组织因子途径抑制剂抗体及其用途的制作方法

本发明涉及结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的抗体。
背景技术：
：血友病a和b是分别由血浆蛋白因子viii(fviii)或因子ix(fix)功能缺陷所引起的x染色体连锁遗传疾病。血友病的临床严重性与凝血因子活性的残留水平有关。<1％的因子活性与重型表型有关，中间型血友病与2％至5％的因子活性有关，轻型与5％至40％的因子活性有关。这些疾病的护理标准是通过静脉输注来替代缺失的凝血因子。该替代因子通常是重组蛋白，例如xyntha(因子viii)或benefix(fix)，但仍使用各种纯度的血浆衍生产品。以替代因子进行的治疗可是不定期的(在出血发生时根据需要来治疗出血)，或预防性(通过将因子水平保持在保护范围内来预防出血)。有明显证据表明，预防性治疗可预防出血及血友病患者主要发病的相关关节损伤。有效的预防性治疗需要每周静脉注射因子3至4次，这对依从性造成困难并降低生活质量。由于制造凝血因子的复杂性，治疗成本亦昂贵。此外，大量患者(高达32％的是重型血友病a患者)发展出针对所施用的因子的中和抗体，这被在这些基因中具有突变的患者视为外源蛋白。这些患者需要替代的治疗方式，例如旁路因子、因子viia(novoseven)。治疗的替代方法是通过扩充完整的外源性途径来绕过对替代因子的需求。血友病患者具有一些通过其完整的外源性途径来停止出血的能力；然而这不足以停止大出血(majorbleed)或预防自发性出血。该外源性途径不足以提供保护，因为其被组织因子途径抑制剂(tfpi)快速关闭。虽然wo2010/017196(拜耳公司(bayer))、wo2011/109452(拜耳公司)、wo2014/144577(拜耳公司)、wo2010/072687(诺和诺德公司(novonordisk))、wo2012/001087(诺和诺德公司)、wo2014/140240(诺和诺德公司)和wo2015/007880(诺和诺德公司)公开了结合人类tfpi的抗体，但是它们并未提供本发明的抗体，所述抗体具有成为新型血友病潜在治疗剂的特征。可提供预防性保护同时减少凝血因子给药频率、减少因子使用量、允许替代递送途径(例如皮下)及具有较低的产生中和抗体的风险的产品，将满足血友病患者大量未被满足的需求。技术实现要素：本发明公开及例示了结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的抗体(及其抗原结合片段)。本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本发明所描述的本发明具体实施方案的许多等价物。该类等价物预期包含在下列实施方案(e)中。e1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域2(k2)的表位，其中所述表位包含残基ile105、arg107及leu131(根据seqidno：2编号)。e2.实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合tfpi的kunitz结构域1(k1)。e3.实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含一或多个选自以下组的残基：cys106、gly108、cys130、leu131及gly132(根据seqidno：2编号)。e4.实施方案1至3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含残基cys106、gly108、cys130、leu131及gly132(根据seqidno：2编号)。e5.实施方案1至4任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含一或多个选自以下组的残基：asp102、arg112、tyr127、gly129、met134及glu138(根据seqidno：2编号)。e6.实施方案1至5任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含asp102、arg112、tyr127、gly129、met134及glu138(根据seqidno：2编号)。e7.实施方案1至6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：e100、e101、p103、y109、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126及l140(根据seqidno：2编号)。e8.实施方案1至7任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：e100、e101、p103、y109、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126及l140(根据seqidno：2编号)。e9.实施方案1至6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、e100、e101、p103、y109、k126及g128(根据seqidno：2编号)。e10.实施方案1至6及9任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：d31、d32、p34、c35、k36、e100、e101、p103、y109、k126及g128(根据seqidno：2编号)。e11.实施方案1至10任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含一或多个选自以下组的残基：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、asn133、met134及glu138(根据seqidno：2编号)，其中所述表位残基由于与所述抗体或其抗原结合片段的相互作用而在隐藏的表面区域(bsa)中具有非零变化。e12.实施方案11的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、asn133、met134及glu138(根据seqidno：2编号)。e13.实施方案1至12任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含一或多个选自以下组的残基：asp102、arg107、arg112、tyr127及leu131(根据seqidno：2编号)，其中所述表位残基与来自所述抗体或其抗原结合片段的残基参与氢键。e14.实施方案13的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含：asp102、arg107、arg112、tyr127及leu131(根据seqidno：2编号)。e15.实施方案1至14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含一或多个选自以下组的接触残基：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、met134及glu138(根据seqidno：2编号)。e16.实施方案15项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、met134及glu138(根据seqidno：2编号)。e17.实施方案1至16任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列由于与tfpi相互作用而在bsa中具有非零变化的重(h)链和轻(l)链抗原互补位(paratope)残基(根据kabat编号)：h33ala、h58tyr、h95leu、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、h100aser、l29ala、l31tyr、l91tyr、l95aser及l95bgly。e18.实施方案1至17任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列接触残基(根据kabat编号)：(1)h47是trp或tyr；(b)h58是tyr；及(c)l91是tyr或arg；并任选地包含：(d)l96是gly或asn。e19.实施方案1至18任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列接触残基(根据kabat编号)：(a)h33是ala、asn、gly、his、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp或val；(b)h47是trp或tyr；(c)h50是ala、arg、gly、lys、met、phe、pro、ser、thr、tyr或val；(d)h51是ile、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(e)h52是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、trp、tyr或val；(f)h56是ser、arg、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(g)h58是tyr；(h)h95是leu、gln、ile、phe或tyr；(i)h96是gly、ala、arg、asn、asp、gln、ile、lys、met、phe、pro、ser、thr或val；(j)h97是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(k)h98是thr、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(l)h99是ser、ala、gly、phe或pro；(m)h100是leu、arg、his、ile、leu、lys、phe、pro、trp、tyr或val；(n)h100a是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp；(o)l29是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp、tyr、val；(p)l31是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(q)l91是tyr或arg；(r)l95a是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(s)l95b是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；及(t)l95c是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；并任选地包含下列残基：(u)l93是tyr、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；及(v)l96是gly或asn。e20.实施方案1至18任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列接触残基(根据kabat编号)：(a)h33是ala或val；(b)h47是trp；(c)h50是ala；(d)h51是ile；(e)h52是ser、arg、lys、phe或tyr；(f)h56是ser、arg或lys；(g)h58是tyr；(h)h95是leu；(i)h96是gly、ala、arg、asn、lys、pro、ser或val；(j)h97是ala；(k)h98是thr、his、ile、leu、met、phe或tyr；(1)h99是ser；(m)h100是leu、phe、trp或tyr；(n)h100a是ser、arg、asn、gln、glu、his、leu、lys、met、phe、pro或trp；(o)l29是ala；(p)l31是tyr；(q)l91是tyr；(r)l95a是ser、phe、trp或tyr；(s)l95b是gly；及(t)l95c是ser、arg、asn、gln、glu、ile、leu、lys、met、phe、trp、tyr或val；并任选地包含下列残基：(u)l93是ser；及(v)l96是gly。e21.实施方案1至18任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列接触残基(根据kabat编号)：(a)h33是ala、val、his或phe；(b)h47是trp或tyr；(c)h50是ala、thr、ser或phe；(d)h51是ile、arg、lys或pro；(e)h52是ser、phe、arg或tyr；(f)h56是ser、lys、tyr或phe；(g)h58是tyr；(h)h95是leu、ile、gln或phe；(i)h96是gly、arg、asn或lys；(j)h97是ala、leu、tyr或ile；(k)h98是thr、tyr、phe或his；(1)h99是ser、pro、ala或phe；(m)h100是leu、tyr、trp或phe；(n)h100a是ser、arg、leu或trp；(o)l29是ala、glu、asp或gln；(p)l31是tyr、glu、asp或trp；(q)l91是ty或arg；(r)l95a是ser、phe、tyr或his；l95b是gly、glu、asp或pro；及(t)l95c是ser、trp、tyr或phe；并任选地包含下列残基：(u)l93是ser、glu、asp或his；及(v)l96是gly或asn。e22.实施方案1至18任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列接触残基(根据kabat编号)：h33ala、h47trp、h50ala、h51ile、h52ser、h56ser、h58tyr、h95leu、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、h100aser、l29ala、l31tyr、l91tyr、l95aser、l95bgly及l95cser；并任选地包含下列残基：l93ser及l96gly。e23.实施方案1至22任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)，所述vh包含：(a)包含seqidno：38的氨基酸序列的vh互补决定区1(cdr-h1)；(b)包含seqidno：39的氨基酸序列的vh互补决定区2(cdr-h2)；及(c)包含seqidno：40的氨基酸序列的vh互补决定区3(cdr-h3)。e24.实施方案1至22任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：41的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e25.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3构架序列。e26.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh1构架序列。e27.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh5构架序列。e28.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23或ighv1-69的vh构架序列。e29.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-7的vh构架序列。e30.实施方案1至24任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e31.实施方案1至30任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与选自以下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：41、63及65。e32.实施方案1至31任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有选自以下组的氨基酸序列：seqidno：41、63及65。e33.实施方案1至32任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：41的氨基酸序列。e34.实施方案1至32任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：63的氨基酸序列。e35.实施方案1至32任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：65的氨基酸序列。e36.实施方案1至35任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(vl)，所述vl包含：(a)包含seqidno：33的氨基酸序列的vl互补决定区1(cdr-l1)；(b)包含seqidno：34的氨基酸序列的vl互补决定区2(cdr-l2)；及(c)包含seqidno：35的氨基酸序列的vl互补决定区3(cdr-l3)。e37.实施方案1至35任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：36的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。e38.实施方案1至37任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk构架序列。e39.实施方案1至37任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vλ构架序列。e40.实施方案1至37任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20的vl构架序列。e41.实施方案1至37任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv1-39的vl构架序列。e42.实施方案1至37任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e43.实施方案1至42任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：36至少90％相同的氨基酸序列。e44.实施方案1至43任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：36的氨基酸序列。e45.实施方案1至44任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区(ch)，所述ch含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e46.实施方案1至45任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：20的氨基酸序列。e47.实施方案1至46任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链恒定区(cl)，所述cl含有与seqidno：26至少90％相同的氨基酸序列的。e48.实施方案1至47任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：26的氨基酸序列的cl。e49.实施方案1至48任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e50.实施方案49项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga的fc结构域。e51.实施方案50项的抗体或其抗原结合片段，其中所述iga是iga1或iga2。e52.实施方案49项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igd的fc结构域。e53.实施方案49项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是ige的fc结构域。e54.实施方案49项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igm的fc结构域。e55.实施方案49项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg的fc结构域。e56.实施方案55项的抗体或其抗原结合片段，其中所述igg是igg1、igg2、igg3或igg4。e57.实施方案1至56任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：42的氨基酸序列。e58.实施方案1至56任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：64的氨基酸序列。e59.实施方案1至56任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：66的氨基酸序列的。e60.实施方案1至59任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：37的氨基酸序列。e61.实施方案1至60任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含由存在于以atcc保藏号pta-122329保藏的质粒中的插入片段编码的vh序列。e62.实施方案1至61任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含由存在于以atcc保藏号pta-122328保藏的质粒中的插入片段编码的vl序列。e63.实施方案1至4任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含一或多个选自以下组的残基：glu100、glu101、asp102、gly104及tyr109(根据seqidno：2编号)。e64.实施方案1至4项及63任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位进一步包含glu100、glu101、asp102、gly104及tyr109(根据seqidno：2编号)。e65.实施方案1至4项及63至64任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：p103、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126及l140(根据seqidno：2编号)。e66.实施方案1至4项及63至65任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：p103、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126及l140(根据seqidno：2编号)。e67.实施方案1至4项及63至64任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、p103、k126、y127、g128(根据seqidno：2编号)。e68.实施方案1至4项、63至64项及67任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：d31、d32、p34、c35、k36、p103、k126、y127、g128(根据seqidno：2编号)。e69.实施方案1至4项及63至68任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列残基(根据kabat编号)：h33ala、h35gln、h52ser、h53asn、h55arg、h56ser、h95phe、h96leu、h97his、h99ser、h101asp、l31met、l32tyr、l34his、l36tyr、l50arg、l91trp及l96tyr。e70.实施方案1至4项及63至69任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：48的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：49的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：50的氨基酸序列的cdr-h3。e71.实施方案1至4项及63至69任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：51的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e72.实施方案1至4项及63至71任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e73.实施方案1至4项及63至72任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23或ighv1-69的vh构架序列。e74.实施方案1至4项及63至72任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-7的vh构架序列。e75.实施方案1至4项及63至71任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e76.实施方案1至4项及63至75任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与选自以下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：67、69、51及79。e77.实施方案1至4项及63至76任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有选自以下组的氨基酸序列：seqidno：67、69、51及79。e78.实施方案1至4项及63至77任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：67的氨基酸序列。e79.实施方案1至4项及63至77任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：69的氨基酸序列。e80.实施方案1至4项及63至77任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：51的氨基酸序列。e81.实施方案1至4项及63至77任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)，所述vh含有seqidno：79的氨基酸序列。e82.实施方案1至4项及63至81任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有：(a)包含seqidno：43的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：44的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：45的氨基酸序列的cdr-l3。e83.实施方案1至4项及63至81任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：46的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。e84.实施方案1至4项及63至83任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e85.实施方案1至4项及63至84任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39的vl构架序列。e86.实施方案1至4项及63至83任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e87.实施方案1至4项及63至86任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与选自以下组的序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：46、71、73、75及77。