种异体是指来源于与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或两个以上的个体被认为是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以是基因上足够不同的以抗原性相互作用。本文使用的“自体”是指来自随后重新引入材料的同一个体的任何材料。
本文提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文使用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目(logomorpha)的哺乳动物，如兔。哺乳动物可来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者包括奇蹄目，包括马科(马)。哺乳动物可以是灵长目、ceboid或simoid(猴)，或者类人猿目(anthropoid)(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
对于方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任何：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如、膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如、非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、b慢性淋巴细胞白血病(cll)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)和伯基特淋巴瘤(burkitt′slymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
本文使用的术语“治疗”和“预防”以及源自其的词语不必需意味着100％或完全的治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果即可。在这一点上，所述方法可以提供对哺乳动物中癌症的任何量或任何水平的治疗或预防。
此外，由该方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防所治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或更多种病症或症状。而且，为了本文的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病症的发作。
另一个实施方案提供了检测哺乳动物中癌症的存在的方法，其包括：(a)使来自哺乳动物的包含一个或更多个细胞的样品与car、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和/或其抗原结合部分或药物组合物接触，从而形成复合物，(b)以及检测复合物，其中复合物的检出指示哺乳动物中癌症的存在。
样品可以通过任何合适的方法如活检或尸体剖检获得。活检是从个体中取出组织和/或细胞。这种取出可以是从个体收集组织和/或细胞，以便在取出的组织和/或细胞上进行实验。该实验可包括确定个体是否具有和/或患有某病症或疾病状态的实验。病症或疾病可以是例如癌症。
关于检测哺乳动物中增殖性病症(例如癌症)的存在的方法的实施方案，包含哺乳动物细胞的样品可以是包含全细胞、其裂解物或金细胞裂解物的级分(例如，细胞核或细胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
接触可以相对于哺乳动物在体外或体内发生。优选地，接触是体外的。
此外，复合物的检测可以通过本领域已知的许多方式进行。例如，可以用可检测标记如上文公开的放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)来标记本文公开的car、本文所述的多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或抗体或其抗原结合部分。
测试car识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域已知的。例如，clay等，j.immunol，163：507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(gm-csf)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)或白细胞介素2(il-2))的释放的方法。此外，可通过测量细胞的细胞毒性来评价car功能，如zhao等，j.immunol.174：4415-4423(2005)所述。
另一个实施方案提供了本发明的car、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物用于在哺乳动物中治疗或预防增殖性病症如癌症的用途。癌症可以是本文所述的任何癌症。
任何施用方法都可用于所公开的治疗剂，包括局部施用和全身施用。例如，可使用表面、经口、血管内如静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内和皮下施用。具体施用方式和剂量方案由主治医师考虑病例的详情(例如，对象、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择。在施用多于一种药剂或组合物的情况下，可使用一种或更多种施用途径；例如，化学治疗剂可经口施用，而抗体或抗原结合片段或缀合物或组合物可静脉内施用。施用方法包括注射，其中在无毒可药用载体如水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、固定油、油酸乙酯或脂质体中提供car、cart细胞、缀合物、抗体、抗原结合片段或组合物。在一些实施方案中，可使用所公开化合物的局部施用，例如通过将抗体或抗原结合片段施用到除去肿瘤的组织区域或怀疑易于发生肿瘤的区域。在一些实施方案中，包含治疗有效量的抗体或抗原结合片段的药物制剂的持续肿瘤内(或肿瘤旁)释放可能是有益的。在另一些实例中，将缀合物作为滴眼剂局部施用到角膜，或经玻璃体内施用到眼内。
所公开的治疗剂可以配制成适合精确剂量的单独施用的单位剂型。另外，所公开的治疗剂可以以单剂量或多剂量方案施用。多剂量方案是其中主要治疗过程可以具有多于一个分开的剂量，例如1-10个剂量，然后根据需要以随后的时间间隔给予其他剂量以维持或加强组合物的作用的方案。治疗可以涉及几天到几个月甚至几年的每日或每天多次的化合物剂量。因此，剂量方案还将至少部分地基于待治疗的对象的特定需求来确定，并将取决于施用医师的判断。
抗体或缀合物的典型剂量可以为约0.01至约30mg/kg，例如约0.1至约10mg/kg。
在一些特定实例中，以多个每日给药方案，例如至少两个连续日，10个连续日等，例如数周、数月或数年的时间段，向对象施用包含缀合物、抗体、组合物、car、cart细胞或额外的药剂中的一种或更多种的治疗组合物。在一个实例中，向对象施用缀合物、抗体、组合物或额外的药剂至少30天，例如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月的时间段。
在一些实施方案中，公开的方法包括与所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、car或表达car的t细胞组合，向对象提供手术、放射治疗和/或化学治疗(例如，连续地、基本上同时、或同时)。这些药剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可以由熟练的临床医生确定。额外的药剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由熟练的从业人员根据经验确定。此类化学治疗的制备和给药方案也描述在chemotherapyservice，(1992)ed.，m.c.perry，williams&wilkins，baltimore，md中。
在一些实施方案中，组合疗法可以包括向对象施用治疗有效量的额外的癌症抑制剂。可与组合疗法一起使用的其他治疗剂的非限制性实例包括微管结合剂、dna嵌入剂或交联剂、dna合成抑制剂、dna和rna转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂、基因调节剂和血管生成抑制剂。这些药剂(以治疗有效量施用)和治疗可单独或组合使用。例如，可将任何合适的抗癌或抗血管生成剂与本文公开的car、car-t细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物组合施用。这些药剂的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可以由熟练的临床医生确定。
