本发明主要涉及包含或衍生自芽孢杆菌的制剂，该制剂可用于控制植物病害以及改善动物(包括人类)的生长及健康。
本发明进一步涉及鉴定、制备或使用这种制剂的材料和方法。
背景技术：
减少人工作物保护产品及其残余物以及植物保鲜剂的使用，对于实现农业生产系统的可持续发展有着重要意义。
因此，人们对于有能力防止植物病害如丝状病原真菌引起的病害的制剂和材料的需求与日俱增。希望新制剂能解决如克服病害对现有农药的抗性的问题，或能扩大对病害的防效范围，或现有的化学农药不再使用的方法。生物来源的制剂由于其在环境中不会永久残留而倍受青睐。
再者，抗生素在维持动物和人类健康方面的应用，尤其是在家禽、鱼类及贝类等养殖中的应用受到越来越多的来自政府管理部门和消费者的压力。这致使抗生素的高效替代品成为一种需求。使用直接食用的微生物或其产生的活性物质将是一种潜在的替代方案。
技术实现要素：
发明者鉴定了一种新的细菌菌株，并命名为枯草芽胞杆菌hf1(bacillussubtilishf1)。该菌株可用作制剂，该制剂用于控制植物病害并且还用于改善人和其他动物的健康和生长。
本发明尤其涉及用于控制植物病害的方法和材料，所述方法和材料基于或涉及枯草芽孢杆菌hf1或由其衍生的活性物质(例如杀真菌化合物)或突变株。
本发明尤其还涉及用于控制、抑制微生物尤其是真菌的方法和材料，所述方法和材料基于或涉及枯草芽孢杆菌hf1或由其衍生的活性物质(如杀真菌化合物)或其突变株。微生物优选地是病原菌，如植物病原菌。
在此后的实施例中，hf1菌株表现出广谱的防治真菌疾病的效果，这表明其可用于防治真菌耐药性。现认为hf1可用于控制通过土壤和空气两者传播的真菌。
此外，如下文所证实的，枯草芽孢杆菌hf1菌株的应用不仅限于其活菌。其发酵液也可直接应用，或通过烘干、浓缩或用其他方式处理形成的产品而应用，从该菌中分离或浓缩的活性制剂也可应用。
在其他方面，枯草芽孢杆菌hf1可用作衍生菌株的来源，例如具有相似或改善的特性的突变株。
本文描述的hf1的产品基于或涉及hf1菌株或由其衍生的活性物质或突变株，该产品可用作用于防治植物疾病并改善植物健康，或用于使收获时或收获后的植物产品(包括衍生食品)保鲜的生物肥料或生物杀虫剂。
本发明还涉及使用本文描述的hf1产品改善农业动物或其他动物(包括人、家禽、鱼类及贝类)的生长及健康的方法及材料。如可以作为饲料添加剂或兽药或医用药来改善健康。在某些实施方案中，本发明提供了细菌分离菌株、包含所述分离菌株的益生菌配制物以及使用所述益生菌配制物和分离菌株以改善动物的健康和生长的方法。
关于这些方面我们将在下面更详细地阐述。
保藏的菌株及突变株
用于证明本发明的制剂的特定菌株枯草芽孢杆菌hf1已经保藏在中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)(根据布达佩斯条约)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编为100101，该菌株的登录号为cgmccno.11487，保藏日期为2015年10月13日。
根据下文实施例列出的16srdna分析，该菌株被鉴定为属于枯草芽孢杆菌。
实施例2展示了该菌株的一些特性。
该菌株(例如分离的形式或基本分离的形式或培养物)构成了本发明的一部分。
另一方面，本发明提供了登录号为cgmccno.11487的枯草芽孢杆菌hf1菌株或其突变株。
“其突变株”是指由保藏菌株衍生得到的菌株，这些菌株与保藏菌株相比，在一个或多个特性上有改变。突变菌株的获得方法将在下面阐述。
典型地，这些突变株与在下文实施例2描述中保藏菌株枯草芽孢杆菌hf1共有一个或多个特征以及本文描述的活性。
在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌hf1菌株或由其突变株以生物上纯的培养物的形式存在。
除非上下文特别指出，如果本文使用“枯草芽孢杆菌hf1菌株”，都将指保藏菌株和由其衍生的突变株。
众所周知，枯草芽孢杆菌可以产生小的、坚韧的、保护性的、代谢休眠的内孢子。因此，枯草芽孢杆菌hf1的这些孢子及其在本文描述的方法和过程中的应用构成本发明的其他方面。
在一个方面，本发明提供包含在合适载体中的至少一种本发明的枯草芽孢杆菌hf1的的组合物。这种载体在下面更详细地描述，但这些载体对于所需的应用而言是合适的，所需的应用如用于控制植物病原菌(农业上可接受的载体)或用于改善动物健康(如作为饲料或添加到饮用水中的添加剂)。
芽孢杆菌菌株的生长和培养
发明者提供了一种生长培养基(本文中命名为“endo”)，它的组成如下：葡萄糖10-28g/l，kno36g/l，kh2po41.2g/l，mgso4·7h2o1.2g/l，na3c6h5o70.2g/l，cacl2·2h2o105mg/l，feso4·7h2o16mg/l，edta2.1mg/l，h3bo32.86mg/l，znso4·7h2o0.222mg/l，mncl2·4h2o1.81mg/l，na2moo40.021mg/l和cuso4·5h2o0.07mg/l。