e88.实施方案1至4项及63至87任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有选自以下组的氨基酸序列：seqidno：46、71、73、75及77。e89.实施方案1至4项及63至88任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：46的氨基酸序列。e90.实施方案1至4项及63至88任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：71的氨基酸序列。e91.实施方案1至4项及63至88任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：73的氨基酸序列。e92.实施方案1至4项及63至88任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：75的氨基酸序列。e93.实施方案1至4项及63至88任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：77的氨基酸序列。e94.实施方案1至4项及63至93任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e95.实施方案1至4项及63至94任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：20的氨基酸序列。e96.实施方案1至4项及63至95任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：26至少90％相同的氨基酸序列。e97.实施方案1至4项及63至96任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：26的氨基酸序列。e98.实施方案1至4项及63至97任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e99.实施方案98项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga的fc结构域。e100.实施方案99项的抗体或其抗原结合片段，其中所述iga是iga1或iga2。e101.实施方案98项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igd、ige或igm的fc结构域。e102.实施方案98项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg的fc结构域。e103.实施方案102项的抗体或其抗原结合片段，其中所述igg是igg1、igg2、igg3或igg4。e104.实施方案1至4项及63至103任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：52的氨基酸序列。e105.实施方案1至4项及63至103任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：68的氨基酸序列。e106.实施方案1至4项及63至103任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：70的氨基酸序列。e107.实施方案1至4项及63至103任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：80的氨基酸序列。e108.实施方案1至4项及63至107任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：47的氨基酸序列。e109.实施方案1至4项及63至107任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：72的氨基酸序列。e110.实施方案1至4项及63至107任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：74的氨基酸序列。e111.实施方案1至4项及63至107任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：76的氨基酸序列。e112.实施方案1至4项及63至107任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：78的氨基酸序列。e113.一种特异性结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域2(k2)中表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含残基glu101、pro103、tyr109、thr111、ser119、gln121、glu123、arg124、lys126及leu140(根据seqidno：2编号)。e114.实施方案113的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合tfpi的kunitz结构域1(k1)。e115.实施方案113或114的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：e100、d102、r107、y113、f114、n116、q118及c122(根据seqidno：2编号)。e116.实施方案113至115任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：e100、d102、r107、y113、f114、n116、q118及c122(根据seqidno：2的编号)。e117.实施方案113或114项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、e100、i105、r107、g108、y127及g128(根据seqidno：2的编号)。e118.实施方案113至114项及117任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位不包含：d31、d32、p34、c35、k36、e100、i105、r107、g108、y127及g128(根据seqidno：2的编号)。e119.实施方案113至118项的抗体或其抗原结合片段，其包含下列残基(根据kabat编号)：h50asp、h57thr、h58leu、h59tyr、h61gln、h98asp、h99tyr、h100asp、l30his、l50trp、l92tyr、l93thr、l94thr及l96tyr。e120.实施方案113至119任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：87的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：88的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：89的氨基酸序列的cdr-h3。e121.实施方案113至119任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：90的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e122.实施方案113至121任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e123.实施方案113至122任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e124.实施方案113至121任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e125.实施方案113至124任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与选自以下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：90、95、97、99、101、103、105及107。e126.实施方案113至125任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有选自以下组的氨基酸序列：seqidno：90、95、97、99、101、103、105及107。e127.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：90的氨基酸序列。e128.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：95的氨基酸序列。e129.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：97的氨基酸序列。e130.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：99的氨基酸序列。e131.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：101的氨基酸序列。e132.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：103的氨基酸序列。e133.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：105的氨基酸序列。e134.实施方案113至126任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：107的氨基酸序列。e135.实施方案113至134任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有：(a)包含seqidno：81的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：82的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：83的氨基酸序列的cdr-l3。e136.实施方案113至134任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：84的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。e137.实施方案113至136任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e138.实施方案113至137任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39的vl构架序列。e139.实施方案113至136任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e140.实施方案113至139任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与选自以下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：84、109及111。e141.实施方案113至140任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有选自以下组的氨基酸序列：seqidno：84、109及111。e142.实施方案113至141任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：84的氨基酸序列。e143.实施方案113至141任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：109的氨基酸序列。e144.实施方案113至141任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：111的氨基酸序列。e145.实施方案113至144任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e146.实施方案113至145任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：20的氨基酸序列。e147.实施方案113至144任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：91至少90％相同的氨基酸序列。e148.实施方案113至144项及147任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：91的氨基酸序列。e149.实施方案113至148任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：14至少90％相同的氨基酸序列。e150.实施方案113至149任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：14的氨基酸序列。e151.实施方案113至148任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：85至少90％相同的氨基酸序列。e152.实施方案113至148项及第151任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：85的氨基酸序列。e153.实施方案113至152任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e154.实施方案153项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)的fc结构域。e155.实施方案153项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igd、ige或igm的fc结构域。e156.实施方案153项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg的fc结构域。e157.实施方案156任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述igg是igg1、igg2、igg3或igg4。e158.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：92的氨基酸序列。e159.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：94的氨基酸序列。e160.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：96的氨基酸序列。e161.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：98的氨基酸序列。e162.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：100的氨基酸序列。e163.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：102的氨基酸序列。e164.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：104的氨基酸序列。e165.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：106的氨基酸序列。e166.实施方案113至157任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：108的氨基酸序列。e167.实施方案113至166任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：86的氨基酸序列。e168.实施方案113至166任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：93的氨基酸序列。e169.实施方案113至166任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：110的氨基酸序列。e170.实施方案113至166任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：112的氨基酸序列。e171.一种特异性结合tfpi的kunitz结构域2(k2)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：16的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：17的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：18的氨基酸序列的cdr-h3。e172.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：19的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e173.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有：(a)包含seqidno：10的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：11的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：12的氨基酸序列的cdr-l3。e174.一种特性异结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：13的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。el75.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)vh，其包含：(a)包含seqidno：16的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：17的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：18的氨基酸序列的cdr-h3；及(ii)vl，其包含：(a)包含seqidno：10的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：11的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：12的氨基酸序列的cdr-l3。e176.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：19的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列及seqidno：13的cdr-l1、cdrl3和cdr-l3序列。e177.实施方案171至176任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e178.实施方案171至177任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e179.实施方案171至176任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e180.实施方案171至179任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与seqidno：19至少90％相同的氨基酸序列。e181.实施方案171至180任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：19的氨基酸序列。e182.实施方案171至181任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e183.实施方案171至182任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39的vl构架序列。e184.实施方案171至181任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e185.实施方案171至184任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：13至少90％相同的氨基酸序列。e186.实施方案171至185任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：13的氨基酸序列。e187.实施方案171至186任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e188.实施方案171至187任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：20的氨基酸序列。e189.实施方案171至188任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：14至少90％相同的氨基酸序列。e190.实施方案171至189任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：14的氨基酸序列。e191.实施方案171至190任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e192.实施方案191项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)、igd、ige或igm的fc结构域。e193.实施方案191项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg的fc结构域。e194.实施方案191项的抗体或其抗原结合片段，其中所述igg是igg1、igg2、igg3或igg4。e195.实施方案171至194任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：21的氨基酸序列。e196.实施方案171至195任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：15的氨基酸序列。e197.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：28的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：29的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：30的氨基酸序列的cdr-h3。e198.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：31的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e199.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl：(a)包含seqidno：22的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：23的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：24的氨基酸序列的cdr-l3。e200.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：25的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。e201.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)vh，其包含：(a)包含seqidno：28的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：29的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：30的氨基酸序列的cdr-h3；及(ii)vl，其包含：(a)包含seqidno：22的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：23的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：24的氨基酸序列的cdr-l3。e202.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：31的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列及seqidno：25的cdr-l1、cdrl2及cdr-l3序列。e203.实施方案197至202任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e204.实施方案197至203任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e205.实施方案197至202任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e206.实施方案197至205任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与seqidno：31至少90％相同的氨基酸序列。e207.实施方案197至206任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：31的氨基酸序列。e208.实施方案197至207任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e209.实施方案197至208任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39的vl构架序列。e210.实施方案197至207任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e211.实施方案197至210任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：25至少90％相同的氨基酸序列。e212.实施方案197至211任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：25的氨基酸序列。e213.实施方案197至212任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e214.实施方案197至213任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：20的氨基酸序列。e215.实施方案197至214任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：26至少90％相同的氨基酸序列。e216.实施方案197至215任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：26的氨基酸序列。e217.实施方案197至216任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e218.实施方案217项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)、igd、ige或igm的fc结构域。e219.实施方案217项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的fc结构域。e220.实施方案197至219任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：32的氨基酸序列。e221.