额外的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如氮芥(例如，苯丁酸氮芥、二氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链脲霉素)、铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和bbr3464)、白消安、达卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和乌拉莫司汀(uramustine)；抗代谢物，例如叶酸(例如，甲氨喋呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤(例如，克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤和硫鸟嘌呤)、嘧啶(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和吉西他滨；植物生物碱，例如鬼臼(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷(例如，多西紫杉醇和紫杉醇)、长春花(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、博来霉素、利福平、羟基脲和丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康；单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗；光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠(porfimersodium)和维替泊芬；以及其他药剂，例如阿利维生素a酸、六甲蜜胺、安丫啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿西替尼、贝沙罗汀、贝伐单抗、硼替佐米、塞来考昔、地尼白介素(denileukindiftitox)、埃罗替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、喷司他丁、马索罗酚(masoprocol)、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、他莫昔芬、索拉非尼、舒尼替尼、vemurafinib、凡德他尼和维甲酸。这些药剂的选择和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可以由熟练的临床医师确定。
在本发明的某些实施方案中，将使用本文所述的方法或本领域已知的其他方法活化和扩增(其中t细胞扩增至治疗水平)的细胞与任何数量的相关治疗方式组合(例如，在其之前、同时或之后)施用于患者，所述相关治疗方式包括但不限于利用药剂的治疗，例如抗病毒治疗，用于ms患者的西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ara-c)或那他珠单抗治疗，或用于银屑病患者的依法珠单抗治疗，或用于pml患者的其他治疗。在另一些实施方案中，本发明的t细胞可与以下组合使用：化学治疗、放射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506，抗体或其他免疫清除剂，如campath、抗cd3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素、氟达拉宾、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liu等，cell66：807-815，1991；henderson等，immun73：316-321，1991；bierer等，curr.opin.immun5：763-773，1993)。在另一些实施方案中，将本发明的细胞组合物与以下组合(例如，在其之前、同时或之后)施用于患者：骨髓移植、使用化学治疗剂(如氟达拉滨)的t细胞消融治疗、外部束放射治疗(xrt)、环磷酰胺或抗体如okt3或campath。在另一个实施方案中，在b细胞消融治疗如与cd20反应的试剂如美罗华之后施用本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方案中，对象可以接受高剂量化学治疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植之后，对象接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另一些实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待向患者施用的上述治疗剂的量将根据所治疗的病症和治疗的接受者的确切性质而变化。可根据本领域接受的实践进行用于人施用的计量的缩放。例如，对于成年患者，campath的剂量通常为1至约100mg，通常每天施用，施用1至30天。优选的每日剂量为每天1至10mg，但是在一些情况下可使用每天多至40mg的较大剂量。
组合治疗可提供协同作用并证明是协同的，即当活性成分一起使用时实现的效果大于使用单独化合物所产生的效果的总和。当活性成分如下时可获得协同效果：在组合的单位剂型中共配制并同时施用或递送(2)作为独立知己交替或平行递送；或(3)通过其他方案。当交替递送时，例如通过在分开的注射器中的不同注射连续地施用或递送时可获得协同效应。一般来说，在交替期间，依次(即，连续地)施用每种活性成分的有效剂量，而在组合治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。
在一个实施方案中，在抗癌治疗后将有效量的特异性结合本文公开的一种或更多种抗原的抗体或抗原结合片段或缀合物施用于患有肿瘤的对象。在已经经过足够的时间以允许施用抗体或抗原结合片段或缀合物以与各癌细胞上表达的抗原形成免疫复合物后，检测免疫复合物。免疫复合物的存在(或不存在)指示治疗的有效性。例如，与在治疗之前取得的对照相比免疫复合物的增加指示治疗是无效的，而与在治疗之前取得的对照相比免疫复合物的减少指示治疗是有效的。
e生物药物组合物
本文提供了用于基因治疗、免疫治疗、过继免疫治疗和/或细胞治疗的生物药物或生物制品组合物(下文称“组合物”)，所述组合物包含在载体(例如可药用载体)中的所公开的car、或表达car的t细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物、car或表达与本文公开的一种或更多种抗原特异性结合的car的t细胞中的一种或更多种。该组合物可制备成单位剂型用于向对象施用。施用的量和时间由治疗临床医师决定，以达到预期的结果。组合物可配制用于全身(例如静脉内)或局部(例如肿瘤内)施用。在一个实例中，公开的car、或表达car的t细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物被配制用于肠胃外施用，例如静脉内施用。包含本文公开的car、或表达car的t细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物用于例如治疗和检测肿瘤，例如但不限于成神经细胞瘤。在一些实例中，组合物可用于治疗或检测癌。包含本文公开的car、或表达car的t细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物还用于例如检测病理性血管生成。
用于施用的组合物可包含溶解在可药用载体如水性载体中的car、或表达car的t细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些组合物可通过常规、公知的灭菌技术灭菌。组合物可根据需要包含可药用辅助物质以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、辅助剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中，car、或表达car的t细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的浓度可广泛地变化，并将根据所选择的具体施用方式和对象的需要基于流体体积、黏度、体重等来选择。制备用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的此类剂型的实际方法是本领域技术人员已知的或明显的。
用于静脉内施用的典型组合物包含每个对象每天约0.01至约30mg/kg抗体或抗原结合片段或缀合物(或相应剂量的car或表达car的t细胞，包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。制备可施用组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或明显的，并且在出版物如remington′spharmaceuticalscience，第19版，mackpublishingcompany，easton，pa(1995)中详细地描述。
car、或表达car的t细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物可以以冻干形式提供，并且在施用之前用无菌水再水化，但是其也可以以已知浓度的无菌溶液提供。然后将car、或表达car的t细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的溶液加入到输注袋中，所述输注袋包含0.9％氯化钠、usp，并且在一些情况下以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。本领域中在施用抗体或抗原结合片段或缀合物药物种有相当多的经验可获得；例如，自1997年批准