利用该培养基来生长、培养或发酵芽孢杆菌菌株如本发明的菌株构成了本发明的另一个方面。
保藏菌株的突变株
突变株可以由本领域技术人员使用标准方法从枯草芽孢杆菌hf1中得到。
例如，对本领域技术人员来说，dna诱变或突变株筛选的方法是熟知的，包括多种化学或酶方法。这些方法的实例包括但不限于暴露于紫外线(uv)、亚硝酸、n-甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍(ng)、4-硝基喹啉-n-氮氧化物(4nqo)。(leninger(1972)biochemistry.worthpublishersinc.,ny；jeffreyh.miller(1972)"experimentsinmoleculargenetics.coldspringharborlaboratory,coldspringsharbor,newyork)。优选的方法包括uv和ng。
举例而言，通过紫外辐射诱变可产生枯草芽孢杆菌hf1菌株的突变菌株，所述突变菌株可以产生抗菌物质或增强动物生长。例如，通过将孢子在紫外光下暴露约10至约180秒(优选45秒至约90秒，最优选65-75秒)可得到突变株。涉及ng的诱变可包括改变ng的浓度和暴露时间。以ng为例，可使用浓度为约13mg/l至约400mg/lng暴露约15分钟至约120分钟的时间。得到突变株的替代方法包括分子生物学领域的技术。这些技术的实例包括但不限于寡核苷酸定向诱变、接头分区诱变(linkerscanningmutation)和使用聚合酶链式反应的寡核苷酸定向诱变(ausubel(1987)currentprotocolsinmolecularbiology)。
筛选和选择具有改善或改进的抗菌剂生产或增强动物生长的突变株可以通过传统的测定方法进行，例如本文描述的那些。用于筛选突变株的筛选标准的实例包括但不限于在皮氏培养皿中芽孢杆菌克隆抑制菌丝生长的能力。krishna,radhae等人，“strainimprovementofselectedstrainbacillussubtilis(mtccno.10619)forenhancedproductionofantimicrobialmetabolites.”researchjournalofbiotechnology6.3(2011):58-62给出了如下的非限制性实例：通过对选定的枯草芽孢杆菌菌株进行紫外辐射获得了可增强抗菌代谢物产生的菌株改善。
因此，本发明的多个方面包括枯草芽孢杆菌hf1菌株的衍生突变株以及通过对其进行一轮或多轮诱变处理制备这些突变株以及培养所得菌株的方法。
组合物及相关产品
可通过标准干燥和发酵工艺得到用于组合物中的枯草芽孢杆菌hf1细胞。生长通常在生物反应器中、在有氧条件下、在适于生长的温度和ph条件下进行。典型的生长温度为15-37℃，通常为27℃-32℃。转速为例如约170rpm。
可使用培养年龄大于或等于约1天、2天、3天或4天的培养物。
组合物中为完整细胞形式的枯草芽孢杆菌hf1完整细胞的一般浓度为1×103-1×1014个细胞/mg，优选1×104-1×1010个细胞/mg，更优选1×106-1×108个细胞/mg。应理解，可以制备细胞浓度为1×1011-1×1014个细胞/mg的组合物，如果需要可在施用前，将其稀释。
菌株可以通过传统的洗涤、过滤或者沉淀技术(如离心)收集，或者采用旋风系统收集。收集的细胞可以立即使用或者保藏在冰冷条件下如4℃下。最好是在细胞收集后尽快使用。
在其他实施方案中，细胞或者发酵液产物(有或者没有细胞)可以使用常规方法冻干或者干燥，例如在加热或真空条件下喷雾干燥。优选的方法是冷冻干燥。适用于芽孢杆菌的冷冻干燥技术的非限制性实例在wo2008041786a1中有记载。
典型的产品可包括枯草芽孢杆菌hf1的培养物，不分离孢子和细胞。
本发明的实践并不局限于枯草芽孢杆菌hf1菌株，还延伸到由其形成的产品，无论是直接形成还是通过加工形成。
例如，在下面的实施例中，使用培养发酵液-例如在一次或多次离心(如10,000rpm)、加热(例如加热至100℃持续约10分钟)并还进行稀释(例如用水稀释至浓度为0.1％-5％，比如约1％、0.5％或者0.25％)后的发酵液。
因此在不同的方面，枯草芽孢杆菌hf1细胞在使用前可以被加工以产生活性细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解液、细胞上清液、细胞滤液、细胞团，或者可以用作全细胞制剂。
其他制剂
如果需要的话，可以从枯草芽孢杆菌hf1或其突变株的细胞和培养物中纯化或富集(如使用下面讨论的方法)枯草芽孢杆菌hf1制剂。