实施方案197至220任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：27的氨基酸序列。e222.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)，所述vh含有：(a)包含seqidno：58的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：59的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：60的氨基酸序列的cdr-h3。e223.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：61的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e224.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有：(a)包含seqidno：53的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：54的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：55的氨基酸序列的cdr-l3。e225.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：56的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3序列。e226.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)vh，其包含：(a)包含seqidno：58的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：59的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：60的氨基酸序列的cdr-h3；及(ii)vl，其包含：(a)包含seqidno：53的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：54的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：55的氨基酸序列的cdr-l3。e227.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：61的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列及seqidno：56的cdr-l1、cdrl3和cdr-l3序列。e228.实施方案222至227任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e229.实施方案222至228任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e230.实施方案222至227任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e231.实施方案222至230任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与seqidno：61至少90％相同的氨基酸序列。e232.实施方案222至231任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：61的氨基酸序列。e233.实施方案222至232任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e234.实施方案222至233任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39构架序列。e235.实施方案222至232任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e236.实施方案222至235任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：56至少90％相同的氨基酸序列。e237.实施方案222至236任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：56的氨基酸序列。e238.实施方案222至237任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：20至少90％相同的氨基酸序列。e239.实施方案222至238任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：20的氨基酸序列。e240.实施方案222至239任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：26至少90％相同的氨基酸序列。e241.实施方案222至240任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：26的氨基酸序列。e242.实施方案222至241任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e243.实施方案222至242任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)、igd、ige或igm的fc结构域。e244.实施方案242项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg(例如gg1、igg2、igg3或igg4)的fc结构域。e245.实施方案222至244任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含含有seqidno：62的氨基酸序列。e246.实施方案222至245任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含含有seqidno：57的氨基酸序列。e247.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：118的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：119的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：120的氨基酸序列的cdr-h3。e248.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：121的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e249.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有：(a)包含seqidno：113的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：114的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：115的氨基酸序列的cdr-l3。e250.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：116的cdr-l1、cdr-l2bcdr-l3序列。e251.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)vh，其包含：(a)包含seqidno：118的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：119的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：120的氨基酸序列的cdr-h3；及(ii)vl，其包含：(a)包含seqidno：113的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：114的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：115的氨基酸序列的cdr-l3。e252.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：121的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列，以及seqidno：116的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3序列。e253.实施方案247至253任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e254.实施方案247至253任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e255.实施方案247至252任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e256.实施方案247至255任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与seqidno：121至少90％相同的氨基酸序列。e257.实施方案247至256任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：121的氨基酸序列。e258.实施方案247至257任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e259.实施方案247至258任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39构架序列。e260.实施方案247至257任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e261.实施方案247至260任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：116至少90％相同的氨基酸序列。e262.实施方案247至261任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：116的氨基酸序列。e263.实施方案247至262任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：91至少90％相同的氨基酸序列。e264.实施方案247至263任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：91的氨基酸序列。e265.实施方案247至264任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有与seqidno：85至少90％相同的氨基酸序列。e266.实施方案247至265任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：85的氨基酸序列。e267.实施方案247至266任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e268.实施方案267项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)、igd、ige或igm的fc结构域。e269.实施方案267项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg(例如gg1、igg2、igg3或igg4)的fc结构域。e270.实施方案247至269任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：122的氨基酸序列。e271.实施方案247至270任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：117的氨基酸序列。e272.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有：(a)包含seqidno：128的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：129的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：130的氨基酸序列的cdr-h3。e273.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：131的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3序列。e274.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有下列群组：(a)包含seqidno：123的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：124的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：125的氨基酸序列的cdr-l3。e275.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：126的cdr-l1、cdrl3和cdr-l3序列。e276.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)vh，其包含：(a)包含seqidno：128的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seqidno：129的氨基酸序列的cdr-h2；及(c)包含seqidno：130的氨基酸序列的cdr-h3；及(ii)vl，其包含：(a)包含seqidno：123的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含seqidno：124的氨基酸序列的cdr-l2；及(c)包含seqidno：125的氨基酸序列的cdr-l3。e277.一种特异性结合tfpi的k2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含seqidno：131的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列及seqidno：126的cdr-l1、cdrl3和cdr-l3序列。e278.实施方案272至277任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh3、vh1或vh5构架序列。e279.实施方案272至278任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类ighv3-23、ighv1-69或ighv3-7的vh构架序列。e280.实施方案272至277任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vh生殖系共有构架序列。e281.实施方案272至280任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有与seqidno：131至少90％相同的氨基酸序列。e282.实施方案272至281任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vh，所述vh含有seqidno：131的氨基酸序列。e283.实施方案272至282任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vk或vλ构架序列。e284.实施方案272至283任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类生殖系igkv3-20或igkv1-39构架序列。e285.实施方案272至282任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人类vl生殖系共有构架序列。e286.实施方案272至285任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有与seqidno：126至少90％相同的氨基酸序列。e287.实施方案272至286任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含vl，所述vl含有seqidno：126的氨基酸序列。e288.实施方案272至287任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有与seqidno：91至少90％相同的氨基酸序列。e289.实施方案272至288任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含ch，所述ch含有seqidno：91的氨基酸序列。e290.实施方案272至289任一项的抗体或其抗原结合片段，其包cl，所述cl含含有与seqidno：85至少90％相同的氨基酸序列。e291.实施方案272至290任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含cl，所述cl含有seqidno：85的氨基酸序列。e292.实施方案272至291任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含fc结构域。e293.实施方案292项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是iga(例如iga1或iga2)、igd、ige或igm的fc结构域。e294.实施方案292项的抗体或其抗原结合片段，其中所述fc结构域是igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的fc结构域。e295.实施方案272至294任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链含有seqidno：132的氨基酸序列。e296.实施方案272至295任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链含有seqidno：127的氨基酸序列。e297.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与实施方案1至296任一项的抗体或其抗原结合片段竞争结合tfpi。e298.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自以下组的抗体竞争结合tfpi：tfpi-3、tfpi-21、tfpi-23、tfpi-24、tfpi-26、tfpi-106、tfpi-107、tfpi-108、tfpi-109、tfpi-110、tfpi-111、tfpi-112、tfpi-113、tfpi-114、tfpi-115、tfpi-118、tfpi-119、tfpi-122、tfpi-123、tfpi-126、4d8.b1、mu-hu4d8嵌合体、4d8-vk1.0xvh1.0、4d8-vk1.0xvh1.1、4d8-vk1.0xvh1.2、4d8-vk1.0xvh1.3、4d8-vk1.0xvh1.4、4d8-vk1.0xvh1.5、4d8-vk1.0xvh1.6、4d8-vk1.1xvh1.0、4d8-vk1.1xvh1.1、4d8-vk1.1xvh1.2、4d8-vk1.1xvh1.3、4d8-vk1.1xvh1.4、4d8-vk1.1xvh1.5、4d8-vk1.1xvh1.6、hz4d8、6b7.c5及7a4.d9。e299.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自以下组的抗体竞争结合tfpi：tfpi-23、tfpi-24、tfpi-106及tfpi-118。e300.实施方案299项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与tfpi-23或tfpi-106竞争结合tfpi。e301.实施方案299项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与tfpi-24或tfpi-118竞争结合tfpi。e302.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与抗体4d8竞争结合tfpi。e303.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与实施方案第1至296任一项的抗体或其抗原结合片段结合至相同的tfpi表位。e304.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自以下组的抗体结合至相同的tfpi表位：tfpi-3、tfpi-21、tfpi-23、tfpi-24、tfpi-26、tfpi-106、tfpi-107、tfpi-108、tfpi-109、tfpi-110、tfpi-111、tfpi-112、tfpi-113、tfpi-114、tfpi-115、tfpi-118、tfpi-119、tfpi-122、tfpi-123、tfpi-126、4d8.b1、mu-hu4d8嵌合体、4d8-vk1.0xvh1.0、4d8-vk1.0xvh1.1、4d8-vk1.0xvh1.2、4d8-vk1.0xvh1.3、4d8-vk1.0xvh1.4、4d8-vk1.0xvh1.5、4d8-vk1.0xvh1.6、4d8-vk1.1xvh1.0、4d8-vk1.1xvh1.1、4d8-vk1.1xvh1.2、4d8-vk1.1xvh1.3、4d8-vk1.1xvh1.4、4d8-vk1.1xvh1.5、4d8-vk1.1xvh1.6、hz4d8、6b7.c5及7a4.d9。e305.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自以下组的抗体结合至相同的tfpi表位：tfpi-23、tfpi-24、tfpi-106及tfpi-118。e306.实施方案305项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与tfpi-23或tfpi-106结合至相同的tfpi表位。e307.实施方案305项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与tfpi-24或tfpi-118结合至相同的tfpi表位。e308.一种特异性结合tfpi的k2结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与抗体4d8结合至相同的tfpi表位。e309.实施方案297至308任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不与tfpi的k1结构域结合。e310.实施方案1至309任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是fc融合蛋白、单抗体(monobody)、大抗体(maxibody)、双功能抗体、scfab、scfv、肽体(peptibody)或前述任何抗原结合片段。e311.实施方案1至310任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约1×10-7m至约1×10-12m的结合亲和性(kd)值结合tfpi。e312.实施方案1至311任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约5×10-7m至约5×10-11m的结合亲和性(kd)值结合tfpi。e313.实施方案1至312任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约1×10-8m至约1×10-10m的结合亲和性(kd)值结合tfpi。e314.实施方案1至313任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段：(i)减少在基于血浆的稀释凝血酶原时间(dpt)测定中所测量的凝血时间；(ii)减少通过血栓消融术(thromboelastrography)或旋转血栓弹性测定检测(thromboelastometry)所测量的全血凝血时间；(iii)增加凝血酶生成；(iv)在tfpi存在时增加fxa活性；或(v)其任何组合。e315.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中所测量的凝血时间。e316.实施方案315项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中所测量的凝血时间减少是剂量依赖性。e317.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少通过血栓消融术或旋转血栓弹性测定检测所测量的全血凝血时间。e318.实施方案317项的抗体或其抗原结合片段，其中所述通过血栓消融术或旋转血栓弹性测定检测所测量的全血凝血时间减少是剂量依赖性。e319.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段增加凝血酶生成。e320.实施方案319项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成的增加是剂量依赖性。e321.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在tfpi存在时增加fxa活性。e322.实施方案321项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在tfpi存在时增加的fxa活性是剂量依赖性。e323.实施方案322项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在tfpi存在时增强血小板累积。e324.实施方案323项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在tfpi存在时增强血小板累积是剂量依赖性。e325.实施方案324项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在tfpi存在时增加纤维蛋白生成。e326.实施方案325项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在tfpi存在时增加纤维蛋白生成是剂量依赖性。e327.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有重型血友病a的人类患者的全血测定的。e328.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有重型血友病a的人类患者的全血及针对人类因子viii的抑制性抗体测定的。e329.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有中间型血友病a的人类患者的全血测定的。e330.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有重型血友病b的人类患者的全血测定的。e331.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有重型血友病b的人类患者的全血及针对人类因子ⅸ的抑制性抗体测定的。e332.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述全血凝血时间减少是使用得自患有中间型血友病b的人类患者的全血测定的。e333.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有重型血友病a的人类患者的血浆测定的。e334.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有重型血友病a的人类患者的血浆及针对人类因子viii的抑制性抗体测定的。