控释胃肠外制剂可制备为植入物、油性注射剂或微粒系统。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见，banga，a.j.，therapeuticpeptidesandproteins：formulation，processing，anddeliverysystems，technomicpublishingcompany，inc.，lancaster，pa，(1995)。微粒体系包括微球体、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球体和纳米颗粒。微胶囊含有治疗性蛋白质如细胞毒素或药物作为核心。在微球体中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球体和微胶囊通常分别被称为纳米颗粒、纳米球体和纳米胶囊。毛细血管具有约5μm的直径，所以仅纳米颗粒静脉内施用。微颗粒为约100μm的直径，并且皮下或肌内施用。参见例如kreuter，j.，colloidaldrugdeliverysystems，j.kreuter，ed.，marceldekker，inc.，newyork，ny，pp.219-342(1994)；andtice&tabibi，treatiseoncontrolleddrugdelivery，a.kydonieus，ed.，marceldekker，inc.newyork，ny，第315-339页，(1992)。
聚合物可用于本文公开的car、或表达car的t细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物组合物的离子控制的释放。用于受控药物递送的多种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域中已知的(langer，accountschem.res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下作为黏性流动液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。已经显示其是配制和持续递送重组白细胞介素-2和脲酶的有效载体(johnston等，pharm.res.9：425-434，1992；和pec等，j.parent.sci.tech.44(2)：58-65，1990)。或者，羟基磷灰石已被用作蛋白质的受控释放的微载体(ijntema等，int.j.pharm.112：215-224，1994)。在另一方面，脂质体用于脂质封装的药物的受控释放和药物靶向(betageri等，liposomedrugdeliverysystems，technomicpublishingco.，inc.，lancaster，pa(1993))。用于治疗性蛋白的受控递送的许多另外的系统是已知的(参见美国专利号5,055,303；美国专利号5,188,837；美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028；美国专利号4,957,735；美国专利号5,019,369；美国专利号5,055,303；美国专利号5,514,670；美国专利号5,413,797；美国专利号5,268,164；美国专利号5,004,697；美国专利号4,902,505；美国专利号5,506,206；美国专利号5,271,961；美国专利号5,254,342和美国专利号5,534,496)。
g.试剂盒
在一个方面，还提供了使用本文公开的car的试剂盒。例如，用于治疗对象中的肿瘤或制备表达本文公开的一种或更多种car的cart细胞的试剂盒。试剂盒通常包含本文公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、car或表达car的t细胞。可以在试剂盒中包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、car或表达car的t细胞中的超过一种。
试剂盒可包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(如玻璃或塑料)形成。容器通常容纳包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、car或表达car的t细胞中的一种或更多种的组合物。在多个实施方案中，容器可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，其具有可被皮下注射针头刺穿的塞)。标签或包装插页指示组合物用于治疗特定病症。
标签或包装插页通常将还包括例如在治疗或预防肿瘤或制备cart细胞的方法中使用所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、car或表达car的t细胞的说明。包装插页通常包括通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。指导材料可以是电子形式(如计算机软盘或光盘)的书写的，或可以是可视的(如视频文件)。试剂盒还可包含附加组分以便于试剂盒设计的特定应用。因此，例如，试剂盒可额外包含检测标记的手段(例如酶标记的酶底物，检测荧光标记的滤波装置，适当的次级标记如第二抗体等)。试剂盒还可以包括常规用于实践特定方法的缓冲剂和其他试剂。这样的试剂盒和合适的内容物对于本领域技术人员是公知的。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不以任何方式解释为对本发明的范围施加限制。相反，应该清楚地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，可以采取多种其他实施方案、修改和其等同物，在阅读了本文的描述之后本领域技术人员将得到其本身的暗示。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不以任何方式解释为对本发明的范围施加限制。相反，应该清楚地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，可以采取多种其他实施方案、修改和其等同物，在阅读了本文的描述之后本领域技术人员将得到其本身的暗示。
实施例1.肿瘤突变体组的下一代测序
本程序涉及患者肿瘤材料的下一代测序，并鉴定存在于肿瘤中的突变蛋白(作为组，称为突变体组)。这些序列将被用作产生表达突变肿瘤蛋白之载体的基础。当可用时，非肿瘤相关的患者材料将用于正常比较(例如外周血)，如人类基因组的公共可用数据库。下一代测序的方法是分子生物学中建立完善的技术，并且可在例如vogelsteinb，papadopoulosn，velculescuve，等，2013，cancergenomelandscapes，science339：1546-1558中找到。
国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth，nih)在线提供了癌症基因组图谱(cancergenome.nih.gov)。在其中可以找到33种癌症的关键基因组变化的全面图。数据通过特定tcga(thecancergenomeatlas，癌症基因组图谱)基因组测序中心(genomesequencingcenter，gsc)输送到nih。对于测序的每种tcga癌症病例，可获得全外显子组和全基因组两种形式的数据。对于每次提交，非肿瘤dna用作对照。国家人类基因组研究所(nationalhumangenomeresearchinstitute，nhgri)资助的三个中心提供全基因组序列：布罗德研究所测序平台(thebroadinstitutesequencingplatform，broadinstitute，cambridge，mass.)；贝勒医学院人类基因组测序中心(humangenomesequencingcenter，baylorcollegeofmedicine，houston，texas)；以及华盛顿大学基因组研究所(thegenomeinstituteatwashingtonuniversity，washingtonuniversityschoolofmedicine，st.louis，mo.)。
如果有人单独与布罗德研究所签约，则humanwesexpress(deep)服务提供以50×或更高覆盖率覆盖85％靶碱基的肿瘤-正常对或体细胞突变分析(访问2016年6月10日的信息，www.genomics.broadinstitute.org/products/while-exome-sequencing)。肿瘤样品也可以在布罗德的clia许可的cap实验室进行测序。商业化全基因组和全外显子组测序服务由illumina(www.illumina.com/areas-of-interest/cancer/research.htlml)提供，该公司现在还提供肿瘤免疫原性发现平台(ngs-immuno-oncology-application-spotlight-1170-2016-005-1.pdf)。其他商业供应商也可用。提供这些信息是为了证明全基因组和全外显子组测序服务在市场上是广泛可用的，并且从历史上看，提供这些序列的成本和速度将持续下降。人肿瘤样品的基因组分析是容易提供的服务，或者可使用商业提供的仪器和系统在实验室中进行。
实施例2.tcr的下一代测序