这种富集可以基于使用特定直径或分子量截止过滤器的生物过滤。例如在下面的实验中，上清液用直径0.22μm的细菌过滤器过滤。
在其它实施方案中，上清液经过高温灭菌(121℃灭菌10分钟)。因此提供或分离本文描述的制剂的方法可包括将制剂加热至该温度以确认该制剂在该温度下基本上是热稳定的。
“基本上热稳定的”是指当在相关温度下将制剂加热10分钟后进行测试时，所述制剂保留相关活性，优选保留未处理活性的至少50％。
如果需要的话，可利用本文描述的制剂的该特性以及其他特性以从衍生自枯草芽孢杆菌菌株的组合物和由其产生的培养基上清液中纯化该制剂或增加该制剂的浓度。
本文所述的活性试验提供了一种简便的方法，该方法测定每个阶段后或每个洗脱液样品中活性物质的水平。
从不均匀混合物中纯化肽或其他化合物的方法在本领域中中已经是比较清楚的，比如选择性沉淀、蛋白水解、用已知分子量截止过滤器进行超滤、离子交换色谱法、凝胶过滤等。这方面的一个特别有用的技术是超速离心法(比如150,000×g离心超过1小时)。其他已知适用于蛋白纯化的方法在以下中有公开：“methodsinenzymologyvol182-guidetoproteinpurification”ed.mpdeutscher,pub.academicpressinc。典型的方法还在“proteinpurification-principlesandpractice”pub.springer-verlag,newyorkinc(1982)以及harris&angal(1989)“proteinpurificationmethods-apracticalapproach”pub.o.u.p.10uk或参考文献或其后续版本中列出。
因此，本发明一个方面提供生成分离或富集的枯草芽孢杆菌hf1制剂的方法，所述方法包括从枯草芽孢杆菌hf1原材料中分离或富集活性物质，如从本文描述的上清液制备物、细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解液或细胞团中。该方法可以包括使用上述的一种或多种分离技术。在这个方法中，可以测定制剂的活性，例如制剂抑制土传植物病原真菌的菌丝生长或改善动物生长或健康的能力。
抗病原真菌活性可以通过制剂抑制土传丝状植物病原真菌的菌丝生长或真菌孢子萌发的能力来评估，所述土传丝状植物病原真菌来自以下的1种、2种、3种、4种、5种或优选为以下的每一种：fusariumspp.、colletotrichumspp.、rhizoctoniaspp.、phytophthoraspp.、alternariaspp.gaeumannomycesgraminis、verticilliumdahliae、calonectrianivale、ceratobasidiumcornigerum、botryosphaeriaberengeriana、corynesporacassiicola。
本发明的制剂可使经处理的动物与对照相比在生产参数方面有提高。生产参数包括但不限于平均每日增重、饲料转化率以及动物组中的生长一致性。
根据上述内容可以理解，本文所使用的术语“枯草芽孢杆菌hf1制剂”或类似词可以理解为是指基于或衍生自所保藏的枯草芽孢杆菌hf1的任何制剂，包括但不限于：
●保藏的枯草芽孢杆菌hf1菌株；
●由该菌株产生的衍生突变菌株；
●枯草芽孢杆菌hf1菌株的孢子；
●来自枯草芽孢杆菌hf1的上清液；
●来自枯草芽孢杆菌hf1的、部分纯化或浓缩的上清液；
●源自这些中任一种的活性物质，该物质本文描述的一种或多种活性，比如在土传丝状植物病原真菌方面的活性或者能改善肉鸡体重或动物健康的活性。
正如上面所阐述的，本发明提供了包括如上所述的一种或多种枯草芽孢杆菌hf1制剂的组合物。这种组合物优选还含有适于该组合物的用途的其他材料或载体。
本发明的其他方面包括使用枯草芽孢杆菌hf制剂控制植物疾病或改善动物健康的方法。
本发明的优选方法
因此，一方面，本发明提供了一种用于治疗或控制植物疾病的方法，所述方法包括使植物与本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂接触。
上下文中提到的“控制”不应该被视为其意味着从待保护植物中完全消灭疾病或病原菌，其还包括抑制或以其他方式减少或最小化病原菌的影响，或者增加染上病原菌的植物的产量(或降低死亡率)。
所述植物通常是一种农作物。可根据本发明处理的植物的非限制性实例在下文中有更详细的描述。
所述疾病任选地是一种土壤或空气传播疾病。
优选地，所述疾病是由植物病原真菌引起的疾病。真菌疾病的实例是白粉病。
这种制剂可用于抑制菌丝生长或真菌孢子萌发。
因此，本发明提供了控制至少一种植物病原真菌的方法，该方法包括使本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂与真菌接触。该方法可被应用于杀死病原菌。