e335.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有中间型血友病a的人类患者的血浆测定的。e336.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有重型血友病b的人类患者的血浆测定的。e337.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有重型血友病b的人类患者的血浆及针对人类因子ⅸ的抑制性抗体测定的。e338.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述在dpt测定中所测量的凝血时间减少是使用得自患有中间型血友病b的人类患者的血浆测定的。e339.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有重型血友病a的人类患者的血浆测定的。e340.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有重型血友病a的人类患者的血浆及针对人类因子viii的抑制性抗体测定的。e341.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有中间型血友病a的人类患者的血浆测定的。e342.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有重型血友病b的人类患者的血浆测定的。e343.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有重型血友病b的人类患者的血浆及针对人类因子ⅸ的抑制性抗体测定的。e344.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶生成增加是使用得自患有中间型血友病型的人类患者的血浆测定的。e345.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中100nm所述抗体或其抗原结合片段在减少得自患有重型血友病a的人类患者的全血的凝血时间上至少与足以获得5％正常凝血活性的重组人类因子viii的量同样有效。e346.实施方案314项的抗体或其抗原结合片段，其中100nm所述抗体或其抗原结合片段在增加得自患有重型血友病a的人类患者的血小板富集血浆的峰值凝血酶生成上至少与足以获得5％正常凝血活性的重组人类因子viii的量同样有效。e347.实施方案1至346任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述tfpi是人类tfpi。e348.实施方案1至347任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述tfpi包含seqidno：2的残基91至147。e349.一种分离的核酸分子或核酸分子类的，其包含一或多个编码实施方案1至348任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。e350.一种编码特异性结合tfpi的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子，其中所述核酸包含选自以下组的核酸序列：seqidno：175的核酸序列、seqidno：176的核酸序列、seqidno：177的核酸序列、seqidno：178的核酸序列、以atcc保藏号pta-122328保藏的mab-tfpi-106vl载体的插入片段核酸序列、及以atcc保藏号pta-122329保藏的mab-tfpi-106vh载体的插入片段核酸序列。e351.一种载体，其包含实施方案349及350的核酸分子。e352.一种宿主细胞，其包含实施方案349或350的核酸分子或实施方案351的载体。e353.实施方案352的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。e354.实施方案353的宿主细胞，其中所述宿主细胞是cho细胞、hek-293细胞或sp2.0细胞。e355.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在其中所述抗体或其抗原结合片段由所述宿主细胞表达的条件下培养实施方案352至354任一项的宿主细胞。e356.实施方案355项的方法，其进一步包含分离所述抗体或其抗原结合片段。e357.一种抗体或其抗原结合片段，其通过实施方案355或356项的方法获得。e358.一种药物组合物，其包含实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段及药物上可接受的传递体(carrier)或赋形剂。e359.一种减少组织因子途径抑制剂(tfpi)的活性的方法，其包含对有此需要的对象施用治疗有效量的实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物。e360.一种缩短出血时间的方法，其包含对有此需要的对象施用治疗有效量的实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物。e361.实施方案358或360项的方法，其中所述对象是人类。e362.实施方案359至361任一项的方法，其中所述对象患有或容易患有血液凝固缺乏。e363.实施方案359至361任一项的方法，其中所述对象患有或容易患有血小板异常。e364.实施方案359至361任一项的方法，其中所述对象患有或容易患有血友病a、b或c。e365.实施方案359至361任一项的方法，其中所述对象患有或容易患有血友病a或b。e366.实施方案359至361任一项的方法，其中所述对象患有或容易患有血管性血友病(vonwillebranddisease,vwd)。e367.实施方案360项的方法，其进一步包含施用治疗有效量的fvii。e368.实施方案367项的方法，其中所述方法在tfpi存在时增加凝血酶生成。e369.实施方案359至368任一项的方法，其包含静脉施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。e370.实施方案359至368任一项的方法，其包含皮下施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。e371.实施方案359至368任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物是每3天施用一次、每4天施用一次、每5天施用一次、每6天施用一次、每周施用一次或每周施用两次。e372.实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物，作为药物使用。e373.实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物，是用于降低对象的tfpi活性。e374.实施方案1至347项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物，是用于缩短对象的出血时间。e375.实施方案372至374任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象是人类。e376.实施方案372至375任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象患有或容易患有血液凝固缺乏。e377.实施方案372至375任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象患有或容易患有血友病a、b或c。e378.实施方案372至375任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象患有或容易患有血友病a或b。e379.实施方案372至375任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象患有或容易患有血管性血友病(vwd)。e380.实施方案372至375任一项的抗体或抗原结合片段或药物组合物，其中所述对象患有或容易患有血小板异常。e381.一种实施方案1至348项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物对降低对象的tfpi活性的用途。e382.一种实施方案1至348项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物在制备用于降低对象的tfpi活性的药物的用途。e383.一种实施方案1至348项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物在缩短对象的出血时间的用途。e384.一种实施方案1至348项及357任一项的抗体或其抗原结合片段或实施方案358项的药物组合物在制备用于缩短对象的出血时间的药物的用途。e385.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象是人类。e386.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象患有或容易患有血液凝固缺乏。e387.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象患有或容易患有血友病a、b或c。e388.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象患有或容易患有血友病a或b。e389.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象患有或容易患有血管性血友病(vwd)。e390.实施方案381至384任一项的用途，其中所述对象患有或容易患有血小板异常。附图说明图1a至1f的图形显示各种抗tfpi抗体及tfpi的k2结构域的共晶结构。具体来说，如图1f所示，与其他参考抗体相比，本发明公开的示例性抗体tfpi-23、tfpi-24及4d8全部结合至k2结构域的非重叠表位。tfpi-106与tfpi-23结合至同一位点，而tfpi-118与tfpi-24结合至同一位点。“r&d”或“r&dfab”是指来自r&d系统的抗体mab2974。novo2021抗体亦称为“hz4f36”。“克隆23”是指tfpi-23；“克隆24”是指tfpi-24。图2a至2e的图解显示在tfpi的k2结构域内的表位残基与来自各种抗tfpi抗体的抗原互补位残基之间的相互作用。“r&d”或“r&dfab”是指来自r&d系统的抗体mab2974。“克隆23”是指tfpi-23；“克隆24”是指tfpi-24。图3a至3e显示在小鼠损伤模型中的各种抗tfpi抗体的体内效力。图3a和3b显示当施用2a8-200和2a8抗体(本研究中作为参考抗体)时，血友病a因子viii缺乏(fviii-/-)小鼠出血减少的持续时间。图3c显示当施用tfpi4d8(对照)、tfpi-21、tfpi-23及tfpi-24抗体时，血友病a小鼠抗体效果的持续时间。图3d和3e显示当施用tfpi-106和tfpi-118抗体时，血友病a小鼠持续时间。在损伤前的指定时间点(小时(h))对血友病a小鼠(fviii-/-)通过静脉注射以6mg/kg施用抗体。然后在尾部横断后，测量失血的总体积(μl)。载剂(vehicle)(盐水)处理的血友病a小鼠作为对照。所有测量均以平均值±sem呈现。*＝p<0.05。fviii+/+(野生型)小鼠接受盐水。n＝5/组。图4图显示当施用tfpi-106抗体时，血友病b小鼠在尾部横断后的出血持续时间。在损伤前的指定时间点(小时(h))对血友病b小鼠通过静脉注射以6mg/kg施用抗体。然后在尾部横断后，测量失血的总体积(μl)。载剂(盐水)处理的血友病a小鼠作为对照。所有测量均以平均值±sem呈现。*＝p<0.05。n＝4-5/组。图5包含a组和b组，其各包含六组(图5a1至6及图5b1至6)，显示出活体显微镜检查(ivm)的显微照片，证明了tfpi在野生型小鼠体内血管损伤部位的血小板血栓及沿着内皮检测到。图5a显示使用结合血小板上的gp1bβ的dylight649标记的cd42c所检测到的损伤部位的血小板血栓增加。血小板是否存在是由组1(0秒)；组2(15秒)；组3(30秒)；组4(60秒)；组5(90秒)；及组6(120秒)中检测到的荧光信号证明。也施用alexa488标记的阴性对照igg且并未检测到荧光。包含组1至6的图5b显示出ivm的显微照片，其证明在野生型小鼠中激光诱导血管损伤后，小鼠的血小板血栓及沿着内皮存在tfpi。在0秒(图5b，组1)时并未检测到alexa488标记的tfpi(绿色信号以灰色显示)，而在15秒(图5b，组2)时可以看到微弱信号。在30秒(图5b，组3)时绿色荧光信号已增加并可看到微弱的红色信号(dylight649标记的cd42c)，其指示在约与检测到tfpi的相同位点检测到血小板累积。图5b组4(60秒)显示强烈的绿色及红色荧光信号(二者均是浅灰，其中红色荧光可在血管损伤位点的左侧看到，而绿色信号主要在朝向损伤部位的右侧检测到)，其证明在损伤部位检测到血小板积累及tfpi。图5b组5显示出在60秒在损伤部位的红色(血小板)和绿色(tfpi)荧光信号，其中这两种信号都较30秒的信号强。图5b组6显示出红色(血小板)信号及绿色(tfpi)信号减弱，在120秒时仍可在损伤部位检测到二者。图6a的图显示利用ivm评估在血友病a小鼠中激光诱导血管损伤后tfpi-106的止血效果，其中该血小板血栓的量是以曲线下面积(auc)表示(*＝p<0.005被指出)。图6a显示与施用盐水的血友病a小鼠在0.5小时缺乏血小板累积相比，仅接受盐水对照的野生型小鼠(wt)在损伤后0.5小时的损伤部位的血小板累积。其中施用重组因子viii(rfviii)或tfpi-106的血友病a小鼠在0.5小时检测到血小板累积。施用tfpi-106的血友病a小鼠在168小时仍能检测到血栓累积。图6b的图显示利用ivm评估在血友病a小鼠中激光诱导血管损伤后tfpi-106的止血效果，其中该纤维蛋白生成量是以曲线下面积(auc)表示(*＝p<0.005被指出)。图6b显示与施用盐水的血友病a小鼠在0.5小时缺乏可检测的纤维蛋白生成，仅接受盐水对照的野生型小鼠(wt)在损伤后0.5小时的损伤部位的纤维蛋白生成。其中施用重组因子viii(rfviii)或tfpi-106的血友病a小鼠在0.5小时可检测到纤维蛋白生成。施用tfpi-106的血友病a小鼠在168小时仍能检测到纤维蛋白生成。图7描绘的图显示在1pm组织因子及4μm磷脂的存在下，在重型血友病a血浆中施用tfpi-106及重组因子viia(rfviia)对凝血酶生成试验(tga)的影响。该图显示具有单独的tfpi-106(16μg/ml)及与rfviia(20μg/ml；2μg/ml；或0.2μg/ml)的组合的血友病a血浆的凝血酶生成图(thrombogram)。图中也显示既不具有tfpi-106也不具有rfviia的血友病a血浆及非血友病血浆的凝血酶生成图。图8a描绘的凝血酶生成图显示在1pm组织因子及4μm磷脂的存在下，在血友病a血浆中存在具有或不具有rfviia的tfpi-106、或仅存在rfviia对凝血酶生成的影响。包括非血友病血浆作为对照。图8b描绘的凝血酶生成图显示在三个bethesda单位(3bu)的抑制剂的存在下，在柠檬酸化的血小板贫乏的血友病a血浆中存在具有或不具有rfviia的tfpi-106、或仅存在rfviia对凝血酶生成的影响。包括非血友病血浆作为对照。图中也包括其中添加tfpi-106(16μg/ml)的非血友病血浆对照。图8c描绘的凝血酶生成图显示在三个bethesda单位(3bu)的抑制剂的存在下，在柠檬酸化的血小板贫乏的血友病b血浆中存在具有或不具有rfviia的tfpi-106、或仅存在rfviia对凝血酶生成的影响。包括非血友病血浆作为对照。图中也包括其中添加tfpi-106(16μg/ml)的非血友病血浆对照。图9a显示与对照相比，在尾部横断后立即对血友病a小鼠施用抗体tfpi-106(6mg/kg)及分开的重组因子viii(200单位/kg)对失血的影响。图9b显示与对照组相比，在尾部横断后2分钟对血友病a小鼠施用抗体tfpi-106(6mg/kg)及分开的重组因子viii(200单位/kg)对失血的影响。图10a显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自具有重型血友病a的人类患者的全血的凝血时间的影响。图10b显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自具有重型血友病a的人类患者的富含血小板血浆的峰值凝血酶生成的影响。图11a显示不同浓度的tfpi106对来自具有重型血友病a及针对fviii的抑制剂的人类患者的全血凝血时间的影响。图11b显示不同浓度的tfpi106对来自具有重型血友病a及针对fviii的抑制剂的人类患者的富含血小板血浆的峰值凝血酶生成的影响。图11c显示不同浓度的tfpi106对来自具有重型血友病a及针对fviii的抑制剂的人类患者的血小板贫乏血浆的凝血时间的影响。图12a显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病a的人类患者的全血凝血时间的影响。图12b显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病a的人类患者的富含血小板血浆的峰值凝血酶生成的影响。图12c显示不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病a的人类患者的血小板贫乏血浆的凝血时间的影响。图13a显示与重组因子ix相比，不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病b的人类患者的全血凝血时间的影响。图13b显示与重组因子ix相比，不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病b的人类患者的富含血小板血浆的峰值凝血酶生成的影响。图13c显示不同浓度的tfpi106对来自具有中间型血友病b的人类患者的血小板贫乏血浆的凝血时间的影响。图14a显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自多位具有血友病a的人类患者的全血凝血时间的影响。图14b显示与重组因子viii相比，不同浓度的tfpi106对来自多位具有血友病a的人类患者的富含血小板血浆的峰值凝血酶生成的影响。图14c显示不同浓度的tfpi106对来自多位具有血友病b的人类患者的血小板贫乏血浆的凝血时间的影响。发明详述1.概述如上文所指，血友病患者通过其完整的外源性途径具有一些止血能力；然而该外源性途径不足以提供保护，因其被组织因子途径抑制剂(tfpi)迅速关闭。阻断/中和这些患者中的tfpi抑制作用可补偿fxa生成不足并使出血素质标准化。因此，本发明公开和示例特异性结合tfpi并抑制其活性的抗体及其抗原结合片段。2.定义“降低tfpi的活性”意指抗体或其抗原结合片段可：(i)通过例如基于血浆的稀释凝血酶原时间测定测量的，与无该抗体存在时的凝固时间相比，凝血时间减少；(ii)通过例如血栓消融术或旋转血栓弹性测定检测测量的，与无该抗体存在时的凝固时间相比，全血凝血时间减少；(iii)凝血酶生成增加；(iv)在tfpi存在时增加fxa活性；(v)在tfpi存在时增强血小板累积；(vi)在tfpi存在时增加纤维蛋白生成；或(vii)其任何组合。抗体或抗原结合片段的抑制活性可，但不必定是剂量依赖性(例如在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中测量的，引起凝血时间剂量依赖性减少)。此外，依本发明所公开及示例的，获得抗tfpi抗体与tfpi的kunitz结构域2(k2结构域)的共晶结构。结构分析显示与其他公开的tfpi抗体(其在实施例中作为参考抗体)相比，本发明的示例性抗体识别tfpi的独特表位。例如，如图1a至1f和图2a至2e所示，与几种参考tfpi抗体(r&d(mab2479)fab、novo2021(也称为hz4f36)fab、2a8fab)相比，tfpi-23、tfpi-24及4d8抗体结合tfpi的k2结构域中的非重叠位点。因此，在某些实施方案中，本发明所公开的抗体(及抗原结合片段)识别位于tfpi的k2结构域的tfpi的独特表位。基于该共晶结构及计算的丙氨酸扫描，该表位包含以下三个对抗体-抗原相互作用重要的残基：ile105、arg107及leu131(根据seqidno：2所示的人类tfpi的编号)。将此三个残基突变成丙氨酸导致抗体结合丧失。例如，抗体tfpi-23及其变体(例如tfpi-106及tfpi-107)均识别此表位。在某些实施方案中，识别本发明公开的关键表位残基允许该抗体(及其抗原结合片段)降低tfpi的活性。尤其是，该晶体结构显示出tfpi的k2结构域采用锥形结构，该锥体尖端(尤其arg107)结合fxa。tfpi-23及tfpi-24二者均识别此锥形区的尖端并阻断tfpi与fxa结合。抗体4d8识别k2结构域中的不同表位。尽管不直接与该锥体尖端的残基相互作用，但4d8阻断tfpi与fxa结合。表15总结当与其他公知的tfpi抗体相比时，被本发明的示例性抗体识别的非重叠表位残基。此外，在某些实施方案中，本发明公开的抗体及其抗原结合片段已显示用于治疗凝血缺陷(例如血友病)及用于缩短出血时间的期望的药理学活性和药代动力学性质。与表位“优选结合”或“特异性结合”(本发明中可互换使用)的抗体是本领域中所熟知的术语，而测定该特异性或优选结合的方法也是本领域所熟知。相较于与替代的细胞或物质反应或结合，若分子以更长的持续时间和/或更大的亲和性更频繁、更迅速地与特定的细胞或物质反应或结合，则该分子被称为显示出“特异性结合”或“优选结合”。相较于与其他物质的结合，若抗体以更大的亲和性(affinity)、亲和力(avidity)、更容易和/或以更长的持续时间与靶结合，则该抗体“特异性结合”或“优选结合”靶。此外，相较于其与存在于样本中的其他物质的结合，若抗体以更大的亲和性、亲和力、更容易和/或以更长的持续时间与样本中的靶结合，则该抗体“特异性结合”或“优选结合”靶。例如，特异性结合或优选结合tfpi表位的抗体是以较其与其他tfpi表位或非-tfpi表位的结合而言以更大的亲和性、亲和力、更容易和/或以更长的持续时间结合该表位的抗体。通过阅读此定义也可理解，例如“特异性结合”或“优选结合”第一靶的的抗体(或部分或表位)可或不可特异性结合或优选结合第二靶。因此，“特异性结合”或“优选结合”不一定需要(虽然其可包括)专一结合。一般而言，但不一定，提及结合意指优选结合。“特异性结合”或“优选结合”包括能识别并结合样本中的特定分子、但基本上不识别或结合其他分子的化合物，例如蛋白质、核酸、抗体等。例如，识别并结合样本中的同源配体(cognateligand)或结合配偶体(例如结合tfpi的抗tfpi抗体)、但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体或肽受体，特异性结合该同源配体或结合配偶体。因此，在指定的测定条件下，该具体的结合部分(例如抗体或其抗原结合部分或受体或其配体结合部分)优选结合特定的靶分子且不以显著量结合存在于测试样本中的其他组分。多种测定形式可用来选择特异性结合感兴趣的分子的抗体或肽。例如固相elisa免疫测定、免疫沉淀、biacoretm(gehealthcare，piscataway，nj)、kinexa、荧光活化的细胞分选(facs)、octettm(fortébio，inc，menlopark，ca)及蛋白质印迹分析是可用于鉴定与抗原或受体或其配体结合部分(其与同源配体或结合配偶体特异性结合)特异性反应的抗体的测定多种测定。通常，特异性或选择性反应将至少是背景信号或噪声的二倍，更通常是超过背景10倍，更通常是超过背景50倍，更通常是超过背景100倍，更通常是超过背景500倍，甚至更通常是超过背景1000倍，且甚至更通常是超过背景10000倍。此外，当平衡解离常数(kd)≤7nm时，该抗体被称为“特异性结合”抗原。本发明中，术语“结合亲和性”是用作两个分子(例如抗体或其片段与抗原)之间非共价相互作用强度的测量。术语“结合亲和性”是用来描述单价相互作用(内在活性)。凭借单价相互作用，可通过测定解离常数(kd)来定量两个分子(例如抗体或其片段与抗原)之间的结合亲和性。反过来，可使用例如表面等离子体共振(spr)法(biacore)通过测量复合物形成和解离的动力学来测定kd。对应于该单价复合物的结合和解离的速率常数分别称为结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。kd通过等式kd＝kd/ka而与ka和kd相关联。解离常数的数值可通过公知的方法直接测定，且甚至可通过例如caceci等人(1984，byte9：340-362)中所示的方法计算复合物混合物。例如，kd可使用测定如由wong&lohman(1993,proc.natl.acad.sci.usa90:5428-5432)公开的双滤器硝化纤维素滤器结合测定来建立。其他用于评估配体(例如针对靶抗原的抗体)的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括，例如elisa、蛋白质印记、ria和流式细胞术分析，及本发明中其它地方示例的测定。抗体的结合动力学和结合亲和性也可通过本领域已知的标准测定评估，例如表面等离子体共振(spr)(例如使用biacoretm系统或kinexa)。可进行竞争性结合测定，其中将抗体与抗原的结合与靶与该靶的另一配体(例如另一抗体或以其他方式结合该靶的可溶性受体)的结合相比较。发生50％抑制的浓度被称为ki。在理想条件下，该ki等于kd。该ki值将永远不会少于kd，所以ki的测量可方便地由所提供的kd上限替代。根据上述定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和性(例如比较不同抗体对指定抗原的结合亲和性)可通过比较单个抗体/抗原复合物的kd值来比较。抗体或其他结合配偶体的kd值可使用本领域已完善建立的方法来测定。一种用于测定kd值的方法是使用表面等离子体共振(通常是使用生物传感器系统，如系统)进行。类似地，相互作用的特异性可通过测定感兴趣的相互作用(例如抗体与抗原的间的特异性相互作用)的kd值并与不感兴趣的相互作用(例如已知不与tfpi结合的对照抗体)的kd值相比较来评估。特异性结合其靶的抗体可以高亲和性(即，显示如上文所讨论的低kd)结合其靶，并以较低的亲和性结合其它非靶分子。例如抗体可以1×10-6m或更高(优选1×10-5m或更高，更优选1×10-4m或更高，更优选1×10-3m或更高，更优选1×10-2m或更高)的kd值结合非靶分子。优选地，本发明的抗体能以高出其与另一非tfpi分子的结合亲和性至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更高的亲和性与其靶结合。一般而言，tfpi抗体需要以高亲和性结合tfpi以有效地降低tfpi的活性。然而，当该抗体的结合亲和性太高，该抗体可很快地被内在化(internalized)并被宿主细胞降解。这可潜在地导致短的半衰期和重复注射。例如抗体tfpi-23显示出较tfpi-24低的结合亲和性(kd)，而在某些情况下，因为其具有较低的内在化速率及较长的半衰期，似乎更有利于临床使用。因此，结合亲和性(kd)在5×10-7至约5×10-11m，尤其是约1×10-8至约1×10-10m通常是期望的，尤其用于治疗需要重复注射的慢性疾病(例如血友病)。不欲受限于任何特定理论，该亲和性范围被认为在(i)有效抑制tfpi的活性所需的结合亲和性与(ii)较长半衰期及降低的抗体内在化之间获得平衡。tfpi中的具体氨基酸残基位置是根据seqidno：2(人类tfpiαk1k2k3)编号。然而，本发明并不限于seqidno：2。来自其他tfpi同源物、同种型、变体或片段的对应残基可根据本领域已知的序列比对或结构比对鉴定。例如，比对可通过手工或使用为人熟知的序列比对程序，例如clustalw2或“blast2序列”，利用默认参数完成。例如，seqidno：2的arg107对应于小鼠tfpik1k2(seqidno：4)的arg104。抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原的能力(优选具有基本上相同的结合亲和性)的全长抗体的片段。