本程序涉及使用测序技术来定义生物样品中的t细胞受体的完全互补序列。所分析的材料包括患者肿瘤，在这种情况下，我们将描述肿瘤中存在的tcr。在外周血中，我们将描述所存在的常见tcr，其中一些是肿瘤特异性的。下一代测序允许定量特定tcr的频率。应用下一代测序技术来鉴定特定tcrα和β链的对是分子生物学中建立完善的技术(dashp，wangg，thomasp，2015，single-cellanalysisoft-cellreceptorabrepertoire，inimmunosenecense：methodsandprotocols，shawac(编辑)，methodsinmolecularbiology，第1343卷，springerscience+businessmedia，newyork)。
已经使用当前的分子生物学技术开发了多种方法，包括自动化dna测序的持续发展，以确定编码tcrα链(tcra)和tcrβ链(tcrb)的dna序列。此外，已经开发了许多技术来指定在同一t淋巴细胞中或由克隆前体产生的t细胞群体中哪些tcra与tcrb配对。例如，在2012年，sun等证明了能够在来自表型分选的cd8t细胞的单细胞水平上对tcrα和β链进行测序。sunx，saitom，satoy，等，2012，unbiasedanalysisoftcra/bchainsatthesingle-celllevelinhumancd8+t-cellsubsets，plosone7：e40386。
2014年，han等证实了来自t细胞的tcra和tcrb的测序，所述t细胞在某些情况下通过其分泌特定细胞因子亚集的能力而被分类，通过miltenyibiotec细胞因子捕获系统(免疫磁性粒子)分离。hana，gianvillej，hansmannl，davismm，2014，linkingt-cellreceptorsequencetofunctionalphenotypeatthesingle-celllevel，naturebiotechnology32：684-692。
以类似的方式，已经通过单细胞测序方法分析了编码包含由b细胞编码的抗体库的重链和轻链的序列。dekoskyb，kojimat，rodina，等，2015，in-depthdeterminationandanalysisofthehumanpairedheavy-andlight-chainantibodyrepertoire，naturemedicine21：86-91。
实施例3.表达肿瘤突变体组的慢病毒载体的产生
为了赋予抗原呈递细胞——来自患者的抗原呈递细胞(非限制性实例是树突细胞)突变体组的表达，使用慢病毒载体(lv)编码突变体组中存在的十种(十是近似值，并且lv的数目可从1到100不等)最主要的突变蛋白。lv可以编码包含相关表位的突变体组，或者将每个突变基因单独克隆到多个lv中。也可以用其他基因或非编码rna转导dc以增强产生高功能性dc和/或t细胞的效果。此类基因或非编码rna的非限制性实例是il-2、il-4、il-12、il-17、il-15、il-21、il-7、il-4、gm-csf、mir21、mir221和mir142-t。也用这样的蛋白质转导它们，以使得其促进单核细胞向dc分化，然后一旦发生分化，使用本领域已知的组织特异性启动子和/或组织特异性mirna来关闭。
通过用编码产生遗传载体所需的组成基因的一组质粒来转导生产细胞系来快速产生lv。根据目前法规要求，将这些质粒作为一组转染到生产细胞系中。转染的质粒之一编码lv的遗传有效载荷(geneticpayload)，即待递送到靶细胞系中的期望基因。因此，一旦限定了肿瘤突变体组，并且选择了在抗原呈递细胞中表达的突变基因，就将这些基因转移到编码一种或更多种突变蛋白质的质粒中。lv可容纳多至10,000个碱基对。因此，可由lv编码多至十个基因或个体基因。如果超过允许的包装基因大小，则产生两个或更多lv群体以编码期望的整组突变体组。编码突变体组的突变基因通过pcr扩增，或者直接合成，合适的序列包括允许快速克隆到lv骨架质粒(编码目标基因的质粒)中的那些。一旦产生了编码期望突变体组基因的lv，则将其用于转导抗原呈递细胞。
实施例4.表达tcr的慢病毒载体的产生
为了赋予通过对患者材料进行测序鉴定的tcr序列的表达，使用lv来编码全长tcra和tcrb链。然后使用这些载体转导患者t细胞，从而产生多特异性t细胞(天然的和转导的tcr)。
对人tcr进行分子克隆、测序以及使用逆转录病毒基因载体转移到原代人t细胞中的能力是本领域中建立完善的。转导的t细胞获得使用载体转移的tcr靶向细胞的能力。如果转导的t细胞是克隆的，则可以证明天然的和转移的两种tcr都是功能性的(retroviraltransductionofatcellreceptorspecificforanepstein-barrvirus-encodedpeptide，clinicalimmunology，98：220-228，还参见jurgens，等，2006，transductionofprimarylymphocyteswithepstein-barrvirus(ebv)latentmembraneprotein-specifict-cellreceptorinduceslysisofvirus-infectedcells：anovelstrategyforthetreatmentofhodgkin'sdiseaseandnasopharyngealcarcinoma，jclinicalimmunology，26：22-32)。
产生编码单个或多个tcr的lv，例如其tcra和tcrb序列来源于从卵巢癌患者分离的t细胞；并使用该lv来转导已经分离、活化并在体外培养的自体患者淋巴细胞。使用的培养基的实例包括rpmi-1640或texmacs，其补充有或未补充有人血清或人血清白蛋白，以及支持性细胞因子，如il-2、il-7、il-15、il-21或其组合。通过使用具有抗cd3和抗cd28结合特性的纳米基质如mitenyitransact系统来促进活化。根据本领域的标准技术(即，在组织培养瓶中)或在自动化培养平台(例如clinimacsprodigy(miltenyibiotec))上实现培养。来自患者的经转导t细胞群体表面上新tcr的存在可通过转移的特异性tcrb的抗体染色或通过这些序列的pcr来证实。
然后使用该活化t细胞群体(现在具有来自患者的克隆的tcr)识别该患者表达的癌症抗原。例如，如果tcr最初克隆自通过表达抗原x的树突细胞活化的患者衍生的t细胞，则经转导t细胞群体现在在与已经转导或转染以表达抗原x的组织匹配的apc(例如树突细胞细胞或b细胞)共培养后活化。在将该t细胞群体转移到患者体内后，证明了抗肿瘤活性。
在另一个实例中，lv编码天然tcr的抑制剂，例如特异性靶向内源tcr但不靶向载体中编码的tcr的反义或shrna，其中编码的tcr被修饰以抵抗反义或shrna的作用，从而产生靶向抗原而不靶向内源tcr的肿瘤特异性t细胞。相对于还表达内源tcr的t细胞，这些工程化t细胞可具有改善的安全性和功效特性。
在本实施例中，产生了表达tcr和car两者的lv以实现抗肿瘤作用。tcr和car可以在相同载体上或不同载体上表达。一个优选实施方案是产生多种载体以表达期望的car、tcr和可增强医药产品的治疗或预防效果的任何其他基因或非编码核酸(统称为载荷)。
实施例5.表达car的慢病毒载体的产生
关键要素是用嵌合抗原受体(car)转导患者t细胞。car必须在t细胞表面上表达至足够的水平以确保在遇到car靶细胞时足以激活经转导t细胞。例如，通过表达cd19的正常b细胞或表达cd19的白血病刺激携带cd19car的t细胞。car对已鉴定的突变肿瘤蛋白不是特异性的，而是靶向可能存在于肿瘤微环境中的正常b细胞或其他消耗性细胞类型，例如骨髓来源抑制细胞(myeloidderivedsuppressorcell，mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage，tam)，肿瘤相关成纤维细胞或纤维细胞，或存在于肿瘤基质中的其他细胞类型。
在b细胞的情况下，cd19和cd20特异性car的安全特性已经建立完善。也可使用靶向cd19和cd20两者的双重car。其对这些异源或自身抗原具有反应性，这将在体内输注后或者或许还在体外在培养期间(例如，如果抗原是与树突细胞共享的)驱动肿瘤特异性t细胞的扩增。抗原的非穷尽列表如下：cd19、cd20、cd22、cd33、cd38、cd14、cd11b、tie-2、vegfr1、vegfr2。作为非穷举性实例或如上所述，可通过表达例如gm-csf、il-4、trp2和/或ifn-α进一步改造dc以进行增强。如果需要，dc也可用于输注到患者体内。以这种方式，dc将用于引发或增强现在在体内表达同源tcr的经转导t细胞群体的活性。
一个非限制性实例是在载体内包含可更好地微调载荷的表达以增强或优化期望效果的元件。这些包括但不限于遗传开关、自杀基因、变阻器元件等。例如，car的表达可能仅在治疗后的一段时间内是期望的，可能优选的是在体内关闭car表达但长期保持tcr表达，使得改造的t细胞持续检测体内的肿瘤细胞。
实施例6.培养dc并用表达突变体组文库的慢病毒载体转导(dcmutn)
为了将突变蛋白呈递给患者t细胞，转导自体抗原呈递细胞如树突细胞(dc)以表达由突变体组编码的突变蛋白，通过肿瘤中最高表达的突变蛋白限定所表达的特定蛋白质。该体外程序允许在输注之前精确分析和评估免疫治疗性t细胞群体。
一个非限制性实例是在非gmp条件下从患者的外周血分离单核细胞，并首先用表达突变抗原的多种lv转导它们，然后使用可溶性il-4和gm-csf使其分化成树突细胞。一旦细胞已经分化，将患者t细胞与树突细胞一起传代培养以扩增肿瘤特异性t细胞。然后通过多种方法分离肿瘤特异性t细胞，并对特异性tcr进行测序和测定。然后将这些tcr合成并克隆到lv中，用于在gmp条件下制备的载体中作为药物产品。