本发明提供了一种用于土壤修复的方法，该方法包括使本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂接触土壤。
本发明的方法可用于提高作物产量。
本发明提供了一种用于农产品(例如收获的作物)保鲜的方法，该方法包括使本发明得枯草孢杆菌hf1制剂接触作物。
任选地，来源于枯草芽孢杆菌hf1或其突变株的物质可与其他活性剂例如杀虫剂或其他疾病控制剂联合使用。
用于植物
另一方面，本发明提供一种组合物，该组合物含有至少一种本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂和农业上可接受的载体。
本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂以有效控制目标疾病或病原菌的量存在于该组合物中。有效浓度取决于：该枯草芽孢杆菌hf1制剂的使用形式；待施用该组合物的环境；病害或病原菌感染的类型、浓度及程度、温度；季节；湿度；植物在生长季节的阶段；植物年龄；施用的方法、施用量和频率；正在施用的常规杀真菌剂和杀虫剂等的数量及类型；植物的处理(例如修剪、放牧和灌溉)。在配制该组合物时，所有这些因素都可能考虑在内。
本发明的组合物可通过将一种或多种枯草芽孢杆菌hf1制剂和所需的农业用载体混合而制成。
本发明的组合物可包括保湿剂、铺展剂、黏贴剂、稳定剂、渗透剂、乳化剂、分散剂、表面活性剂、缓冲剂、粘合剂及本领域通常采用的其他成分，杀虫剂或控制组合物。
本发明的组合物可以是液体或固体形式，液体组合物通常包括水、盐水或油类(如植物油或矿物油)。本发明所用的植物油的实例为豆油和椰子油。
该组合物可以是以下形式：喷雾、悬液、浓缩物、泡沫、浸液、浆液、可注射剂、凝胶、药浴液、糊剂等。
液体组合物可通过混合液态的农业上可接受的载体与枯草芽孢杆菌hf1制剂制备而成。传统的配方技术可以用于生产液体组合物。
在一个实施方案中，该组合物为固体形式。该组合物可由本发明的液体组合物经干燥制成。另外，可用于本发明的固体组合物可通过将本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂与各种无机或生物材料混合制备而成。例如，固体无机农业用载体可包括碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或硅酸盐、浮石、石灰、膨润土或它们的混合物。固体生物材料可包括粉末状棕榈壳、玉米外皮和花生壳等。
该组合物可以配制成粉剂、颗粒剂、种子包衣、可润湿粉剂等。可在施用之前配制该组合物以提供液体组合物。
本发明的组合物可以是控释或缓释制剂的形式。
在一个实施方案中，将枯草芽孢杆菌hf1制剂施用到植物或农产品。
如上所述，枯草芽孢杆菌hf1制剂可施用于病原菌所处的环境，通常为待保护的植物周围或已经种植有植物或将种植植物的土壤。喷雾、撒粉、土壤浸泡、种子包衣、叶面喷洒、雾化及熏蒸都是可能用到的方法。
例如，施用量可以为1010-1014个孢子/公顷，优选1012-1013个孢子/公顷。
通常的施用量可以为50-10000克/公顷。一般为100-5000克/公顷或500-1500克/公顷。
另外，本发明的制剂可以以种子浸泡的方式施用于种子，随后可以再将种子干燥。
还有，本发明的制剂也施用于植物幼苗。
根据需求可以一次或重复施用。也考虑在植物生命周期中的不同时间进行施用。例如，在收获时或收获后施用，以预防或减少收获后的病害。
使用本发明的组合物可处理多种植物。这种植物包括谷物、蔬菜和可耕种的作物、草、草坪、牧场、果树和观赏树木及植物。优选植物为开花植物和药用植物。
比如太子参(pseudostellariaheterophylla)这种植物。
可能特别受益于本发明的组合物和菌株的使用的可耕种作物包括十字花科植物和芸苔属植物。例如卷心菜、青花菜、花椰菜、抱子甘蓝和白菜。
用于动物
因此，一方面，本发明提供了一种改善动物的生长和健康的方法，所述方法包括向动物施用本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂。
该方法通常包括将该制剂(例如作为“益生菌制剂”或动物饲料)口服施用至动物。口服施用包括但不限于以饲料(包含饮用水)中递送，替代方案还包括通过口服灌胃或气溶胶喷雾施用。
通过该方法，动物的胃肠道健康状况可得到改善。
与对照动物(没有接受本发明的枯草芽孢杆菌hf1制剂)相比，改善生长通常会提高经处理的动物的增长率——例如至少5％、10％、15％或20％的重量增加——例如5-25％。