抗原结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl及ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含两个通过铰链区的二硫键桥联的fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)由vh结构域组成的dab片段(wardetal.,(1989)nature341:544-546)；及(vi)分离的互补决定区(cdr)、二硫键连接的fv(dsfv)及抗独特型(抗-id)抗体和细胞内抗体(intrabody)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由分别的基因编码，可利用重组方法，通过合成接头使它们连结以将它们制成单一蛋白链(其中该vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv))；参见，例如birdetal.science242:423-426(1988)及hustonetal.proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)。也包含其他形式的单链抗体，例如包括双价抗体(diabody)。双价抗体为二价、双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达在单一多肽链上，但使用的接头太短以致于无法允许同一链上的两个结构域之间形成配对，从而迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并造成两个抗原结合位点(参见，例如holligeretal.proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)；poljaketal.,1994,structure2:1121-1123)。抗体“可变结构域”是指单独或组合的抗体轻链(vl)可变区或抗体重链可变区(vh)。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(cdr)连接的四个构架区(fr)组成，并参与形成抗体的抗原结合位点。可变结构域中的残基是根据kabat编号，kabat是用于汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。参见，kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有更少或额外的氨基酸，对应于该可变结构域的fr或cdr缩短或插入。例如重链可变结构域可包括在h2的残基52之后的单一氨基酸插入片段(残基52a(根据kabat))及在重链fr残基82之后插入的残基(例如残基82a、82b及82c(根据kabat))。指定抗体的残基的kabat编号可通过比对具有“标准”kabat编号序列的抗体同源区来确定。用于分配kabat编号的各种算法均可用。除非另有说明，本发明使用2012年abysis(www.abysis.org)发表的算法来分配可变区的kabat编号。抗体中的具体氨基酸残基位置(例如本发明所公开的抗原互补位残基)也根据kabat编号。“互补决定区”(cdr)可根据kabat、chothia的定义、kabat与chothia二者的累积、abm、接触和/或构象定义或本领域所熟知的任何测定cdr的方法来鉴定。参见，例如kabatetal.,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.(高变区)；chothiaetal.,1989,nature342:877-883(结构环结构)。cdr的abm定义是kabat与chothia的间的折衷并使用oxfordmolecular的abm抗体建模软件cdr的“接触”定义是基于观察到的抗原接触(阐述于maccallumetal.,1996,j.mol.biol.,262:732-745中)。cdr的“构象”定义是基于对抗原结合产生焓贡献的残基(参见，例如makabeetal.,2008,journalofbiologicalchemistry,283:1156-1166)。还有其他cdr边界定义可能并不严格遵循上述方法其中之一，但仍将与的kabatcdr的至少一部分重叠，不过鉴于预测或实验发现特定残基或残基组或甚至整个cdr不会显著影响抗原结合，它们可能缩短或延长。如本发明所用，cdr可指通过本领域中已知的任何方法(包括方法的组合)定义的cdr。在实施例中(参见表3和4)，该cdr的定义如下(根据kabat编号；h：重链；l：轻链)：cdr-h1:h26-h35b；cdr-h2:h50-h65；cdr-h3:h95-h102cdr-l1:l24-l34；cdr-l2:l50-l56；cdr-l3:l89-l97“构架”(fr)残基是除了cdr残基外的抗体可变结构域残基。vh或vl结构域构架包含四个构架子区：fr1、fr2、fr3和fr4，其间穿插着以下结构的cdr：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。在实施例中(参见表3和4)，fr残基包括以下(根据kabat编号；h：重链；l：轻链)：“表位”是指抗体所特异性结合的抗原(ag)区或区域，例如包含与该抗体(ab)相互作用的残基的区或区域。表位可是线性或构象。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的初级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构象表位”包含位于抗原性蛋白质内的非连续性多肽(或氨基酸)，特异于该表位的抗体结合该抗原性蛋白质。本发明所使用的术语“表位”定义为通过本领域所熟知的任何方法(例如通过常规免疫测定)测定的可与抗体特异性结合的抗原的一部分。或者，在发现过程中，抗体的生成和表征可阐明与期望的表位有关的信息。通过该信息，之后可竞争性筛选结合相同表位的抗体。达成此目的的方法是进行竞争和交叉竞争研究以找出彼此竞争或交叉竞争结合tfpi的抗体。也就是说，抗体竞争结合抗原，从而使该抗体竞争结合本公开的抗tfpi抗体的抗原结合位点。术语“抗原互补位”是通过逆转上述“表位”的定义的观点衍生出的，且是指参与抗原结合的抗体分子的区或区域，例如包含与抗原相互作用的残基的区或区域。抗原互补位可是线性或构象的(例如在cdr中的不连续残基)。指定的抗体/抗原结合对的表位/抗原互补位可利用各种实验和计算的表位作图方法以不同细节层次定义和表征。实验方法包括诱变、x射线晶体学、核磁共振(nmr)光谱学、氢/氘交换质谱(hx-ms)及各种竞争结合的方法。由于各方法系依赖于独特的原理，表位的描述与测定其的方法紧密连结。因此，指定的抗体/抗原对的表位/抗原互补位将根据所采用的作图方法而有不同定义。在最详细的层次，用于抗体和抗体之间相互作用的表位/抗原互补位可通过限定存在于ag-ab相互作用中的原子接触的空间坐标及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息来定义。在一种层次，表位/抗原互补位残基通过限定ag和ab之间的原子接触的空间坐标来表征。在一方面，表位/抗原互补位残基可通过特定标准来定义，例如ab和ag中的原子之间的距离(例如同源抗体的重原子及抗原的重原子的距离等于或小于(“接触”残基))。在另一方面，表位/抗原互补位残基的特征在于参与氢键与同源抗体/抗原的相互作用，或与水分子的相互作用从而该水分子亦也与该同源抗体/抗原氢键结合(水介导的氢键结合)。在另一方面，表位/抗原互补位残基的特征在于与该同源抗体/抗原的残基形成盐桥。在另一方面，表位/抗原互补位残基的特征在于由于与该同源抗体/抗原相互作用而在隐藏的表面区域(bsa)中具有非零变化的残基。在更不详细的层次下，表位/抗原互补位可通过功能(例如与其他ab竞争结合)来表征。该表位/抗原互补位也可被更上位地定义为包含氨基酸残基，当该氨基酸残基被另一氨基酸取代时将会改变该ab与ag之间的相互作用特征(例如丙氨酸扫描)。在由抗体(例如fab片段或两个fab片段)与其抗原之间的复合物的空间坐标所限定的x射线衍生的晶体结构的背景下，除非另有说明，表位残基是指如下所述的tfpi残基(i)具有重原子(即，非氢原子)，其与同源抗体的重原子的距离在之内(也称为“接触”残基)，(ii)参与与同源抗体的残基氢键结合，或与水分子氢键结合，从而此水分子也与该同源抗体氢键结合(由水介导的氢键结合)，(ⅲ)参与该同源抗体的残基的盐桥，和/或(iv)由于与该同源抗体相互作用而在隐藏的表面区域(bsa)中具有非零变化。一般而言，对bsa施加截断，以避免包含具有最少相互作用的残基。因此，除非另有说明，若该表位残基的bsa是或更大或参与抗体结合tfpi时的静电相互作用，则选择类别(iv)的表位残基。类似地，除非另有说明或与上下文相抵触，在x射线衍生的晶体结构的背景下，抗原互补位残基是指如下所述的抗体残基(i)具有重原子(即，非氢原子)，其与tfpi的重原子的距离在之内(也称为“接触”残基)，(ii)参与与tfpi残基氢键结合或与水分子氢键结合，从而此水分子也与tfpi氢键结合(由水介导的氢键结合)，(iii)参与与tfpi的残基形成盐桥，和/或(iv)由于与tfpi相互作用而在隐藏的表面区域(bsa)中具有非零变化。再者，除非另有说明，若该抗原互补位残基的bsa是或更大或参与抗体结合tfpi时的静电相互作用，则选择类别(iv)的抗原互补位残基。根据所使用的表位作图方法及以不同细节层次获得的关于表位的描述和定义的事实，其遵循在相同ag上的表位比较不同ab的表位的比工作可在不同的详尽层次下以类似方法进行。例如若其含有相同的氨基酸残基组，则以氨基酸层次描述的表位(例如从x射线结构测定)被称作是相同的。若该表位并未共享氨基酸残基，则这些表位被认是是独立的(独特的)。若与对应抗体的结合是互斥的(即，与一个抗体结合会排除同时或连续与其他抗体结合)，则特征在于竞争结合的表位被称作有重叠；而若该抗原能够同时容纳与两种对应抗体结合，则该表位称作独立的(独特的)。指定的抗体/抗原对的表位和抗原互补位可通过常规方法鉴定。例如，表位的大致位置可通过评估抗体结合不同片段或变体tfpi多肽的能力测定(此在前文他处有更完整的描述)。在tfpi内与抗体内的特定残基接触的特定残基也可使用常规方法(例如实施例中所描述的)测定。例如，抗体/抗原复合物可结晶化。该晶体结构可经过测定并用来鉴别抗体与抗原之间相互作用的特定位点。如本发明所使用的关于抗体的术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合部分与抗原的结合减少随后第二抗体或其抗原结合部分与该相同抗原的结合。一般而言，结合第一抗体会创造空间位阻、构象变化或结合至共同的表位(或其部分)，从而使第二抗体与该相同抗原的结合减少。标准竞争测定可用于测定两种抗体是否彼此竞争。一种适合用于抗体竞争的测定涉及使用biacore技术，该biacore技术可利用表面等离子体共振(spr)技术(通常使用生物传感器系统(例如系统))测量相互作用的程度。例如，spr可用于体外竞争性结合抑制测定以测定一种抗体抑制第二抗体结合的能力。另一用于测量抗体竞争的测定是使用基于elisa的方法。此外，国际专利申请第wo2003/48731号中描述一种基于抗体的竞争的用于“分箱”抗体的高通量方法。若一种抗体(或片段)减少另一种抗体(或片段)与tfpi的结合，则存在竞争。例如，可通过依序添加不同抗体使用连续结合竞争测定。加入第一抗体可能达到接近饱和的结合。然后，加入第二抗体。若未检测到第二抗体与tfpi结合，或与无第一抗体存在时的平行测定(其数值可设定为100％)相比，第二抗体与tfpi的结合显著减少(例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、在至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％)，则两种抗体被认为是互相竞争。实施例6中提供通过spr进行的示例性抗体竞争测定(及重叠表位分析)。本公开的抗tfpi抗体可具有与本公开的另一抗体竞争或交叉竞争与本发明所描述的tfpi结合的能力。例如，本公开的抗体可与本发明所描述的抗体竞争或交叉竞争与tfpi结合、或与被本发明公开的抗体结合的合适的tfpi片段或变体结合。也就是说，若第一抗tfpi抗体与第二抗体竞争与tfpi结合，但当第二抗体首先结合tfpi时它不竞争，则此第一抗体被认为是与第二抗体“竞争”(也称为单向竞争)。当一抗体与另一抗体竞争，不管哪种抗体首先与tfpi结合，然后该抗体与其他抗体“交叉竞争”与tfpi结合。这种竞争或交叉竞争抗体可基于其在标准结合测定中其与本发明的已知抗体竞争/交叉竞争的能力鉴定。例如，可使用spr(例如通过使用biacoretm系统)、elisa测定或流式细胞术来证明竞争/交叉竞争。这类竞争/交叉竞争可能暗示这两种抗体结合至相同、重叠或相似的表位。因此，本公开的抗tfpi抗体可通过包含结合测定的方法鉴定，该结合测定评估测试抗体是否能够与本公开的参考抗体(例如tfpi-3、tfpi-21、tfpi-23、tfpi-24、tfpi-26、tfpi-106、tfpi-107、tfpi-108、tfpi-109、tfpi-110、tfpi-111、tfpi-112、tfpi-113、tfpi-114、4d8、6b7.c5、7a4.d9)竞争/交叉竞争结合该靶分子上的结合位点。“fc融合”蛋白是其中一或多个多肽是可操作地连接fc多肽的蛋白质。fc融合蛋白以融合配偶体合并免疫球蛋白的fc区。抗体的结合亲和性可以kd值表示，其是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。kd是解离的速率(也称为“解离速率(off-rate)(koff)”)对结合的速率(或“on-rate(kon)”)的比率。因此，kd值等于koff/kon并以摩尔浓度(m)表示，且kd值愈小，结合亲和性越强。抗体的kd值可使用本领域中完善建立的方法测定。一种用于测量kd的示例性方法是表面等离子体共振(spr)，通常是使用生物传感器系统，例如系统。biacore动力学分析包含分析抗原与其表面上具有固定分子(例如包含表位结合结构域的分子)的芯片结合及解离。另一用于测定抗体的kd的方法是使用bio-layer干涉测量术，通常是使用技术(octetqke系统，fortebio)。另外或此外，也可使用可从sapidyneinstruments(boise，id)获得的(动力学排除测定)测定。术语“治疗有效量”意指足以达到预期目的(例如增加凝血、或在血友病的情况中缩短凝固时间、或以其他方式在有需要的对象体内引起可测量益处)的抗tfpi抗体或其片段、或包含所述抗体或其片段的组合的量。精确的量将取决于许多因素，包括但不限于该治疗组合物的组分和物理特性、预定的患者群、个别患者的考虑等，且可由本领域的技术人员决定。术语“协同治疗有效量”意指当与第二治疗剂(例如因子viia(fviia))一起提供时，提供的可测量益处(例如减少凝血时间、减少出血时间、增加纤维蛋白生成、增强血小板累积等)高于单独施用的各治疗剂或抗体的累加的可测量益处的抗tfpi抗体或其抗原结合片段的量。术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。若该治疗是在病症的临床表现之前施用，则其被认为是预防性的。治疗性治疗包括，例如提高或降低疾病的严重性或缩短疾病的长度。如本发明使用的术语“约”是指数值的+/-10％。3.抗tfpi抗体本发明所公开和示例的是结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的抗体(及其抗原结合片段)。该抗体及抗体片段结合tfpi的独特表位。在某些实施方案中，识别tfpi中的某些表位残基可使该抗体(及其抗原结合片段)降低tfpi的活性。此外，在某些实施方案中，本发明所公开的抗体(及其抗原结合片段)已证明用于治疗凝血缺陷和减少出血时间的期望的药学活性和药代动力学性质。a.组织因子途径抑制剂(tfpi)tfpi是含有蛋白酶抑制剂的多价kunitz结构域。表2中提供人类、小鼠、食蟹猴、兔子和大鼠tfpi的示例性序列。人类tfpi是胞外糖蛋白，其具有两种主要形式，tfpi-α和tfpi-β。tfpiα(其是具有276个氨基酸的糖基化蛋白(mw43kd))是最大的tfpi形式且由三个kunitz样结构域和基本羧基端区组成。可变剪切产生tfpi-β，其包含kunitz结构域1(k1)和kunitz结构域2(k2)，但含有缺乏kunitz结构域3(k3)和碱性区域的替代的c端部分。tfpi-β以糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定蛋白通过翻译后修饰锚定到细胞膜。tfpi的主要靶是蛋白酶因子xa(fxa)和因子viia(fviia)，这些是凝血级联起始阶段中的关键因素。生物化学分析已揭露k2是fxa的抑制剂，而k1抑制fviia-组织因子复合物。k3的作用不清楚，因为其似乎不具有直接的蛋白酶抑制活性，但可作为辅因子蛋白s的识别位点。tfpi-α所特有的c端结构域可能参与血小板表面上凝血酶原酶的识别。kunitz结构域1(k1)对应于seqidno：2的氨基酸残基26-76，而kunitz结构域2(k2)对应于seqidno：2的残基91至147。来自其他tfpi同源物、同种型、变体或片段的k1和k2结构域可通过针对seqidno：2的序列比对或结构比对来鉴定。本公开的tfpi包括tfpi的任何天然存在的形式，这些存在的天然形式可衍生自任何合适的生物体。例如，tfpi可是哺乳动物tfpi，例如人类、小鼠、大鼠、非人类灵长类、牛、羊、犬、猫或猪tfpi。在某些实施方案中，tfpi是人类tfpi。tfpi可是成熟形式的tfpi(即，已在合适的细胞中经历翻译后加工的tfpi蛋白)。例如这种成熟tfpi蛋白可是糖基化的。本公开的tfpi包括衍生自天然存在的tfpi的任何功能性片段或变体。tfpi的功能性片段可是保留tfpi的活性(例如抑制因子xa(fxa)、抑制fviia-组织因子复合物的活性和/或作为凝血或止血的负调控剂的能力)的任何tfpi构成部分或部分。例如，功能性片段可包含kunitz结构域，例如tfpi的k1结构域、k2结构域、或k1和k2结构域二者。与天然存在的tfpi相比，功能性变体可包含一或多个突变且仍然保留天然存在的tfpi的活性，例如抑制因子xa(fxa)的能力或抑制fviia-组织因子复合物的活性的能力。例如，变体与seqidno：1、2、3、4、5、6或7可具有不同程度的序列相同性，例如与seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6或seqidno：7中所列的序列至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。本发明的tpfi片段、变体、同种型和同源物应保持重要的表位残基(例如若使用tfpi-23和tfpi-24抗体，则是ile105、arg107和leu131)。此外，tfpi可包含5或更多个、8或更多个、10或更多个、12或更多个、或15或更多个tfpi的k2结构域的表面可及的残基。表面可及的残基是具有高于40％的相对可及性的残基。例如，对于tfpi的k2结构域(参见，例如seqidno：2)，下列氨基酸残基具有高于40％的相对可及性：94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142及144-145。tfpi可包含5或更多个、8或更多个、10或更多个、12或更多个、或15或更多个这些残基，例如包括5或更多个、8或更多个、10或更多个、12或更多个、或15或更多个这些残基的tfpi片段。b.抗tfpi抗体本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合tfpi的k2结构域并能抑制其与fxa的相互作用和/或降低tfpi的活性。fpi-23及变体在一方面，本发明包括制备以增加人类构架生殖系残基(“生殖系化”)含量的抗体tfpi-23及tfpi-23的变体。例如，tfpi-106包含h1q至e及h5v至l的突变(kabat编号)，而tfpi-107包含h1q至e、h5v至l和h94i至k的突变(kabat编号)。对于本发明的目的，tfpi-23亲本抗体和tfpi-106生殖系变体在其表位残基和抗原互补位残基相互作用中可以互换。在一方面，本发明提供特异性结合组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域2(k2)中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含残基ile105、arg107和leu131(根据seqidno：2的编号)。在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段不结合tfpi的kunitz结构域1(k1)。如本发明所公开及示例的，基于共晶结构及计算丙氨酸扫描已发现tfpi的k2结构域中的独特表位。尤其是，该晶体结构显示出tfpi的k2结构域采用锥形结构，该锥体的尖端(尤其是arg107)结合fxa。tfpi-23、tfpi-24及其变体均识别此锥形区的尖端附近的残基并阻断tfpi与fxa结合。因此，识别位于该锥体尖端附近的表位残基对于抑制tfpi活性特别有用。在某些实施方案中，本发明公开了包含对抗体-抗原相互作用重要的三个残基的tfpi表位：ile105、arg107及leu131(根据人类tfpi的编号，如seqidno：2所示)。将此三个残基突变成丙氨酸导致tfpi-23、tfpi-24及其变体结合丧失。参见表28，其总结丙氨酸扫描结果。也鉴定出额外的tpfi残基参与抗体结合，但这些残基可被突变成丙氨酸而没有显著不稳定效果。参见表28。因此，在某些实施方案中，该tfpi表位进一步包含一或多个选自以下组的残基：cys106、gly108、cys130、gly132(根据seqidno：2编号)及其任何组合。这些表位残基可被tfpi-23、tfpi-24及其变体识别。参见表27，其显示出tfpi-23和tfpi-24所共有的共同的表位残基。在某些实施方案中，该表位进一步包含一或多个选自以下组的残基：asp102、arg112、tyr127、gly129、met134、glu138(根据seqidno：2编号)及其任何组合。这些表位残基可被tfpi-23及其变体(例如tfpi-106、tfpi-107)识别，但不被tfpi-24(及其变体)识别。参见表27。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：e100、e101、p103、y109、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126、l140(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表27。根据wo201007269(诺和诺德公司)，参考抗体4f36识别包含以下的表位：e100、e101、p103、y109、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126及l140。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、e100、e101、p103、y109、k126、g128(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表27。根据表27，参考抗体2a8及2a8-200识别包含以下的表位：d31、d32、p34、c35、k36、e100、e101、p103、y109、k126及g128。在某些实施方案中，该表位可指一或多个tfpi“接触”残基(具有距离同源抗体的重原子内的重原子(即，非氢原子))，并包含一或多个选自以下组的残基：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、met134、glu138(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表29b。在某些实施方案中，该表位可指一或多个参与与抗体残基或与水分子(其也与同源抗体氢键结合，水介导的氢键结合)氢键结合的tfpi残基，并包含一或多个选自以下组的残基：asp102、arg107、arg112、tyr127及leu131(根据seqidno：2编号)及其任何组合。这些表位残基参与与同源抗体氢键结合。参见表29b。在某些实施方案中，该表位可指由于与同源抗体相互作用而在隐藏的表面区域(bsa)中包含非零变化的残基，并包含一或多个选自以下组的残基：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、asn133、met134、glu138(根据seqidno：2编号)及其任何组合。这些参见表29b。这些不同类别的表位残基的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，该表位包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、或所有上述表位残基、或上述各种类别的表位残基的任何组合。tfpi-23(及变体)的抗原互补位残基可指以下的接触残基(位于tfpi表位残基的内)：h33ala、h47trp、h50ala、h51ile、h52ser、h56ser、h58tyr、h95leu、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、h100aser、l29ala、l31tyr、l91tyr、l95aser、l95bgly和l95cser；及任选地，l93ser和l96gly(根据kabat编号)。l93ser和l96gly是任选的，因为该距离略微超过但足够接近至被舍入成需注意的是，上述接触残基是来自tfpi-23抗体的原始残基。然而，基于结构分析和丙氨酸扫描，据信tfpi-23中的许多接触残基可被另一残基取代而不会显著影响抗原结合。例如，表29a显示tfpi-23中的许多接触残基可被其他残基取代而仅对结合或稳定性造成<0.5kcal/mol的影响(“<0.5kcal/mol”意指取代对结合具中性效果)。尤其是，如表29a第4列所示，3个cdr位置及1个构架位置：h47、h58、l91及l96(根据kabat编号)仅能容许一或二个残基：(a)h47是trp或tyr；(b)h58是tyr；(c)l91是tyr或arg；且(d)l96是gly或asn。如表29a第4列中所归纳的，其他cdr位置可容纳更多取代。因此，在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列残基(根据kabat编号)：(a)h33是ala、asn、gly、his、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp或val；(b)h47是trp或tyr；(c)h50是ala、arg、gly、lys、met、phe、pro、ser、thr、tyr或val；(d)h51是ile、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(e)h52是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、glyhis、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、trp、tyr或val；(f)h56是ser、arg、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(g)h58是tyr；(h)h95是leu、gln、ile、phe或tyr；(i)h96是gly、ala、arg、asn、asp、gln、ile、lys、met、phe、pro、ser、thr或val；(j)h97是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(k)h98是thr、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(1)h99是ser、ala、gly、phe或pro；(m)h100是leu、arg、his、ile、leu、lys、phe、pro、trp、tyr或val；(n)h100a是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp；(o)l29是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(p)l31是ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(q)l91是tyr或arg；(r)l95a是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；(s)l95b是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；及(t)l95c是ser、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；并任选地包含(u)l93是tyr、ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val；及(v)l96是gly或asn。