另一个非限制性实例采用相同的单核细胞分离和lv介导的抗原特异性树突细胞产生，但在gmp条件下。用lv-抗cd19car转导患者t细胞，之后与基因修饰的dc一起培养少于4天，然后将抗原特异性t细胞以及可能还有表达抗原的dc作为治疗药物产品输注回患者。
实施例7.用car转导患者pbmc(t-car)
为了促进t细胞扩增，并且也逃避体内的肿瘤抑制信号，用car(如靶向cd19、cd20或其他消耗性自身抗原的car)转导患者t细胞。car含有“信号1”和“信号2”两者，“信号1”例如由cr3ζ链提供(信号1是指在遇到同源肽-mhc复合物时通常由tcr激活的信号，并包括tcr-ζ链的磷酸化)，“信号2”由cd137、cd28或已知在t细胞活化以及诱导t细胞的扩增和持续中起作用的其他t细胞信号转导分子提供(信号2是指生物学上允许已经接收信号1的t细胞在体外或体内被进一步刺激并持续所需的那些信号，并可包括jak-stat途径、pi3激酶、pkc亚型、traf途径或nf-κb途径的激活)。信号1和信号2可由相同的car构建体编码，或者可以分布在不同lv编码的基因产物中，这些基因产物在遇到特定的car配体时将用于激活t细胞。作为确保tcr转导的患者t细胞群的持久性的手段，car构建体的表达是本文所述的过继免疫疗法的中心方面，其中由car提供t细胞的持久性和存活信号，即使肿瘤特异性tcr不足以这么做时也是如此。
实施例8.用tcr转导患者pbmc(rect)
产生表达通过肿瘤和外周血测序所鉴定的tcra和tcrb链的lv。根据鉴定的tcra和tcrb对的数目，lv可编码多个tcr，或者产生具有单个tcr的多个lv，或者两者的组合。如上文基于dna测序的tcr鉴定中详细描述的，将鉴定tcra和tcrb链配对的特定技术用在这些载体的设计中。这些t细胞对lv转导的dc或b细胞或体内肿瘤细胞呈递的肿瘤突变体组具有反应性。因此，将来自卵巢癌患者的tcr序列(来自外周血或来自肿瘤切除物的淋巴细胞，已例如通过表达一组激活标志物或通过与表达肿瘤编码之蛋白质(即突变体组的一部分)的apc的反应性确定为肿瘤反应性的)分子克隆到lv载体中，并且用该载体转导患者t细胞，使得经转导t细胞群体现在表达肿瘤反应性tcr。lv转导的t细胞群体是肿瘤反应性的，并且可以重新输注给患者。
实施例9.用car和tcr(rect-car)转导患者pbmc
在一些情况下，用至少一种car和多种重组tcr序列(rect)转导患者t细胞。这些改造的多特异性t细胞能够通过天然tcr或rect与肿瘤细胞反应，增强抗肿瘤效应，并通过car使t细胞持续。在这种情况下，用编码tcr(最初来源于患者并被确定为肿瘤反应性的)和car两者的lv载体转导来自患有卵巢癌的患者的t细胞群体。tcr用于激活和指导抗肿瘤活性，car用于使得治疗性t细胞群体在体内持续。为了单次构建情况，在基因组或外显子水平对卵巢肿瘤进行测序，并鉴定肿瘤抗原x。然后通过lv转导抗原x以在自体apc如树突细胞中表达。然后将患者淋巴细胞与表达x的dc共孵育，并对反应性细胞测序以鉴定tcra和tcrb序列。然后将来自该测序的tcra和tcrb对用于构建表达x特异性tcr的lv。或者，通过直接来自血液或肿瘤组织的其他激活标志物鉴定肿瘤抗原反应性t细胞，鉴定tcra和tcrb序列并克隆到lv中。然后在离体培养中在培养基中用trasnact试剂(其通过cd3和cd28刺激t细胞)激活患者t细胞。然后用以下来转导活化的t细胞：两种独立的lv，一种编码tcr，第二种编码与x有反应性的tcr；或者共表达car和tcr的单一载体。然后使经转导t细胞群体在培养物中扩增以证明转基因的表达。一旦证实了lv编码序列的表达，将该治疗性t细胞群输注回患者体内用于抗癌作用。这种方法可以通过增加x以包含更多数量的肿瘤相关突变蛋白(突变体组产物)来进行多聚化。这种方法也可以通过鉴定多于一种与抗肿瘤细胞相关的tcr或通过与表达多种来自突变体组的肿瘤抗原的apc的反应性来多聚化。然后将效应t细胞群体输注回患者体内用于治疗效果，因此多克隆t细胞群体表达对x具有特异性的单一tcr以及car，或者多克隆t细胞群体表达与多种癌抗原反应的多种tcr，还共表达car。这个关键的创造性步骤描述了来源于患者的新的效应t细胞群体，该t细胞群已被改造为表达针对由正常组织编码的非必需抗原(例如cd19或cd20)的car，以及肿瘤特异性tcr。
实施例10.t细胞群体和经转导dc的共培养
为了扩增肿瘤反应性t细胞(无论是用car、rect、car还是rect转导的)，将t细胞与表达肿瘤突变体组的子集的dc共培养。在一个实施方案中，表达rect的细胞不需要在dc上培养，因为rect+car组合可足以使体内的肿瘤反应性t细胞扩增。与抗原呈递细胞如dc共培养证实了tcra和tcrb表达载体的肿瘤反应性，并且可以作为试验常规进行。用多种可能的细胞因子或其他因子培养细胞以增强产生或鉴定抗原特异性t细胞的作用。还可以在因子的存在下培养apc或dc以进一步增强抗原特异性t细胞扩增。非限制性实例是添加抗pd1抑制剂或添加il-12，但是在共培养期间对许多可能的因子进行测试并评估其增强作用。
实施例11.通过共施用或顺序施用能够向治疗性t细胞群体提供car或rect介导的信号传导的自体细胞产物来扩增rect-car-t群体
在该程序的一个变化形式中，lv-突变体组转导的dc(或其他apc)和效应t细胞群体二者可输注或注射到患者中。还想到可以将该第二细胞群再培养一段时间然后灌注，或者冷冻保存然后在单个或多个连续时间施用。例如，皮下注射到淋巴结或体内其他位点的表达突变体组的dc可增强已经静脉内注射的rect或天然抗肿瘤tcr的扩增和功能。在这种情况下，在遇到car特异性的正常抗原时扩增car表达驱使经转导t细胞群。表达突变体组编码的蛋白质的树突细胞群体的引入用于通过t细胞群体表达的rect驱动抗肿瘤t细胞功能。也可能的是将驱动car的自身抗原(例如cd19)消灭至不再扩增治疗性t细胞群体的程度。在这种情况下，可使用自体apc(例如树突细胞或冷冻保存的b细胞)或者已失活的epstein-barr病毒永生化b细胞来扩增rect-car-t群体。此外，永生化b细胞系也可用于表达突变体组蛋白。
用ebv使患者b细胞永生化在学术实验室(例如，universityofnorthcarolinaschoolofmedicine，参见https：//unclineberger.org/research/core-facilities/tissueculture/b-cell-immortalization-services)和作为商业服务(例如参见appliedbiologicmaterial，abm，inc.，https：//www.abmgood.com/ebv-cell-immortalization.html)两种情况可获得的标准服务。在此，使患者b细胞暴露于培养物上清液形式eb病毒(ebv)，并扩增经转化b细胞集落。这些患者来源的自体细胞通常用于遗传学、病毒学和免疫学程序。
因此，这种辅助自体细胞产物将用于通过表达car靶标以及rect靶标抗原而扩增治疗性t细胞群体。如果辅助apc产物不表达car靶标，则其将通过单独表达突变体组蛋白刺激治疗性t细胞群体。
实施例12.产生用于免疫治疗的特异性t细胞群体
这里描述的组合物和方法产生了许多适合用于过继免疫治疗的t细胞群体。在所有情况下，当包含car时，其目的不是与肿瘤抗原本身反应，而是在具有或不具有rect的共表达的情况下驱动患者t细胞的扩增或靶向免疫抑制细胞。这些细胞群体可以总结如下：
a.与dcmutn一起培养的t-car，其中t-car针对免疫抑制细胞靶标，dcmutn扩增抗原特异性t细胞。
b.不与dcmutn一起培养的rect-car，其中rec-t-car是也表达car的经遗传修饰的t细胞，但所述细胞本身不在dc上培养。通过与dcmutn细胞一起培养独立组的t细胞来鉴定rec-ttcr。
c.与dcmutn一起培养的rect-car，其中通过用car转导患者t细胞并在dcmutn细胞上培养所述细胞以扩增和分离还表达靶向肿瘤抑制性细胞群体的car的抗原特异性t细胞来产生rec-tcar细胞，并用于t细胞群体的长寿命/扩增。
d.不与dcmutn一起培养的rect，其中rec-t细胞是不表达car的遗传修饰的t细胞，并且细胞本身不在dc上培养。通过与dcmutn细胞一起培养独立组的t细胞来鉴定rec-ttcr。
e.与dcmutn一起培养的rect，其中rec-t细胞与dcmutn细胞一起培养以获得tcr抗原特异性t细胞。
e体外使用并且也用作体内佐剂/疫苗的dc-突变体组群体，其中dc-突变体组群体用作疫苗以驱动rec-t或rec-tcar细胞在身体中的扩增。
实施例13.替选供体和t细胞类型
可关于替选供体和t细胞类型考虑本文所述的过继免疫治疗方法的两种重要变化形式。
第一种变化是造血干细胞移植(hsct)背景下的过继免疫治疗。hsct已在恶性血液病和实体瘤两者中进行了尝试。为了应用这里描述的程序post-hsct，dc(或其他apc)和t细胞群体来源于骨髓(hsc)供体，并且产生治疗性t细胞，输注post-hsct。
因此，患有例如骨髓瘤的患者已经对其恶性肿瘤进行了测序，并确定了突变体组。突变体组蛋白抗原在来自hsc供体的apc中表达(借助lv转导)。激活并选择hsc供体来源的t细胞用于直接使用，或在与表达突变体组编码的蛋白质的apc共培养之后用于tcr测序。由于其对正常自身抗原具有反应性，car构建体保持与技术的非hsct应用相同。