适宜的动物是家禽，更优选是鸡或火鸡。如果在动物饲料中供应，则饲料每克成品饲料可包含104-109cfu细菌。适宜的饲料每克饲料包含105-5×107cfu细菌。枯草芽孢杆菌hf1制剂可以在生产期间或生产后由供应商添加到饲料中，或者正好在向动物提供食物之前由饲养动物的人员添加至饲料中。用于本文描述的方法和组合物的枯草芽孢杆菌hf1菌株是特别适合的，因为它们在干燥颗粒饲料产品生产方法的加热和压力条件下能够以孢子的方式生存。
在其他实施方案中，动物是人。
提供了改善这种动物中的胃肠道健康的方法。
在其它实施方案中，动物是养殖的水生动物，如鱼类、甲壳纲动物(如虾、对虾、蟹)或软体动物。
还提供了防治动物真菌感染的方法。
因此，一方面，本发明提供一种含有本文公开的枯草芽孢杆菌hf1制剂的动物饲料。其中所述制剂是菌株或孢子，该饲料每克成品饲料可包含约104-109cfu细菌
本文中的增重方法可以是非治疗性的。
然而，在其他方面，本发明提供：
(i)本文公开的枯草芽孢杆菌hf1制剂用于本文描述的治疗方法或疗法中；
(ii)本文公开的枯草芽孢杆菌hf1制剂在制备用于本文描述的治疗方法或疗法中的组合物(药物及兽药产品)中的应用。
定义
“病原菌”是指引起植物或动物病害或对植物或动物造成损害的微生物(真菌或细菌)。例如，这种损害可与植物的生长、产量、繁殖或生存能力有关，也可以是表面的损害。优选地，损害是指具有经济重要性的损害。在优选的实施方案中，术语“病原菌”是引起植物病害的丝状真菌。植物优选是栽培植物。
“包含”这个术语用在说明书中意思是“至少由……组成”。当解释说明书中包括术语“包含”的每个表述时，除了以术语开始那些特征以外，也可存在其他特征。一些相关术语，例如术语“包含”和“含有”用同样的方式解释。
在说明书中术语“基本上由……组成”指的是所描述的特征并且允许出现不会实质性地改变所描述的特性的基本特性的其他特征。
术语“有效量”用在这里是指一个有效的控制或者消灭害虫，特别是昆虫害虫，的量。
术语“生物上纯的培养物”或者“生物上纯的分离株”用在这里指本发明相关菌株的培养物，其包含至少90％、优选95％、优选99％、更优选至少99.5％的相关菌株的细胞。
“动物”这个术语包括哺乳动物例如人类和牲畜或者伴侣动物或者野生动物(例如，胎盘哺乳动物，有袋类动物(例如袋鼠，袋熊)，单孔类动物(例如鸭嘴兽)，啮齿动物(例如豚鼠，仓鼠，大鼠，小鼠)，鼠科动物(例如老鼠)，兔科动物(例如兔)，犬科动物(例如狗)，猫科动物(例如猫)，马科动物(例如马)，猪科动物(例如猪)，羊科动物(例如羊)，牛科动物(例如牛)，灵长目动物，类人猿(例如，猴或猿)，猴(例如狨、狒狒)、猿(例如大猩猩，黑猩猩，猩猩，长臂猿)，还有鱼类，鸟类，爬行动物，甲壳纲动物，软体动物。优选地，养殖场养殖动物及水产养殖动物。
附图说明
图1—培养在lb(lysogenybroth，10g/ml的蛋白胨，5g/l的酵母提取物，10g/l的nacl)琼脂培养基上的hf1的菌落形态是不规则的，具有叶状的边缘和折叠的表面。
图2—hf1在不同培养基中的生长曲线。注释：lb，lb液体培养基；1％和2.8％endo，培养基中葡萄糖的浓度分别是1％和2.8％。
图3a—hf1对重要的植物病原菌的抑制效应。
图3b—hf1对真菌的抑制效果：a＝稻瘟菌(riceblaststrain)菌株1-2-5；b＝稻瘟菌(magnaporthegrisea)附着胞菌株3-2；c＝稻瘟菌菌株5-2-2。
图4—没有活细胞的hf1发酵液对胶胞炭疽菌(colletotrichumgloeosporiodes)的菌丝生长的抑制。注释：a，hf1发酵液在121℃灭菌10分钟；b，hf1发酵液通过过滤器过滤。
图5—hf1发酵液对烟草赤星病原菌(alternariaalternata)的孢子萌发的抑制作用。注释：hf1发酵液在121℃灭菌10分钟；b，hf1发酵液通过生物过滤器过滤。(a)发酵液稀释100倍，(b)发酵液稀释500倍。
图6—hf1对土壤传播病害的生物防治效应和改善太子参(pseudostellariaheterophylla)生长的效应。
图7—hf1lb发酵液对白粉病的抑制效应。注释：a和b的目标作物分别是黄瓜和豌豆。hf1lb发酵液包含hf1的活细胞，并被稀释300倍。根据操作说明书，将嘧菌酯和乙嘧酚溶液稀释1000倍。
图8—hf1对草莓生物的保鲜效应。注释：a，对照；b，0.2％壳聚糖；c，hf1和0.2％甲壳素。
图9—hf1对肉鸡的生长改善作用。