在这些残基中，h47是构架残基；其他所有均为cdr残基。当施加更严格的取代标准时-取代必须导致<-0.5kcal/mol的亲和性，这意味着取代必须具有积极(中性/稳定)效果-接触残基如下(根据kabat编号)(表29a第5栏)：(a)h33是ala或val；(b)h47是trp；(c)h50是ala；(d)h51是ile；(e)h52是ser、arg、lys、phe或tyr；(f)h56是ser、arg或lys；(g)h58是tyr；(h)h95是leu；(i)h96是gly、ala、arg、asn、lys、pro、ser或val；(j)h97是ala；(k)h98是thr、his、ile、leu、met、phe或tyr；(1)h99是ser；(m)h100是leu、phe、trp或tyr；(n)h100a是ser、arg、asn、gln、glu、his、leu、lys、met、phe、pro或trp；(o)l29是ala；(p)l31是tyr；(q)l91是tyr；(r)l95a是ser、phe、trp或tyr；(s)l95b是gly；及(t)l95c是ser、arg、asn、gln、glu、ile、leu、lys、met、phe、trp、tyr或val；及任选地：(u)l93是ser；及(v)l96是gly。此外或另外，可接受的取代的选择可基于表29a的第6列，其中前3个残基根据其对亲和性的影响(即，对亲和性最具稳定作用的前3个预测位点)选定。根据此标准，接触残基如下(根据kabat编号)：(a)h33是ala、val、his或phe；(b)h47是trp或tyr；(c)h50是ala、thr、ser或phe；(d)h51是ile、arg、lys或pro；(e)h52是ser、phe、arg或tyr；(f)h56是ser、lys、tyr或phe；(g)h58是tyr；(h)h95是leu、ile、gln或phe；(i)h96是gly、arg、asn或lys；(j)h97是ala、leu、tyr或ile；(k)h98是thr、tyr、phe或his；(1)h99是ser、pro、ala或phe；(m)h100是leu、tyr、trp或phe；(n)h100a是ser、arg、leu或trp；(o)l29是ala、glu、asp或gln；(p)l31是tyr、glu、asp或trp；(q)l91是ty或arg；(r)l95a是ser、phe、tyr或his；(s)l95b是gly、glu、asp或pro；及(t)l95c是ser、trp、tyr或phe；及任选地(u)l93是ser、glu、asp或his；(v)l96是gly或asn。tfpi-23(及变体)的抗原互补位残基也可指参与与tfpi的残基或与水分子(其也与tfpi氢键结合)氢键结合的残基，且包含以下：h58tyr、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、l29ala、l31tyr和l95bgly(根据kabat编号)。参见表29b。tfpi-23(及变体)的抗原互补位残基也可指由于与tfpi相互作用而在bsa中具有非零变化的残基，且包含以下：(根据kabat编号)：h33ala、h58tyr、h95leu、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、h100aser、l29ala、l31tyr、l91tyr、l93ser、l95aser及l95bgly。施用截断(bsa是或更大，或参与静电相互作用)以避免包含具有最小相互作用的残基。参见表29b。若未施用bsa的截断，抗原互补位残基包括以下：h33ala、h34met、h47trp、h50ala、h51ile、h52ser、h56ser、h58tyr；h95leu、h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100leu、h100aser、l28gly、l29ala、l31tyr、l91tyr、l93ser、l94ser、l95aser、l95bgly、l95cser及l96gly。参见表29c。本发明的抗体或其抗原结合片段可结合与本发明具体举例的抗体所结合的相同的tfpi表位或结构域。例如，抗体或其抗原结合片段可通过比较其与tfpi的结合及tfpi-23或生殖系变体(例如tfpi-106和tfpi-107)与tfpi的结合来鉴定；或通过比较这些抗体与tfpi-23及其变体的功能来鉴定。可用于这些鉴别目的的分析和测定包括评估竞争结合tfpi的测定并将在实施例中举例说明。在一实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可结合与本发明所描述的抗体(例如tfpi-23及其变体)所结合的相同的表位或区域。这可包括其与如上所述的特定tfpi残基接触。例如，本发明的抗体或抗原结合片段可以与选自以下组的残基接触(在内)的方式与tfpi结合：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、met134、glu138(根据seqidno：2编号)及其任何组合。本发明的抗体或其抗原结合片段可有能力与包含一或多个选自以下组的残基的表位结合：asp102、gly104、ile105、cys106、arg107、gly108、arg112、tyr127、gly129、cys130、leu131、gly132、met134、glu138(根据seqidno：2编号)及其任何组合。抗体及其抗原结合片段可包含至少一个位于tfpi上的至少一个表位残基(根据seqidno：2编号)内的抗原互补位残基(根据kabat编号)，如下所示：表位残基102asp位于抗原互补位残基h58内；表位残基104gly位于抗原互补位残基h58内；表位残基105ile位于抗原互补位残基h33ala、h50ala、h51ile、h52ser、h56ser、h58tyr、h95内；表位残基106cys位于抗原互补位残基h100leu和h100a内；表位残基107arg位于抗原互补位残基h96gly、h97ala、h98thr、h99ser、h100内；表位残基108gly位于抗原互补位残基h100内；表位残基112arg位于抗原互补位残基l29ala、l31内；表位残基127tyr位于抗原互补位残基l31内；表位残基129gly位于抗原互补位残基l31内；表位残基130cys位于抗原互补位残基l91tyr、l95b内；表位残基131leu位于抗原互补位残基h47trp、h50ala、h58tyr、l95aser、l95bgly、l95c内；表位残基132gly位于抗原互补位残基h58tyr、l95aser、h58tyr、l95a内；表位残基134met位于抗原互补位残基l95a内；且表位残基138glu位于抗原互补位残基l29内。参见表29a和29b。抗体或其抗原结合片段也可包含至少一个可与tfip的表位残基(根据seqidno：2编号)形成氢键的抗原互补位残基(根据kabat编号)，如下所示：表位残基102asp可与抗原互补位残基h58tyr形成氢键；表位残基107arg可与至少一个选自以下组的抗原互补位残基形成氢键：h96gly、h97ala、h98thr、h99ser及h100leu；表位残基112arg可与抗原互补位残基l29ala形成氢键；表位残基127tyr可与抗原互补位残基l31tyr形成氢键；且表位残基131leu可与抗原互补位残基l95bgly形成氢键。参见表29b。抗体或其抗原结合片段也可包含至少一个由于与表位残基(根据seqidno：2编号)相互作用而在bsa具有非零变化的抗原互补位残基(根据kabat编号)，如下所示：表位残基102asp与抗原互补位残基h58tyr相互作用；表位残基104gly与抗原互补位残基h58tyr相互作用；表位残基105ile与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h33ala、h34met、h50ala、h51ile、h52ser、h56ser、h58tyr和h95leu；表位残基106cys与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h95leu、h100leu、h100aser和l91tyr；表位残基107arg与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h96gly、h97ala、h98thr、h99ser和h100leu；表位残基108gly与抗原互补位残基h100leu相互作用；表位残基112arg与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：l29ala、l31tyr和l93ser；表位残基127tyr与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：l31tyr和l95bgly；表位残基129gly与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h100aser、l31tyr和l91tyr；表位残基130cys与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h95leu、h100aser、l31tyr、l91tyr和l95bgly；表位残基131leu与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h47trp、h50ala、h58tyr、h95leu、l31tyr、l91tyr、l95aser、l95bgly、l95cser和l96gly；表位残基132gly与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：h58tyr和l95aser；表位残基133asn与抗原互补位残基l95aser相互作用；表位残基134met与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：l93ser、l94ser和l95aser；且表位残基138glu与至少一个选自以下组的抗原互补位残基相互作用：l28gly、l29ala和l93ser。本发明的抗体或其抗原结合片段可是任何包含与至少一个上列表位残基相互作用的上述任一抗原互补位残基的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有上述抗原互补位残基，或上述各种类别的抗原互补位残基的任何组合。此外，可在这些抗原互补位残基中引入保守取代。例如，抗体或其抗原结合片段可包含1、2、3、4、5、6、7、或8个根据表34的保守取代。表34保守取代残基保守取代残基保守取代alaserleuile,valarglyslysarg,glnasngln；hismetleu,ileaspgluphemet,leu,tyrcysserserthr；glyglnasnthrser,valgluasptrptyrglyprotyrtrp,phehisasn,glnvalile,leuileleu,valpro-本发明的抗体如本发明所述可有能力与另一抗体竞争结合本发明tfpi。例如，本发明的抗体可与本发明所描述的tfpi-23及其变体交叉竞争结合tfpi，或结合被tfpi-23抗体结合的tfpi的合适的片段或变体。这种交叉竞争抗体可根据其在标准结合测定中与本发明的示例性抗体交叉竞争的能力来鉴定。例如可使用spr(例如通过使用biacoretm系统)、elisa测定或流式细胞术来证明交叉竞争。这种交叉竞争可能暗示这两种抗体结合相同、重叠或类似的表位。因此，本发明的抗体可通过包含结合测定的方法鉴定，该方法评估测试抗体是否能与本发明的示例性抗体(例如本发明所描述的tfpi-23或其任何变体或片段)竞争结合靶分子上的结合位点。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：38的cdr-h1、包含seqidno：39的cdr-h2和包含seqidno：40的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：33的cdr-l1、包含seqidno：34的cdr-l2和包含seqidno：35的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：38至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：39至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：40至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：33至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：34至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：35至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：38、39、40、33、34和35，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，该取代是根据表29a第4列、第5列或第6列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系重链构架是衍生自vh1、vh3或vh5生殖系的构架。例如，可使用来自下列生殖系的vh构架：ighv3-23、ighv3-7或ighv1-69(生殖系名称是基于imgt生殖系定义)。优选人类生殖系轻链构架是衍生自vk或vλ生殖系的构架。例如，可使用来自下列生殖系的vl构架：igkv1-39或igkv3-20(生殖系名称是基于imgt生殖系定义)。此外或另外，构架序列可是人类生殖系共有构架序列，例如人类vλ1共有序列、vk1共有序列、vk2共有序列、vk3共有序列、vh3生殖系共有序列、vh1生殖系共有序列、vh5生殖系共有序列或vh4生殖系共有序列的构架。人类生殖系构架的序列可从各种公开的数据库获得，例如v-base、imgt、ncbi或abysis。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与选自以下组的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno：41、63和65；和/或(ii)vl，其包含与seqidno：36至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：26至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：42、seqidno：64或seqidno：66至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：37至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。tfpi-24及变体共晶结构显示出tfpi-24(和其变体)与tfpi-23共享许多表位残基。其中，ile105、arg107和leu131(根据人类tfpi编号，如seqidno：2所示)被认为对抗体-抗原相互作用是重要的。其他共有的表位残基包括：cys106、gly108、c130、l131和g132(根据seqidno：2编号)。对tfpi-24(和其变体)特异的表位残基包括：glu100、glu101、asp102、gly104和tyr109。tfpi-23及其变体不与这些残基结合。参见表27。因此，本发明提供特异性结合tfpi的k2中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该表位(i)包含残基ile105、arg107和leu131；(ii)任选地包含一或多个选自以下组的残基：cys106、gly108、cys130、leu131和gly132；及(iii)进一步任选地包含一或多个选自以下组的残基：glu100、glu101、asp102、gly104和tyr109(根据seqidno：2编号)。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：p103、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126、l140(编号根据seqidno：2)及其任何组合。参见表27。根据wo201007269(诺和诺德公司)，参考抗体4f36识别包含以下的表位：p103、t111、y113、f114、n116、q118、q121、c122、e123、r124、f125、k126和l140。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、p103、k126、y127、g128(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表27。根据表27，参考抗体2a8和2a8-200识别包含以下的表位：d31、d32、p34、c35、k36、p103、k126、y127和g128。也表征来自tfpi-24的抗原互补位残基(基于bsa)(参见表24)且包括以下：h33ala、h35gln、h52ser、h53asn、h55arg、h56ser、h95phe、h96leu、h97his、h99ser、h101asp、l31met、l32tyr、l34his、l36tyr、l50arg、l91trp及l96tyr。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或所有这些抗原互补位残基。此外，可在这些抗原互补位残基中引入保守取代。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含根据表34的1、2、3、4、5、6、7或8个保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：48的cdr-h1、包含seqidno：49的cdr-h2和包含seqidno：50的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：43的cdr-l1、包含seqidno：44的cdr-l2及包含seqidno：45的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：48至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：49至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：50至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：43至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：44至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：45至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：48、49、50、43、44和45，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是如上所述的衍生自vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含(i)vh，其包含与选自以下组的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno：67、69、51和79；和/或(ii)vl，其包含与选自以下组的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno：46、71、73、75和77。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：26至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：52、seqidno：68、seqidno：70或seqidno：80至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：47、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76或seqidno：78至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本公开内。4d8及变体共晶结构也揭露抗体4d8及变体的表位和抗原互补位信息。4d8及其变体的表位残基包括：glu101、pro103、tyr109、thr111、ser119、gln121、glu123、arg124、lys126和leu140(根据seqidno：2编号)。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：e100、d102、r107、y113、f114、n116、q118、c122(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表27。根据wo201007269(诺和诺德公司)，参考抗体4f36识别包含e100、d102、r107、y113、f114、n116、q118和c122的表位。在某些实施方案中，该表位不包含一或多个选自以下组的残基：d31、d32、p34、c35、k36、e100、i105、r107、g108、y127、g128(根据seqidno：2编号)及其任何组合。参见表27。根据表27，参考抗体2a8和2a8-200识别包含d31、d32、p34、c35、k36、p103、k126、y127和g128的表位。也表征来自4d8的抗原互补位残基(基于bsa)(参见表24)并包括以下：h50asp、h57thr、h58leu、h59tyr、h61gln、h98asp、h99tyr、h100asp、l30his、l50trp、l92tyr、l93thr、l94thr和l96tyr。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有这些抗原互补位残基。此外，这些抗原互补位残基中可引入保守取代。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含根据表34的1、2、3、4、5、6、7或8个保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：87的cdr-h1、包含seqidno：88的cdr-h2和包含seqidno：89的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：81的cdr-l1、包含seqidno：82的cdr-l2和包含seqidno：83的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(ⅰ)与seqidno：87至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：88至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：89至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：81至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：82至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：83至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：87、88、89、81、82和83，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是衍生自如上所述的vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与选自以下组的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno：90、95、97、99、101、103、105和107；和/或(ii)vl，其包含与选自以下组的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno：84、109和111。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：91或seqidno：85至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106、seqidno：108至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：86、seqidno：93、seqidno：110或seqidno：112至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。tfpi-3及变体本发明也提供tfpi-3及其变体。因此，基于tfpi-3的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：16的cdr-h1、包含seqidno：17的cdr-h2及包含seqidno：18的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：10的cdr-l1、包含seqidno：11的cdr-l2和包含seqidno：12的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：16至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：17至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：18至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：10至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：11至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：12至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：16、17、18、10、11和12，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是衍生自如上是述的vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与seqidno：19至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，和/或(ii)vl，其包含与seqidno：13至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：91或seqidno：14至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：21至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：15至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。tfpi-21及变体本发明也提供tfpi-21及其变体。因此，基于tfpi-21的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：28的cdr-h1、包含seqidno：29的cdr-h2及包含seqidno：30的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：22的cdr-l1、包含seqidno：23的cdr-l2和包含seqidno：24的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：28至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：29至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：30至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：22至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：23至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：24至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：28、29、30、22、23和24，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是如上所述的衍生自vk或vλ生殖系的构架。