第二种变化是使用替选t细胞群进行过继免疫治疗。众所周知，细胞表面活化标志物如cd137、cd69、pd-1、cd25、ii类mhc等经常用于确定和分离活化的t细胞群体(例如使用miltenyibiotecclinimacscd137-biotin试剂或clinimacscd25试剂)。使用这些方法从外周血、肿瘤或在暴露于表达肿瘤相关抗原的树突细胞(dcmutn)之后分离活化的t细胞群体。类似地，分离产生活化相关细胞因子的活化t淋巴细胞的能力可用作分离肿瘤抗原反应性t细胞的手段(例如使用miltenyibiotecclinimacs细胞因子捕获系统(ifn-γ))。还使用磁珠分选、流式细胞术、与塑料表面结合的固相抗体、与希望黏附于基质的t细胞类型表达的期望标志物的固相结合配体等将效应t细胞群分选为特定细胞群体，方式为通过细胞表面蛋白(标志物)的表达来定义所述t细胞类型。例如，可使用cd4或cd8免疫磁珠(例如，使用miltenyibiotecclinimacscd4试剂或clinimacscd8试剂)分离与被ii类mhc结合的突变肽有反应性的cd4细胞或与被i类mhc结合的突变肽有反应性的cd8细胞。然后将这些细胞类型用作单一群体(例如，仅cd4)或以特定组合或比率使用。类似地，t细胞分化的标志物已用于选择用于过继免疫治疗的特定群体。这些分化标志物用于正向或负向选择记忆t细胞群体或幼稚t细胞群体(例如使用clinimacscd45ra试剂或clinimacscd62l试剂)。此外，可使用t细胞群体的特定生理学方面来鉴定可以在体内更好地扩增的更原始t细胞群体(例如使用鉴定在t细胞表面表达酶醛脱氢酶或表达特定组合的钠(na+)和钾通道(k+)的细胞群体的试剂，参见liepinsa，等，1989，“serotoninmodulatedca++dependentk+channelsinalloimmuneeffectorcelliyticfunction.immunopharmacolimmunotoxicol11：165-178，以及gallinek，1986，ionicchannelsinleukocytes，jleukocbio39：241-254)。因此，在上述实施例中，在用apc(dcmutn)培养来自骨髓瘤患者的t细胞之前，或在将未选择的t细胞群体暴露于apc之后但输注到患者中之前，分离t细胞亚群为作为治疗性细胞群体。在一个应用中，这些标志物或生理学特征用于更准确地鉴定肿瘤反应性t细胞，因此作为更有效鉴定tcra和tcrb序列的基础。在另一个应用中，在输注到患者中之前但在通过lv转导的rectcr和car诱导表达之后，预先选择某些标志物的用于免疫治疗的t细胞群体。在另一个应用中，在从患者分离后选择表达肿瘤反应性标志物的t细胞，并将该选择的亚群与apc(dcmutn)共培养以更有效地鉴定肿瘤特异性tcra和rcrb序列。
虽然已经结合上面概述的示例性实施方式描述了多个细节，但是在阅读前面的公开内容后，各种替代方案、修改、变化、改进和/或实质等同方案将变得明显，无论其是已知的还是目前无法预料的。
本文引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利中(包括在每个已授权专利的审查期间)引用的每个文件和参考文献(“申请引用文件”)，以及对应于这些申请和专利和/或要求任意这些申请和专利的优先权的每个pct和外国申请或专利，以及每个申请引用文件中引用或参考的每个文件，均明确地通过引用并入本文，并可在本发明的实践中使用。更一般地，本文在权利要求前面的参考文献列表或本文本身中引用了文件或参考文献；每个这些文件或参考文献(“本文引用参考文献”)以及每篇本文引用参考文献中引用的每个文件或参考文献(包括任何制造商的指示、说明书等)均明确地通过引用并入本文。
以上对一些具体实施方案的描述提供了足够的信息，其他人可以通过应用当前的知识容易地对这些具体实施方案进行修改或调整以用于各种应用，而不脱离一般概念，因此，这样的调整和修改应当并且旨在涵盖在所公开实施方案的等同方案的含义和范围内。应理解，本文使用的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的。在附图和说明书中，已经公开了示例性实施方案，并且尽管可能已经使用了特定术语，但是除非另外指出，否则仅以一般和描述的意义使用，而不是为了限制的目的，因此权利要求的范围不限于此。而且，本领域技术人员将理解，本文所讨论的方法的某些步骤可以以替选顺序排序，或者步骤可以组合。因此，意图是所附权利要求不限于本文公开的具体实施方案。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的实施方案的许多等同方案。以下权利要求涵盖这样的等同方案。
参考序列表
本申请包含通过标题为“sequencelisting”的pdf文件将向美国专利商标受理局(unitedstatespatentandtrademarkreceivingoffice)电子提交的序列表。该序列表通过引用并入。
本公开内容的序列
下面列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码表示，如37c.f.r1.822中定义的。仅示出了每条核酸序列的一条链，但应理解，互补链通过参考所显示的链也包括在内。在所附的序列表中：
seqidno：5是前导/信号肽序列的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
seqidno：6是前导/信号肽序列的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllip
seqidno.：11是dnacd8跨膜结构域的核苷酸序列：
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
seqidno：12是cd8跨膜结构域的氨基酸序列：
iletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys
seqidno：13是dnacd8铰链结构域的核苷酸序列：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat
seqidno：14是cd8铰链结构域的氨基酸序列：
thrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyr
seqidno：15是cd8.α.(ncbirefseq：np.sub.--001759.3)的铰链区的第118至178位氨基酸的氨基酸序列：
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleu
seqidno：16是人iggcl序列的氨基酸序列：
glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargscrtyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalaprothrglucysser
seqidno17是4-1bb的dna信号传导结构域的核苷酸序列：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
seqidno：18是4-1bb的信号传导结构域的氨基酸序列：
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglugluglugluglyglycysglulcu
seqidno：19是cd3-ζ的dna信号传导结构域的核苷酸序列：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
seqidno：20是cd3ζ的氨基酸序列：
argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrlysglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
seqidno：21是核酸序列(dna)sp-cd19结合物-cd8连接-cd4tm-信号ltg1562的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccggatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgtgcagccgatggcgctgattgtgctgggcggcgtggcgggcctgctgctgtttattggcctgggcatttttttttgcgtgcgctgccgcccgcgccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
seqidno：22是sp-cd19结合物-cd8连接-cd4tm-信号ltg1562的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaapaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfvqpmalivlggvaglllfiglgiffcvrcrprrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
seqidno：27是scvfcd19的核苷酸序列：
gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctca
seqidno：28是scvfcd19的氨基酸序列：
aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleuglyaspargvalthrilesercysargalaserglnaspileserlystyrleuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuiletyrhisthrserargleuhisserglyvalproserargpheserglyserglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleugluglngluaspilealathrtyrphe
cysglnglnglyasnthrleuprotyrthrpheglyglyglythrlysleugluilethrglyglyglyglyscr100105110glyglyglyglyserglyglyglyglyscrgluvallysleuglngluscrglyproglyleuvalalaproserglnserleuservalthrcysthrvalserglyvalserleuproasptyrglyvalsertrpileargglnproproarglysglyleuglutrpleuglyvaliletrpglysergluthrthrtyrtyrasnseralaleulysserargleuthrileilelysaspasnserlysserglnvalpheleulysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysalalyshistyrtyrtyrglyglysertyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser
seqidno：29是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号传导ltg1494(参见，图3a，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509)的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccggataccgatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcagcaccagcggcagcggcaaaccgggcagcggcgaaggcagcaccaaaggcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatatttatatttgggcgccgctggcgggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgattaccctgtattgcaaacgcggccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
seqidno：30是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号传导ltg1494(参见，图3a，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509)的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllipdtdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaatttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
seqidno：31是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号(lti重新工程改造的)(ltg1538)(参见，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509的图3b)的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccggatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatatttatatttgggcgccgctggcgggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgattaccctgtattgcaaacgcggccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
seqidno：32是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号(lti重新工程改造的)(ltg1538)(参见，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509的图3b)的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaatttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
参考序列表
本申请包含通过标题为“sequencelisting”的pdf文件将向美国专利商标受理局（unitedstatespatentandtrademarkreceivingoffice）电子提交的序列表。该序列表通过引用并入。
本公开内容的序列
下面列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码表示，如37c.f.r1.822中定义的。仅示出了每条核酸序列的一条链，但应理解，互补链通过参考所显示的链也包括在内。在所附的序列表中：
seqidno:5是前导/信号肽序列的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
seqidno:6是前导/信号肽序列的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllip
seqidno.:11是dnacd8跨膜结构域的核苷酸序列：
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
seqidno:12是cd8跨膜结构域的氨基酸序列：
iletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleu
valilethrleutyrcys
seqidno:13是dnacd8铰链结构域的核苷酸序列：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg
tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg
gacttcgcctgtgat
seqidno:14是cd8铰链结构域的氨基酸序列：
thrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrileala
serglnproleuserleuargproglualacysargproalaalagly
glyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyr
seqidno:15是cd8.α.（ncbirefseq:np.sub.--001759.3）的铰链区的第118至178位氨基酸的氨基酸序列：
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet
argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe
proglugluglugluglyglycysgluleu
seqidno:16是人iggcl序列的氨基酸序列：
glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserser
glugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileserasp
phetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserpro
vallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasn
lystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplys
serhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrval
glulysthrvalalaprothrglucysser
seqidno17是4-1bb的dna信号传导结构域的核苷酸序列：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa
actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt
gaactg
seqidno:18是4-1bb的信号传导结构域的氨基酸序列：
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet
argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe
proglugluglugluglyglycysgluleu
seqidno:19是cd3-ζ的dna信号传导结构域的核苷酸序列：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctc
tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc
cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat
gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc
cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc
tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
seqidno:20是cd3ζ的氨基酸序列：
argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrlysglngly
glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr
aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys
proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys
asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg
argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala
thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
seqidno:21是核酸序列（dna）sp-cd19结合物-cd8连接-cd4tm-信号ltg1562的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccggatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgtgcagccgatggcgctgattgtgctgggcggcgtggcgggcctgctgctgtttattggcctgggcatttttttttgcgtgcgctgccgcccgcgccgcaaaaaactgc
tgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagc
tgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgc
ggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgcc
gcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaacc
gcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaa
gcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtat
cagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcg
ctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
seqidno:22是sp-cd19结合物-cd8连接-cd4tm-信号ltg1562的氨基酸序列：
mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgd
rvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgs
gtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggs
ggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkgl
ewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyyc
akhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaapaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfvqpmalivlggvaglllfiglgiffcvrcrprr
kkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapa
yqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynel
qkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
seqidno:27是scvfcd19的核苷酸序列：
gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctca
seqidno:28是scvfcd19的氨基酸序列：
aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleuglyaspargvalthrilesercysargalaserglnaspileserlystyrleuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuiletyrhisthrserargleuhisserglyvalproserargpheserglyserglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleugluglngluaspilealathrtyrphecysglnglnglyasnthrleuprotyrthrpheglyglyglythrlysleugluilethrglyglyglyglyser100105110glyglyglyglyserglyglyglyglysergluvallysleuglngluserglyproglyleuvalalaproserglnserleuservalthrcysthrvalserglyvalserleuproasptyrglyvalsertrpileargglnproproarglysglyleuglutrpleuglyvaliletrpglysergluthrthrtyrtyrasnseralaleulysserargleuthrileilelysaspasnserlysserglnvalpheleulysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysalalyshistyrtyrtyrglyglysertyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser
seqidno:29是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号传导ltg1494（参见，图3a，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509）的核苷酸序列：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccggataccgatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcagcaccagcggcagcggcaaaccgggcagcggcgaaggcagcaccaaaggcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatatttatatttgggcgccgctggcgggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgattaccctgtattgcaaacgcggccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
seqidno:30是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号传导ltg1494（参见，图3a，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509）的氨基酸序列：
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seqidno:31是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号（lti重新工程改造的）（ltg1538）（参见，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509的图3b）的核苷酸序列:
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seqidno：32是sp-cd19结合物-cd8连接-cd8tm-信号（lti重新工程改造的）（ltg1538）（参见，申请人的共同未决的临时专利申请号62/239,509的图3b）的氨基酸序列：
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