图10—基于16srdna的hf1的系统进化树。注释：不同物种16srdna序列从ncbi数据库下载。b.atrophaeusjcm9070，nr_024689.1；b.carboniphilusjcm9731，nr_024690.1；b.flexusifo15715，nr_024691.1；b.haloduransatcc27557，nr_112056.1；b.lentusncimb8773，nr_040792.1；b.marinus，ab021190.1；b.mojavensisifo15718，nr_024693.1；b.mycoides273，nr_036880.1；b.niaciniifo15566，nr_024695.1；b.psychrosaccharolyticusatcc23296，nr_040793.1；b.vallismortisdsm，nr_024696.1；b.weihenstephanensisdsm，nr_024697.1；b.amyloliquefaciensbg11，kf699870。以下16srdna序列来自基因组序列。b.anthracisames，cp010792.1；b.cereushn002，gq478254.1；b.licheniformisatcc14580，cp000002.3；b.megateriumdsm319，cp009920.1；b.pumilussafr-032，cp000813.1；b.subtilis168，cp010052.1；b.thuringiensis97-27，ae017355.1。
图11—菌株的生物量(od)与抑菌圈尺寸的关系，在振荡器中，hf1在endo培养基中培养，在不同的培养时间，测定其od值并同时使用灭菌后的发酵液用杯碟法测定对真菌生长的抑制作用。所用真菌为烟草赤星病原菌(alternariaalternata)。
实施例
实施例1—hf1的分离和分子鉴定
菌株hf1是从黄瓜(cucumissativus)根际土壤中分离出来的。
根据hf1的基因组注释，重叠群15(1627bp)是16srdna序列，该序列如下所示：
基于用基础局部比对搜索工具(blast)进行的16srdna序列的比对，发现hf1的16srdna序列与枯草芽孢杆菌属的16srdna序列高度同源，例如枯草芽孢杆菌亚种subtilisstr.168(100％)，该菌株是枯草芽孢杆菌标准菌株。然后通过使用邻接法的mage6.0重新构建进化树(参见图10)，表明hf1属于枯草芽孢杆菌属。最终，我们将此菌株命名为枯草芽孢杆菌hf1，简称为hf1。
实施例2-hf1的特性
hf1是革兰氏阳性的、需氧的形成孢子的细菌，其在lb(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/lnacl)琼脂培养基上培养的菌落形态是不规则的，具有叶状边缘(图1)。
hf1对许多抗生素非常敏感，如氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素、利福平、氨苄霉素、四环素、链霉素、盘尼西林和羧苄青霉素等。
在28℃，170rpm下，在具有200mllb液体培养基的500ml烧瓶中，hf1的初始od600值为0.267±0.0015。在24小时的孵育后，hf1的hf1的od600达到5.76±0.03(图2)。
实施例3.-用于hf1的大规模生产的优选培养基
发现了hf1的优选培养基，其被命名为“endo”，其含有葡萄糖10-28g/l、kno36g/l、kh2po41.2g/l、mgso4·7h2o1.2g/l、na3c6h5o70.2g/l、cacl2·2h2o105mg/l、feso4·7h2o16mg/l、edta2.1mg/l、h3bo32.86mg/l、znso4·7h2o0.222mg/l、mncl2·4h2o1.81mg/l、na2moo40.021mg/l和cuso4·5h2o0.07mg/l。hf1在分别含有10g/l和28g/l葡萄糖的endo培养基中的生长状态与lb培养基类似，但在相同条件下hf1的产生量均是lb培养基的两倍(图2)。用分别含有10g/l和28g/l葡萄糖的endo培养基培养hf1菌体24小时后，其od600值可分别为11.22±0.04或11.46±0.11。
实施例4-hf1具有广谱抗菌活性，这表明hf1是重要的、有潜力的、用于抑制植物疾病的生物控制剂
将不同的真菌植物病原菌分别接种在固体pda培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，200g/l马铃薯，20g/l葡萄糖，10g/l琼脂)上，并在28℃培养约4天。用打孔器在具有相同生长能力的菌落的边缘打孔，获得直径为0.5cm的带有菌丝的不同琼脂盘，将琼脂盘接种到含有pda培养的培养皿的中央。然后在距离琼脂盘约2cm的地方接种1μlhf1lb培养物液体，培养5天后观察hf1的抑制效果。