也可使用上述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与seqidno：31至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，和/或(ii)vl，其包含与seqidno：25至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：91或seqidno：26至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：32至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：27至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。tfpi-26及变体本发明也提供tfpi-26及其变体。因此，基于tfpi-26的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：58的cdr-h1、包含seqidno：59的cdr-h2及包含seqidno：60的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：53的cdr-l1、包含seqidno：54的cdr-l2和包含seqidno：55的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：58至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：59至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：60至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：53至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：54至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：55至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：58、59、60、53、54和55，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是如上所述的衍生自vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与seqidno：61至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，和/或(ii)vl，其包含与seqidno：56至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：20至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：26至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：62至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：57至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。6b7.c5及变体本发明也提供6b7.c5及其变体。因此，基于6b7.c5的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：118的cdr-h1、包含seqidno：119的cdr-h2及包含seqidno：120的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：113的cdr-l1、包含seqidno：114的cdr-l2和包含seqidno：115的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：118至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：119至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：120至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：113至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：114至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：115至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：118、119、120、113、114和115，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是如上所述的衍生自vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与seqidno：121至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，和/或(ii)vl，其包含与seqidno：116至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：91至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：91或seqidno：85至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：122至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：117至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。7a4.d9及变体本发明也提供7a4.d9及其变体。因此，基于7a4.d9的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)包含seqidno：128的cdr-h1、包含seqidno：129的cdr-h2及包含seqidno：130的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：包含seqidno：123的cdr-l1、包含seqidno：124的cdr-l2和包含seqidno：125的cdr-l3。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含下列重链cdr序列：(i)与seqidno：128至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h1、与seqidno：129至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h2和与seqidno：130至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-h3；和/或(ii)下列轻链cdr序列：与seqidno：123至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l1、与seqidno：124至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l2和与seqidno：125至少85％、至少90％或至少95％相同的cdr-l3。在某些实施方案中，相对于seqidno：128、129、130、123、124和125，分别在各cdr中制造不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在某些实施方案中，该取代是根据表34的保守取代。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含人类构架序列。例如，重链构架序列可来自如上所述的人类vh3生殖系、vh1生殖系、vh5生殖系或vh4生殖系。优选人类生殖系轻链构架是如上所述的衍生自vk或vλ生殖系的构架。也可使用如上所述的共有人类生殖系构架序列。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh，其包含与seqidno：131至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，和/或(ii)vl，其包含与seqidno：126至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些vl和vh序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)ch，其包含与seqidno：91至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)cl，其包含与seqidno：91或seqidno：85至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些ch和cl序列的任何组合也包含在本发明内。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含fc结构域。该fc结构域可衍生自iga(例如iga1或iga2)、igg、ige或igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，本发明所描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含与seqidno：132至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，其包含与seqidno：127至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明内。也公开了特异性结合tfpi的k2结构域并与本发明所描述的任一抗体或其抗原结合片段(例如表3中所列的任一抗体(或其抗原结合片段))竞争结合tfpi的抗体或其抗原结合片段。例如，若抗体或其抗原结合部分与tfpi的结合阻碍后续tfpi-23或tfpi-106与tfpi结合，则该抗体或其抗原结合部分与tfpi-23或tfpi-106竞争结合tfpi。也公开了特异性结合tfpi的k2结构域并与本发明所描述的任一抗体或其抗原结合片段(例如表3中所列的任一抗体(或其抗原结合片段))结合至相同的tfpi表位的抗体或其抗原结合片段。通过spr的示例性抗体竞争测定(及重叠表位分析)提供于实施例6中。本发明所公开的抗体和抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv、fc，等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体(heteroconjugateantibody)、单链(scfv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、结构域抗体(dab)、人源化抗体及包含所需特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体)。抗体和抗原结合片段可是小鼠、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是嵌合、人源化或人类抗体。在某些实施方案中，该抗体是人类抗体。在某些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，本发明所公开的抗体及其抗原结合片段的亲和性(kd)值不超过约1×10-3m，例如不超过约5×10-4m、不超过约4×10-4m、不超过约3×10-4m、不超过约2×10-4m、不超过约1×10-4m、不超过约9×10-5m、不超过约8×10-5m、不超过约7×10-5m、不超过约6×10-5m、不超过约5×10-5m、不超过约4×10-5m、不超过约3×10-5m、不超过约2×10-5m、不超过约1×10-5m、不超过约9×10-6m、不超过约8×10-6m、不超过约7×10-6m、不超过约6×10-6m、不超过约5×10-6m、不超过约4×10-6m、不超过约3×10-6m、不超过约2×10-6m、不超过约1×10-6m、不超过约9×10-7m、不超过约8×10-7m、不超过约7×10-7m、不超过约6×10-7m、不超过约5×10-7m、不超过约4×10-7m、不超过约3×10-7m、不超过约2×10-7m、不超过约1×10-7m、不超过约9×10-8m、不超过约8×10-8m、不超过约7×10-8m、不超过约6×10-8m、不超过约5×10-8m、不超过约4×10-8m、不超过约3×10-8m、不超过约2×10-8m、不超过约1×10-8m、不超过约9×10-9m、不超过约8×10-9m、不超过约7×10-9m、不超过约6×10-9m、不超过约5×10-9m、不超过约4×10-9m、不超过约3×10-9m、不超过约2×10-9m、不超过约1×10-9m、约1×10-3至约1×10-13m、1×10-4至约1×10-13m、1×10-5至约1×10-13m、约1×10-6至约1×10-13m、约1×10-7至约1×10-13m、约1×10-8至约1×10-13m、约1×10-9至约1×10-13m、1×10-3至约1×10-12m、1×10-4至约1×10-12m、约1×10-5至约1×100-12m、约1×10-6至约1×10-12m、约1×10-7至约1×10-12m、约1×10-8至约1×10-12m、约1×10-9至约1×10-12m、1×10-3至约1×10-11m、1×10-4至约1×10-11m、约1×10-5至约1×10-11m、约1×10-6至约1×10-11m、约1×10-7至约1×10-11m、约1×10-8至约1×10-11m、约1×10-9至约1×10-11m、1×10-3至约1×10-10m、1×10-4至约1×10-10m、约1×10-5至约1×10-10m、约1×10-6至约1×10-10m、约1×10-7至约1×10-10m、约1×10-8至约1×10-10m或约1×10-9至约1×10-10m。在某些实施方案中，解离常数使用表面等离子体共振(spr)法(biacore)测量。表面等离子体共振是指一种光学现象，其是例如通过使用biacoretm系统检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变从而实时分析生物特异性相互作用。在某些实施方案中，该spr测量使用biacoret100或t200仪器进行。例如，用于表面等离子体共振的标准测定条件可基于约100个igg反应单位(ru)的配体固定于spr芯片上。将纯化的靶蛋白用缓冲剂稀释至最终浓度范围并以必需的流速(例如10-100μl/min)注射，以计算ka。使解离进行以建立解离速率(kd)，再进行5秒3mmgcl2(或20mmnaoh)脉冲以使芯片表面再生。然后，使用动力学评估软件包分析传感(sensorgram)。在示例性实施方案中，spr测定是根据实施例1中子标题“表面等离子体共振(spr)”下所列出的条件。在某些实施方案中，解离常数利用基于溶液的动力学排除测定(kinexatm)测量。在特定实施方案中，该kinexa测量使用kinexatm3200仪器(sapidyne)进行。该动力学排除测定(kinexatm)是能够测量抗原/抗体相互作用的平衡解离常数及结合和解离速率常数的通用免疫测定平台(基本上是流式荧光分光荧光计(flowspectrofluorometer))。由于kinexatm在已获得平衡后进行，其是用于测量高亲和性相互作用的kd的有利技术，其中该相互作用的解离速率可能很慢。该kinexatm方法可大致依drakeetal(2004)analyticalbiochemistry328,35-43中的描述进行。一般而言，tfpi抗体需要以高亲和性结合tfpi以有效地阻断tfpi的活性。但是，由于tfpi也表达在细胞表面上，当该抗体的结合亲和性过高，该抗体可很快地被内在化和被宿主细胞降解。这可潜在地导致短的半衰期及重复注射。例如，与tfpi-24相比，抗体tfpi-23显示出较低的结合亲和性(kd)，且在某些情况下更是理想，因为其具有较低的内在化速率和较长的半衰期。因此，若需要较长的半衰期，则结合亲和性(kd)在5×10-7m至约5×10-11m，尤其是约1×10-8至约1×10-10m(0.1nm至10nm)通常是期望的。此范围被认为在(i)有效抑制tfpi的活性所需的结合亲和性，及(ii)较长的半衰期和减少抗体内在化之间获得平衡。尤其是，认为为了维持每周以3mg/kg皮下给药，kd值在约1×10-8m至约1×10-10m(0.1nm至10nm)是期望的。抗体或其抗原结合片段是否降低tfpi的活性或减少tfpi与生理底物(例如fxa)结合可通过测量tfpi与所述生理底物的结合亲和性的降低来测定，例如通过比较(i)在抗tfpi抗体(或其抗原结合片段)存在时，tfpi与其底物的结合亲和性与(ii)在抗tfpi抗体不存在时，tfpi与同一底物的结合亲和性来进行。在抗tfpi抗体(或其抗原结合片段)存在时，tfpi与生理底物(例如fxa)的结合可减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。当该抗体(或片段)不存在时，tfpi与其生理底物的预期结合可设为100％。也可在体内模型和/或体外使用例如血浆系统评估抗tfpi抗体或其抗原结合片段的tfpi抑制活性(本发明中也称为“降低tfpi的活性”)。例如，抗体的抑制活性(或降低tfpi的活性的水平)可通过以下评估：(i)减少在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中所测量的凝血时间；(ii)减少通过血栓消融术所测量的全血凝血时间；(iii)增加凝血酶生成；(iv)在tfpi存在时增加fxa活性；(v)在tfpi存在时，增强的血小板累积；(vi)在tfpi存在时，增加的纤维蛋白生或；或(vii)其任何组合。抗体或抗原结合片段的抑制活性可是剂量依赖性的(例如造成在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中所测量的凝血时间剂量依赖性降低)。几种用于评估抗体的tfpi抑制活性的示例性测定在实施例中有详细的描述。例如，血浆稀释凝血酶原时间(pt)测定是修饰的pt测定，其利用稀释的促凝血酶原激酶(thromboplastin)或组织因子以延长该测定的凝血时间及动态范围。抑制/中和抗tfpi抗体应可减少稀释凝血酶原时间。用于测定tfpi抑制活性的另一示例性模型系统是外源性tenase测定，其测试抗体或其抗原结合片段在tfpi存在时回复由外源性复合物介导的fx活化的能力。另一用于表征tfpi抑制活性的模型系统是fxa抑制测定，其中在tfpi存在时测量fxa活性(参见sprecheretal.,proc.nat.acad.sci.usa91:3353-3357(1994))。也可在基于血浆的测定中评估抗体或其抗原结合片段的抑制活性。在抗tfpi抗体或其抗原结合片段存在时，可在基本上缺乏fviii或fix活性(例如残余的凝血因子活性低于1％)的血浆中触发凝血酶形成。凝血酶形成可使用荧光底物或显色底物检测。凝血酶原转化可利用例如thrombographtm(thermoscientific，waltham，mass.)测量，且所得数据可通过从thrombinoscopebv获得的thrombinoscopetm软件编译生成校准的自动凝血酶生成图(calibratedautomaticthrombogram)。例如，抗体或抗原结合片段可提高fviii不存在时(例如在fviii耗竭血浆中)tfpi调节的凝血酶生成达到正常血浆中tfpi依赖性凝血酶生成水平的至少1％。一般而言，正常(无困扰的)血浆中含有约0.5u/ml至约2u/ml的因子viii。因此，在一些情况中，本发明的抗体或抗原结合片段将增强fviii不存在时的凝血酶形成达到存在0.5u/ml至2u/mlfviii时所观察到的至少约1％。在进一步的实施方案中，该抗体(或其抗原结合片段)增强fviii不存在时的凝血酶形成达到正常血浆中(即，在生理水平的因子viii存在)的凝血酶形成水平的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约7％或至少约10％。该抗体或抗原结合片段也可施用于凝血酶缺乏或血友病的动物模型以表征tfpi的体内抑制活性。这些体内模型是本领域已知的，且包括例如施用抗fviii抗体以诱导血友病a的小鼠(tranholmetal.,blood,102,3615-3620(2003))；凝血因子敲除模型，例如但不限于fviii敲除小鼠(bietal.,nat.genet.,10(1),119-121(1995))及fix敲除小鼠(wangetal.,proc.nat.acad.sci.usa94(21):11563-11566(1997)；兔子诱导的血友病a(shenetal.,blood,42(4):509-521(1973))；及chapelhillha狗(lozieretal.,proc.nat.acad.sci.usa99:12991-12996(2002))。在某些实施方案中，本发明公开的抗体(或抗原结合片段)在tfpi的存在时增强fxa活性，其半最大有效浓度(ec50)不超过1×10-4m、不超过1×10-5m、不超过1×10-6m、不超过1×10-7m、不超过1×10-8m、不超过1×10-9m、不超过1×10-10m、不超过1×10-11m或不超过1×10-12m。优选该ec50是约5×10-7m至1×10-11m，例如约1×10-7m至5×10-10m、约1×10-7m至1×10-10m、1×10-7m至5×10-9m、5×10-7m至5×10-10m、约5×10-7m至1×10-10m或约5×10-7m至5×10-9m。在某些实施方案中，本发明的抗体(或抗原结合片段)中和tfpi对fviia/tf介导的fx活化的抑制作用，其半最大有效浓度(ec50)不超过1×10-4m、不超过1×10-5m、不超过1×10-6m、不超过1×10-7m、不超过1×10-8m、不超过1×10-9m、不超过1×10-10m、不超过1×10-11m或不超过1×10-12m。优选该ec50是约5×10-7m至1×10-11m，例如约1×10-7m至5×10-10m、约1×10-7m至1×10-10m、1×10-7m至5×10-9m、5×10-7m至5×10-10m、约5×10-7m至1×10-10m或约5×10-7m至5×10-9m。在某些实施方案中，如在基于血浆的稀释凝血酶原时间测定中所测量的，本发明公开的抗体(或抗原结合片段)减少凝血时间，其半最大有效浓度(ec50)不超过1×10-4m、不超过1×10-5m、不超过1×10-6m、不超过1×10-7m、不超过1×10-8m、不超过1×10-9m、不超过1×10-10m、不超过1×10-11m或不超过1×10-12m。优选该ec50是约5×10-7m至1×10-11m，例如约1×10-7m至5×10-10m、约1×10-7m至1×10-10m、1×10-7m至5×10-9m、5×10-7m至5×10-10m、约5×10-7m至1×10-10m或约5×10-7m至5×10-9m。在某些实施方案中，本发明公开的抗体(或抗原结合片段)增加凝血酶生成速率指数，其半最大有效浓度(ec50)不超过1×10-4m、不超过1×10-5m、不超过1×10-6m、不超过1×10-7m、不超过1×10-8m、不超过1×10-9m、不超过1×10-10m、不超过1×10-11m或不超过1×10-12m。优选该ec50是约5×10-7m至1×10-11m，例如约1×10-7m至5×10-10m、约1×10-7m至1×10-10m、1×10-7m至5×10-9m、5×10-7m至5×10-10m、约5×10-7m至1×10-10m或约5×10-7m至5×10-9m。在某些实施方案中，本发明公开的抗体及抗体片段也可进一步通过其他生物活性测定评定，例如，以评估其效价、药学活性及作为治疗剂的潜在效力。这些测定是本领域已知且取决于该靶抗原和该抗体的预期用途。实例包括例如肿瘤细胞生长抑制测定；抗体依赖性细胞毒性(adcc)及补体介导的细胞毒性(cdc)测定；激动活性或拮抗活性测定。c.多核苷酸，载体及宿主细胞本发明也提供编码本公开的任一tfpi结合抗体的多核苷酸，包括本发明所描述的抗体片段和修饰的抗体，例如，如具有减弱的fc效应子功能的抗体。在另一方面，本发明提供制备本发明所描述的任一多核苷酸的方法。多核苷酸可通过本领域已知的方法制备及表达。因此，本发明提供多核苷酸或组合物(包括包含编码本发明的任一tfpi抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的药物组合物)。在一实施方案中，vh和vl结构域、或其抗原结合片段、或全长hc或lc是由不同的多核苷酸编码。或者，vh和vl二者、或其抗原结合片段、或hc和lc是由单一多核苷酸编码。本发明提供编码本发明的任一tfpi抗体及其抗原结合片段(包括，但不限于tfpi-23、tfpi-24、tfpi-106、tfpi-107及4d8)的多核苷酸或包含多核苷酸的组合物，其中该多核苷酸的序列包含seqidno：175(编码tfpi-106vh区)、seqidno：176(编码tfpi-106vl区)、seqidno：177(编码tfpi-106重链)及seqidno：178(编码tfpi-106轻链)的序列。在另一方面，本发明提供编码特异性结合tfpi的抗体的vh区或其抗原结合部分的分离的核酸，其包含存在于以atcc保藏号pta-122329保藏的质粒中的插入片段的核酸序列。在另一方面，本发明提供编码特异性结合tfpi的抗体的vl区或其抗原结合部分的分离的核酸，其包含存在于以atcc保藏号pta-122328保藏的质粒中的插入片段的核酸序列。在另一方面，本发明提供编码tfpi抗体或其部分的多核苷酸及其变体，其中这些变体多核苷酸包含与本发明公开的任一特定核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的核酸序列。任何长度的核苷酸序列上的序列相同性程度可利用本领域普通技术人员所熟悉的方法计算。在一非限制性实施方案中，二或多个相关核苷酸序列之间的序列相同性百分比可利用从nationallibraryofmedicine获得的核苷酸blast服务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)测定。该软件提供不同的设置使得本领域普通技术人员可根据例如长度、复杂性的因素及其他因素来优化序列比较。本发明提供包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码本发明的任一tfpi抗体及其抗原结合片段的氨基酸序列(包括但不限于表33中提供的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，例如seqidno：21-174的氨基酸序列)，及与本发明抗体结合至相同的表位和/或竞争结合tfpi的任一抗体的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供编码tfpi抗体的多核苷酸及其变体，其中这些变体多核苷酸编码与本发明公开的任一tfpi抗体氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、在至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列相同性的氨基酸序列。在其他实施方案中，包含编码tfpi抗体或其部分的变体多核苷酸序列的核酸与本发明公开的任何特定核苷酸序列之间的相关性程度可通过测试该变体序列(或其补体)是否可与特定的核苷酸序列(或其补体)在中度或高度严格条件下在rna印记或dna印记测定形式中杂交。