根据培养结果，hf1能够抑制许多土传丝状植物病原真菌的菌丝生长(图3)，例如fusariumspp.、colletotrichumspp.、rhizoctoniaspp.、phytophthoraparasitica、alternariaspp.、gaeumannomycesgraminis、verticilliumdahliae、calonectrianivale、ceratobasidiumcornigerum、botryosphaeriaberengeriana、stemphyliumsolani、coniothyriumspp.、phomacrystallifera、myrmecridiumschulzeri、corynesporacassiicola和magnaporthegrisea。
在实验条件下，由于烟草疫霉(phytophthoranicotianae)和黄曲霉(aspergillusflavus)生长太快，而观察不到发酵液的抑菌活性，尽管发明人认为在更高的浓度下hf1发酵液可以表现出抑制这两种菌株的活性。
在另一个独立实验中，在所使用的条件下，发酵液不抑制大肠杆菌(e.coli)的生长。
结果表明hf1可以用作生物控制剂或土壤修复剂以抑制土传疾病。
实施例5-hf1发酵液具有抑制菌丝体生长的活性
为了评估来自2-天lb液体培养基培养物的hf1发酵液对真菌生长的抑制效应，进行牛津杯测试。根据实施例4准备对峙培养的试验。
在170rpm和28℃下，培养hf1约2天。离心后，收集上清液，然后将一部分上清液在121℃下灭菌10分钟，剩余的部分用生物过滤器(直径0.22μm)过滤。
将牛津杯放在培养基上，每个牛津杯加入100μl上述发酵液。约4天后，可以记录结果(图4)。结果显示通过高温灭菌或者生物过滤除菌的hf1的lb培养发酵液在抑制真菌菌丝生长方面有显著作用。
实施例6-hf1的发酵液可以抑制真菌孢子萌发
真菌烟草赤星病原菌在pda固体培养基上培养约5天。向培养皿(9cm)中加入5ml无菌水，刮下菌丝，用水清洗，然后通过过滤获得孢子，密度大约为每毫升1,000个孢子。
如实施例5准备1mlhf1lb发酵液，将其加入100ml或500mlpda培养基中。然后，将hf1发酵液分别稀释100倍和500倍。将约0.2ml孢子悬液铺在pda固体培养基平板上。
结果发现(图5)，100倍稀释的hf1发酵液可以完全抑制烟草赤星病原菌的孢子萌发。然而，高温灭菌的、500倍稀释的hf1发酵液的抑制率(用如下的公式1计算)是80.25±3.57％，要高于经过滤的、500倍稀释的hf1发酵液的抑制率(大约20.45±2.43％)。
公式1
注释：ck，对照中的菌落数量；t，处理组中的菌落数量。
实施例7-hf1可以用作用于抑制一些土传疾病并提高作物产量的土壤修复剂
为了调查hf1作为土壤修复剂的效果，我们选择了目标药用植物太子参。太子参的土传病害，例如由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)引起的根腐病和由立枯丝核菌(r.solani)引起的立枯病，会因此实行连续种植而在土地变得非常严重。
带有严重土传病害的土地被用作试验田。这些试验田被分为10个试验区。一个由5个试验区组成的组，用带有活细胞的hf1发酵液处理，其它试验区作为对照。每个试验区(约2m长，1.5m宽)种植300株幼苗。在收获时记录死亡率(见如下的公式2)。
种子于十月份用100倍稀释的、带有活细胞的hf1发酵液浸泡约2min，然后在空气中晾干。然后将种子种在土壤中。植株出苗后，每株幼苗用大约20ml、300倍稀释的、带有活细胞的hf1发酵液浇灌。待下一个春天来临时，幼苗开始生长，用约20ml、300倍稀释的、带有活细胞的hf1发酵液浇灌每株植物。而对照则用20ml水浇灌每株植物。
公式2
注释：ck，对照组的植株数量；t，处理组的植株数量
在试验田中，处理组和对照组的死亡率分别是28.29±6.39％和63.45±8.56％。处理组的贮藏根比对照组要大(图6)，并且处理组和对照组的平均鲜重分别是每公顷958.05±89.35kg和每公顷343.45±88.35kg。结果表明，hf1可以是一种有潜力的抑制土传病害并提高作物产量的土壤修复剂。
实施例8-hf1lb发酵液可以抑制白粉病
hf1在lb液体培养基中培养。带有活细胞的发酵液被称作“hf1lb发酵液”。
带有活细胞的hf1lb发酵液进行300倍稀释，作为叶面喷雾施用。
1,000倍稀释的嘧菌酯或者乙嘧酚作为阳性对照。水作为阴性对照(ck)。
将100株植物用于进行处理，每5-7天叶喷一次，共约3次。病害分级如下：0级，没有斑点；1级，感病面积与总叶面积的比例小于25％；3级，感病面积与总叶面积的比例为25％-50％；5级，感病面积与总叶面积的比例为50％-75％；7级，感病面积与总叶面积的比例大于75％。病情指数(％)＝∑(病害级数×相应叶片的数量)/(调查叶片总数×最高病害级数)]×100％。控制效应(％)＝[1-(处理组的病情指数/对照的病情指数)]×100％。
在温室中，hf1lb发酵液对黄瓜白粉病(sphaerothecafuliginea(schlecht)poll)的控制效应大约为89.46±3.65％，阳性对照为约91.26±4.11％。对于豌豆而言，带有活细胞的hf1lb发酵液对白粉病(erysiphepisidc)的控制效应大约是81.23±2.31％，阳性对照为约84.98±3.71％。结果显示，带有活细胞的hf1lb可以抑制白粉病。
实施例9-hf1lb发酵液可以用作生物保鲜剂。
为了调查hf1的生物保鲜效应，将hf1发酵液在100℃下加热约10min，然后12,000rpm离心。收集上清液，并100倍稀释。以易腐烂的草莓作为目标水果。草莓分别在无菌水(阴性对照)、0.2％甲壳素或者含有0.2％甲壳素的100倍稀释的hf1lb发酵液中浸泡约20-30秒，然后晾干。将经处理的水果在室温下装在保鲜盒中。每种处理用10个草莓，并且每种处理重复3次。
处理后五天，阴性对照、0.2％甲壳素和含0.2％甲壳素的hf1lb发酵液的草莓发霉腐烂的比例分别为100％、82.35±4.32％和13.45±2.45％(图7)。
因此，hf1lb发酵液可以作为生物保鲜剂。
实施例10-hf1发酵液可以作为饲料添加剂以改善目标动物的生长。
低剂量的抗生素可以提高动物体重，但它会严重地影响动物，最终影响人的健康，并且还对环境造成污染。
需要用于代替动物饲养中的抗生素的更安全的、有害性更小的添加剂。
在中国，枯草芽孢杆菌已被农业部授权作为白羽肉鸡的饲料添加剂。与阴性对照相比，通过使用常规枯草芽孢杆菌菌株获得的最终增重为3.5％，与抗生素饲养没有明显的区别。
根据本文描述的发明人的实验结果，发现低剂量(在饮用水中添加0.1％-1％)的hf1可以显著地改善白羽肉鸡的体重增加。
在第一个实验中，分别在lb和endo培养基中培养hf1。10,000rpm离心后将发酵液在100℃下加热约10分钟。
将lb发酵液用水稀释至1％，0.5％和0.25％，endo发酵液也用水稀释至1％。
从第1天至第42天，将稀释的发酵液作为肉鸡(gallusgallusdomesticusbaiyu)的日常饮用水，并用基础饲料饲养肉鸡。食用基础饲料并饮用无任何添加剂的水的肉鸡作为阴性对照(ck)；食用含15mg/kg维吉尼亚霉素的基础饲料的肉鸡作为阳性对照。
每种处理包含6个组，每组10只鸡。每7天，在8点喂食之前记录鸡的体重。
当在第42天试验结束时，饮用1％、0.5％、0.25％lb发酵液和1％endo发酵液的鸡的平均体重分别为2771.90±19.06g、2698.38±13.92g、2651.55±6.28g和2775.23±39.69g。
ck和阳性对照的平均体重分别是2309.90±26.39g和2331.95±16.60g。
与ck相比，饮用1％、0.5％、0.25％lb发酵液和1％endo发酵液的鸡的体重增长率分别是20.01±1.85％、16.82±1.79％、14.80±1.73％、20.15±1.80％。
与阳性对照相比，饮用1％、0.5％、0.25％lb发酵液和1％endo发酵液的鸡的体重增长率分别是13.73±1.33％、10.71±1.24％、8.79±1.16％和13.86±1.26％。
解剖学结果显示，与对照和抗生素处理相比，鸡的肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏、十二指肠和空肠中均没有发现异常症状。在血液生化检测中也没有发现任何异常。
然而，经处理动物十二指肠中的肠绒毛变细变长，可以发现更多的脾小体。不希望被理论束缚，这些改变可能使鸡的健康获益，因此有增重效应。
在其他实验中，在42天时，hf1处理组的体重明显高于阴性对照和阳性对照的体重：与阴性对照相比，体重增加28％，与与已有的商用枯草芽孢杆菌益生菌补充剂相比，体重增加16％，与不同的抗生素(维吉尼亚霉素，阿莫西林)相比，体重增加25％。
再者，证明了当用添加有干燥形式的hf1培养物的固体(淀粉或稻壳/淀粉混合物)饲养鸡时，也表现出了有益的活性(结果未示出)。
实施例11-通过急性毒性试验测试hf1对动物的是安全的。
为了研究hf1急性毒性，选择20±2g的cd-1小鼠作为目标动物。小鼠被分成5组。每组共六只小鼠(3只雄鼠和3只雌鼠)。小鼠在实验前一天停止喂食。通过一次灌胃向每个组分别施用0.4ml0.8％nacl、109cfu/ml、1011cfu/ml、1012cfu/ml的hf1lb发酵液以及不稀释的hf1lb发酵液。然后正常饲喂小鼠约15天，15天后杀死所有小鼠。观察小鼠的临床表现。
实验结束时，所有测试小鼠都活着。测试的小鼠的临床表现与对照(0.8％nacl组)相比没有什么不同。临床表现包括每日进食、饮水、毛色、粪便、体重、死亡率和一般解剖结果。根据解剖结果发现，在所有的试验小鼠中没有可见的异常组织。急性毒性试验显示，芽孢杆菌菌株hf1对于哺乳动物来说是安全的。
印出(原始文件为电子表格)
(该表格不作为且也不被视为是国际申请的表格)