示例性和非限制性的“中度严格条件”包括在5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)的溶液中预洗；在50℃至65℃，5×ssc中杂交，过夜；接着再在65℃用含有0.1％sds的2x、0.5x和0.2xssc各清洗20分钟，进行二次。示例性和非限制性的“高度严格条件”或“高严格条件”是指以下：(1)采用低离子强度和高温以用于清洗，例如在50℃，0.015氯化钠/0.0015柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在42℃，在杂交过程中采用变性剂，例如甲酰胺(例如50％(v/v)甲酰胺)与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯啶酮/50mm磷酸钠缓冲剂，ph6.5，加750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠；或(3)在42℃，采用50％甲酰胺、5×ssc(0.75mnacl、0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×denhardt溶液、经超音处理的鲑鱼精dna(50μg/ml)、0.1％sds及10％硫酸葡聚糖，并在42℃以0.2×ssc(氯化钠/柠檬酸钠)及在55℃以50％甲酰胺清洗，随后在55℃以由含有edta的0.1×ssc组成的高严格洗剂清洗。本领域技术人员将察知如何依需要调整温度、离子强度等以适应例如探针长度等因素。本领域普通技术人员也将熟悉用于进行rna印迹或dna印迹测定的标准技术以检测核苷酸序列变体与本公开的特定核苷酸序列之间的相关性程度。本发明也包含与任一这些序列互补的多核苷酸。多核苷酸可是单链(编码或反义)或双链，且可是dna(基因组、cdna或合成的)或rna分子。rna分子包括hnrna分子(其含有内含子并以一对一的方式对应于dna分子)及不含有内含子的mrna分子。额外的编码或非编码序列可，但不一定存在于本发明的多核苷酸中。或者，变体也可基本上与天然基因、或其部分或其补体同源。这些多核苷酸变体能够在中度严格条件下与编码天然抗体的天然dna序列(或互补序列)杂交。本领域普通技术人员将可理解由于遗传密码的简并性，有许多核苷酸序列能够编码本发明所公开的任一tfpi抗体或其部分。这些多核苷酸中有些可能与本发明所提供的tfpi抗体的任一特定核苷酸序列具有相当低的序列相同性，但编码相同氨基酸序列。然而，由于密码子用途的差异而有所变化的多核苷酸是本发明所特别考虑的。本发明的多核苷酸可使用化学合成、重组方法或pcr来获得。化学多核苷酸合成方法是本领域所周知的，并不需要在本发明中详细地描述。本领域技术人员可使用本发明提供的序列及市售的dna合成仪来产生所需的dna序列。在使用重组方法制备多核苷酸方面，可将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，然后可将该载体引入合适的宿主细胞中用于复制和扩增(如本发明所进一步讨论的)。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方法插入宿主细胞中。细胞可通过直接摄取、胞吞作用、转染、f-交配或电穿孔引入外源多核苷酸来转化。一旦引入后，可将该外源多核苷酸以非整合载体(例如质粒)或被整合入宿主细胞基因组中的形式保持在细胞内。如此扩增的多核苷酸可通过本领域所周知的方法从宿主细胞中分离出。参见，例如sambrooketal.,1989。或者，pcr允许复制dna序列。pcr技术是本领域所周知的，且描述于美国专利第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202号以及pcr:thepolymerasechainreaction,mullisetal.eds.,birkauswerpress,boston,1994中。rna可通过在合适的载体中使用分离的dna并将其插入合适的宿主细胞中来获得。当细胞复制而dna转录成rna时，随后该rna可利用本领域技术人员所周知的方法(例如sambrooketal.,1989(同上)中所列举的)被分离出。合适的克隆载体可根据标准技术构建或可从本领域中可用的大量克隆载体中选择。虽然所选定的克隆载体可根据欲使用的宿主细胞而变化，有用的克隆载体通常具有自我复制的能力、可拥有用于特定的限制性内切酶的单一靶和/或可携带可用于选择含有该载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbssk+)及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna及穿梭载体，例如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可从商业供货商例如biorad、stratagene和invitrogen获得。进一步提供表达载体。表达载体通常是含有根据本发明的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。其意味着表达载体必须能在宿主细胞中或以游离基因(episome)或以染色体dna的组成部分形式复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、黏粒)及pct公布第wo87/04462号中所公开的表达载体。载体组分通常可包括但不限于一或多种下列物质：信号序列；复制起点；一或多个标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即翻译)，通常也需要一或多个翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。含有感兴趣的多核苷酸的载体和/或多核苷酸自身可通过多种适当方式的任一种引入宿主细胞中，包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质转染；基因枪法(microprojectilebombardment)；脂质体转染；及感染(例如其中该载体是感染剂，例如牛痘病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于该宿主细胞的特性。本发明也提供包含本发明所描述的任一多核苷酸的宿主细胞。任何能超量表达异源dna的宿主细胞均可用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于：猿cos、人hela、人胚肾(hek)293、sp2.0及中国仓鼠卵巢(cho)细胞。也参见pct公布第wo87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtillis))和酵母(例如酿酒酵母(s.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。表达tfpi抗体或其抗原结合部分的宿主细胞的筛选可使用免疫结合测定检测，例如elisa、facs或其他本领域普通技术人员熟悉的测定。因此，本发明的抗体(或其抗原结合片段)可使用合适的宿主细胞来重组产生。编码该抗体或其抗原结合片段的核酸可克隆入表达载体中，然后可将其引入不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、cos细胞、cho细胞或骨髓瘤细胞)中以得到在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。示例性宿主细胞包括cho细胞、hek293及sp2.0细胞。表达载体可用于直接表达tfpi抗体。本领域技术人员熟悉如何施用表达载体以得到在体内表达外源蛋白。参见，例如美国专利第6,436,908；6,413,942；及6,376,471号。表达载体的施用包括局部或全身性施用，包括注射、口服施用、粒子枪或导管插入施用及局部施用。根据某些非限制性实施方案，该表达载体是直接施用至肝脏、骨骼肌、骨髓或其他组织。也可使用靶向递送含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物。受体介导的dna递送技术描述于，例如findeisetal.,trendsbiotechnol.,1993,11:202；chiouetal.,genetherapeutics:methodsandapplicationsofdirectgenetransfer,j.a.wolff,ed.,1994；wuetal.,j.biol.chem.,1988,263:621；wuetal.,j.biol.chem.,1994,269:542；zenkeetal.,proc.natl.acad.sci.usa,1990,87:3655；wuetal.,j.biol.chem.,1991,266:338中。在基因疗法方案中，用于局部施用的含有多核苷酸的治疗组合物以约100ng至约200mg的dna的范围施用。在基因疗法方案期间也可使用浓度范围在约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg、约20μg至约100μg的dna。治疗性多核苷酸和多肽可使用基因递送载剂递送。该基因递送载剂可是病毒或非病毒来源(一般参见jolly,cancergenetherapy,1994,1:51；kimura,humangenetherapy,1994,5:845；connelly,humangenetherapy,1995,1:185；及kaplitt,naturegenetics,1994,6:148)。这些编码序列的表达可使用内源性哺乳动物启动子或异源启动子诱导。该编码序列的表达可是组成型或调节的。用于递送期望的的多核苷酸并在期望的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域所周知的。示例性的基于病毒的载剂包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如pct公布第wo90/07936；wo94/03622；wo93/25698；wo93/25234；wo93/11230；wo93/10218；wo91/02805号；美国专利第5,219,740和4,777,127号；gb专利第2,200,651号；及ep专利第0345242号)、基于α病毒的载体(例如sindbis病毒载体、semlikiforest病毒(atccvr-67；atccvr-1247)、罗斯河(rossriver)病毒(atccvr-373；atccvr-1246)和委内瑞拉马脑炎(venezuelanequineencephalitis)病毒(atccvr-923；atccvr-1250、atccvr1249；atccvr-532))及腺相关病毒(aav)载体(参见，例如pct公布第wo94/12649、wo93/03769；wo93/19191；wo94/28938；wo95/11984和wo95/00655号)。也可采用施用如curiel,hum.genether.,1992,3:147中所描述的连接灭活的腺病毒的dna。也可采用非病毒递送载剂和方法，包括但不限于连接或未连接单独的灭活的腺病毒的聚阳离子性缩合dna(参见，例如curiel,hum.genether.,1992,3:147)；配体连接的dna(参见，例如wu,j.biol.chem.,1989,264:16985)；真核细胞递送载剂细胞(参见，例如美国专利第5,814,482号；pct公布第wo95/07994；wo96/17072；wo95/30763；和wo97/42338号)及核酸电荷中和或与细胞膜融合。也可采用裸dna。示例性的裸dna导入方法描述于pct公布第wo90/11092号和美国专利第5,580,859号中。可作为基因递送载剂的脂质体描述于美国专利第5,422,120号；pct公布第wo95/13796；wo94/23697；wo91/14445号；及ep0524968中。额外的方法描述于philip,mol.cellbiol.,1994,14:2411和woffendin,proc.natl.acad.sci.,1994,91:1581中。期望的抗体(或其抗原结合片段)的序列及编码这些抗体(或其抗原结合片段)的核酸可使用标准测序技术测定。编码期望的抗体(或片段)的核酸序列可插入用于重组生产及表征的其他载体(例如克隆和表达载体)中。重链(或该重链的片段)和轻链(或该轻链的片段)可克隆在相同载体或不同载体中。合适的克隆和表达载体可以包括各种组分，例如启动子、增强子及其他转录调节序列。该载体也可经建构以允许抗体可变结构域在不同载体之间移动。抗体片段可通过蛋白水解或其他抗体降解方法、通过重组方法或通过化学合成来产生。抗体的多肽，尤其是至多约50个氨基酸的较短多肽可方便地通过化学合成制备。化学合成方法是本领域中已知且可购得的。本发明公开的抗体或其抗原结合片段可是亲和性成熟的。例如，亲和性成熟的抗体可通过本领域中已知的方法来制造(marksetal.,1992,bio/technology,10:779-783；barbasetal.,1994,proc.nat.acad.sci.usa91:3809-3813；schieretal.,1995,gene,169:147-155；yeltonetal.,1995,j.immunol.,155:1994-2004；jacksonetal.,1995,j.immunol.,154(7):3310-3319；hawkinsetal.,1992,j.mol.biol.,226:889-896；和wo2004/058184)。4.剂型及用途本发明所描述的抗体或抗原结合片段可配制成药物剂型。以冻干剂型或水溶液形式的药物剂型可进一步包含药物上可接受的传递体、赋形剂或稳定剂(remington:thescienceandpracticeofpharmacy20thed.,2000,lippincottwilliamsandwilkins,ed.k.e.hoover)。可接受的传递体、赋形剂或稳定剂在该剂量和浓度下对接受者是无毒的，且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫胺酸；防腐剂(例如十八烷基二甲苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子性表面活性剂，例如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。本发明中进一步描述药物上可接受的赋形剂。本发明所描述的抗体或抗原结合片段可用于各种治疗或诊断目的。例如该抗体或其抗原结合片段可作为亲和性纯化剂(例如用于体外纯化tfpi)、作为诊断剂(例如用于检测特定细胞、组织或血清中的tfpi表达)。本发明的抗体及抗体片段的示例性治疗用途包括治疗血小板减少症(thrombocytopenia)、血小板异常(血小板功能或数目的病症)及出血病症(例如血友病a、血友病b及血友病c)。该抗体和抗体片段也可用于治疗适应症中的不受控制的出血，例如创伤和出血性中风。该抗体和抗体片段也可用于预防性治疗(例如在外科手术之前)。尤其是，本发明所描述的抗体或抗原结合片段可用于治疗凝血缺乏或凝血缺陷。例如，本发明所描述的抗体或抗原结合片段可用于减少或抑制tfpi与fxa的相互作用，或减少tfpi依赖性抑制tf/fviia/fxa活性。在治疗应用方面，本发明所描述的抗体或抗原结合片段可通过常规技术施用于哺乳动物，尤其是人类，例如通过静脉(以药团(bolus)或通过在一段时间内连续输注)、肌肉内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或通过吸入。抗体或抗原结合片段也适合通过瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用。因此，在一方面，本发明提供降低组织因子途径抑制剂(tfpi)活性的方法，其包含对有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。在另一方面，本发明提供缩短出血时间的方法，其包含对有此需要的对象施用治疗有效量的本发明描述的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，该对象是人类。在某些实施方案中，该对象患有或易发生凝血缺陷。凝血缺陷包括，例如血管性血友病(vonwillebranddisease)(vwd)、血友病a、b或c及其他血小板异常(例如先天性血小板缺陷、先天及后天储存池缺乏症、出血时间延长)。在某些实施方案中，本发明描述的抗体或抗原结合片段通过皮下施用。在某些实施方案中，本发明描述的抗体或抗原结合片段通过静脉施用。该药物组合物可以不同频率施用于有此需要的对象，该频率可随着出血事件的严重性而变化，在预防性治疗的情况中，可能随着患者凝血缺陷的严重性而变化。该组合物可以药团或通过连续输注施用于有需要的患者。例如，药团施用以fab片段呈现的抗体，所用量可是0.0025至100mg/kg(体重)、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10至0.50mg/kg。在连续输注方面，以fab片段呈现的抗体的施用量可是在1至24小时、1至12小时、2至12小时、6至12小时、2至8小时或1至2小时的期间内递送0.001至100mg/kg(体重)/分钟、0.0125至1.25mg/kg/分钟、0.010至0.75mg/kg/分钟、0.010至1.0mg/kg/分钟或0.10至0.50mg/kg/分钟。在施用全长抗体(具有完整的恒定区)形式的抗体方面，剂量可是约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约2mg/kg至约20mg/kg、约3mg/kg至约20mg/kg、约4mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg或更多、约2mg/kg或更多、约3mg/kg或更多、约4mg/kg或更多、约5mg/kg或更多、约6mg/kg以上、约7mg/kg或更多、约8mg/kg或更多、约9mg/kg或更多、约10mg/kg或更多、约11mg/kg或更多、约12mg/kg或更多、约13mg/kg或更多、约14mg/kg或更多、约15mg/kg或更多、约16mg/kg或更多、约17mg/kg或更多、约19mg/kg或更多或约20mg/kg或更多。施用频率将取决于病况的严重程度。频率范围可是每周三次至每二周或每三周一次。此外，该组合物可通过皮下注射施用于患者。例如，可将剂量为1至100mg的抗tfpi抗体每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周二次、每周、每二周、或每月一次通过皮下注射施用于患者。在某些实施方案中，该药物组合物是按每周的时间表通过皮下施用约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约8mg/kg、约0.5mg/kg至约8mg/kg、约1mg/kg至约8mg/kg、约1.5mg/kg至约8mg/kg、约2mg/kg至约8mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg、约5.0mg/kg、约5.5mg/kg、约6.0mg/kg、约6.5mg/kg、约7.0mg/kg、约7.5mg/kg、约8.0mg/kg、约8.5mg/kg、约9.0mg/kg、约9.5mg/kg或约10.0mg/kg的剂量。在某些实施方案中，该药物组合物是按每周的时间表通过皮下施用约2.0mg/kg的剂量。在某些实施方案中，该药物组合物是按每周的时间表通过皮下施用约3.0mg/kg的剂量。本发明描述的抗体和抗体片段可以单一疗法或与其他疗法组合使用来解决止血异常。例如，共同施用一或多种本发明的抗体(或抗体片段)与凝血剂(例如因子viia、因子viii、因子ix或氨甲环酸(tranexamicacid))对治疗血友病是有用的。在一实施方案中，提供了用于治疗凝血缺陷或缩短出血时间的方法，其包含施用(a)第一量的本发明的抗体或抗原结合片段，及(b)第二量的因子viii或因子ix。任选地，不共同施用因子vii。在另一实施方案中，提供了用于治疗凝血缺陷或缩短出血时间的方法，其包含施用(a)第一量的本发明的抗体或抗原结合片段，及(b)第二量的因子viii或因子ix。任选地，不共同施用因子vii。本领域技术人员将理解在治疗凝血缺陷时，缩短出血时间也可称为缩短凝血时间。本发明也包括包含治疗有效量的本发明抗体(或抗体片段)与因子viii或因子ix的药物组合物，其中该组合物不包含因子vii。“因子vii”包括因子vii和因子viia。生物保藏本发明的代表性物质于2015年7月22日保藏于美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，10801universityboulevard,manassas,va.20110-2209,usa)。具有atcc保藏号pta-122329的质粒载体mab-tfpi-106vh包含编码抗体tfpi-106重链可变区的dna插入片段，而具有atcc保藏号pta-122328的质粒载体mab-tfpi-106vl包含编码抗体tfpi-106轻链可变区的dna插入片段。该保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的规定。这确保该保藏的培养物从保藏之日起30年可保持存活。该保藏物将根据布达佩斯条约的条款由atcc提供并受辉瑞公司和atcc之间的协议管制，此协议确保该保藏的培养物后代在相关的美国专利发布时或在任何美国或外国专利申请(以先到者为准)开放给公众时的永久和无限制可用性，并确保由u.s.commissionerofpatentsandtrademarks按照35u.s.c.section122andthecommissioner’srules(包括37c.f.r.section1.14，特别参考886og638)决定后代的可用性。本申请的受让人已同意若存放的培养物在合适的条件下培养时死亡或遗失或损坏，将在通知时及时更换另一相同物质。保藏的物质的可用性不应被理解为允许在违背任何政府根据其专利法授权下实施本发明的许可。实施例本发明通过参考下列实验实施例做进一步的详细描述。除非另有规定，这些实施例仅用于说明的目的，而不意图用于限制。因此，本发明不应在任一方面被解释为限于下列实施例，而应被解释为包含因本发明所提供的教导而变得显明的任何及所有变化。实施例1：实验材料及方法1.tfpi蛋白质试剂表1中列出用于免疫、噬菌体展示选择及表征抗tfpi抗体的蛋白质试剂，且其序列id列于表2中。使tfpi构建体(psmed2载体)瞬时表达于hek293f细胞中并在转染后120小时收获条件培养基。使用镍琼脂糖hp(nickelsepharosehp)从条件培养基捕获感兴趣的的蛋白质并通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。从haematologictechnologies,inc.获得因子xa及因子x。从sekisuidiagnostics获得用于因子xa的酰胺分解测定的显色底物fxa。表1用于免疫、噬菌体展示选择及鉴定抗tfpi抗体的蛋白质试剂表1tfpi试剂序列标识号、描述和序列2.抗体试剂用于比较目的的单克隆抗体(参考抗体2a8、2a8-200、3f18、hz4f36)列于表3中。抗体描述、来源及序列列于表4中(图5)。将轻链和重链序列克隆入适当的载体中并瞬时表达于人胚肾-293(hek-293)细胞中，再通过蛋白a琼脂糖(proteinasepharose)及尺寸排阻色谱法纯化。从r&d系统(目录#mab2974)获得mab2974。表3轻链(lc)cdr1、2、3、可变轻(vl)、恒定轻(cl)、轻链(lc)、重链(hc)cdr1、2、3、可变重(vh)、恒定重(ch)和重链(hc)区域。seqid号的序列组成在表4中。3.tfpi结合elisa利用avitagtm系统将重组humtfpik1k2、murtfpik1k2、cyntfpik1k2、rattfpik1k2、rabtfpik1k2或tfpi2生物素化，并在elisa测定缓冲剂中以1×10-8m的浓度被捕获到greiner链霉抗生物素包被的96孔板上。将纯化的抗tfpi抗体在elisa测定缓冲剂中稀释至1μg/ml，再连续稀释3倍以产生8-点稀释系列。在每一孔中加入体积为100μl的稀释的抗体。将该板在室温下孵育2小时。以pbs/0.05％tween20清洗该板后，将该板与以1:10,000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg-fc多克隆抗体(pierce)一起孵育。孵育1小时后，通过加入tmb底物溶液来检测结合的抗体。读取在450nm的吸光度并通过graphpadprism软件分析数据。4.表面等离子体共振(spr)通过胺偶联抗人类igg抗体(目录编号br-1008-39，gehealthcare)至羧甲基化葡聚糖包被的传感器芯片(cm5)(目录编号br100530，gehealthcare)上的所有四个流通池(flowcell)来制备抗人类fc传感器芯片。通过注射400mm1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的1:1混合物7分钟，以流速10μl/分钟来活化该流通池。将抗-人类igg抗体在10mm醋酸钠(ph5.0)中稀释至25μg/ml并以流速10μl/分钟注射在所有流通池上7分钟。以1m乙醇胺hcl(eth)封闭所有流通池7分钟，流速为10μl/分钟。该捕获抗体的最终固定水平为约10,000共振单位(ru)。用于固定和动力学的运行缓冲液是10mmhepesph7.4、150mmnacl、3mmedta、0.05％(v/v)tween-20(hbs-ep+)。为了表征抗tfpi抗体与人类tfpi的结合，将该抗体在hbs-ep+中稀释至0.5μg/ml，并由固定在流通池2、3和4中的抗人类igg、以5μl/分钟的流速捕获30秒至1分钟，以达到70至300ru的捕获水平。使用流通池1作为参考表面。捕获抗体后，将流速增加至50μl/分钟并将缓冲剂或在hbs-ep+中浓度范围为0.2nm至200nm的人类tfpi注射在所有流通池上以结合1.0分钟，再允许其解离10至15分钟。使用所收集的每个捕获抗体的缓冲剂循环以供双重参考(myszka,d.g.j.mol.recognit.12,279-284(1999))。在每个周期结束时，通过60秒脉冲3mmgcl2使整个抗igg表面再生。在25℃，在biacoret200仪器(gehealthcare)上以10hz的收集速率进行动力学测定。通过将数据拟合至biacoret200评估软件版本1.0(ge)的1：1模型来测定速率常数和亲和性。5.因子xatfpi抑制恢复测定体外评估在抑制性浓度的tfpi存在时，纯化的抗tfpi抗体恢复因子xa活性的能力。将在pbs中稀释的浓度范围为1nm至500nm的抗tfpi抗体与在活性缓冲剂(20mmhepes，ph8.0、150mmnacl、5mmcacl2、0.5mg/mlbsa)中的10nm重组人类tfpik1k2或10nm兔子tfpik1k2蛋白在37℃下预孵育30分钟。加入2nm衍生自人类血浆的因子xa并将反应物在37℃下孵育30分钟。将显色底物spectrozymexa加入其中，使100μl的最终反应体积的最终浓度为500μm。对照反应包括不含因子xa以控制测定背景、不含tfpi以允许fxa的生成最多(100％活性)、或不含抗tfpi抗体(单独的pbs)的反应。立即在spectramaxm5e多模式盘式分析仪上，在60分钟的期间内，每隔2分钟在405nm波长处读取反应的吸光度。以prismgraphpad软件计算ec50。6.两阶段tf-fviia-fx抑制恢复测定体外评估在抑制性浓度的tfpi存在时，纯化的抗tfpi抗体恢复因子viia-组织因子活性的能力。将浓度范围为1nm至500nm的抗tfpi抗体与在活性缓冲剂中的10nm重组tfpik1k2蛋白在37℃下预孵育30分钟。将约1pm脂化的组织因子和1nm重组因子viia(novoseven)加入该反应物中并在37℃孵育5分钟。将150nm的人类因子x引入该反应物中。在每个孔中加入显色底物spectrozymexa，使100μl的最终反应体积的最终浓度为500μm。对照反应包括不含因子viia、不含组织因子、不含因子x、不含tfpi或不含抗tfpi抗体(单独的pbs)的反应。立即在spectramaxm5e多模式盘式分析仪上，在60分钟的期间内，每隔2分钟在405nm波长处读取反应的吸光度。以prismgraphpad软件计算ec50。7.凝血酶生成试验(tga)使用校准的自动凝血酶生成图(cat)系统在凝血酶生成试验中评估纯化的抗tfpi抗体在因子viii活性减弱的血浆中恢复凝血酶生成的能力。将在pbs中稀释的浓度为1nm至500nm的抗tfpi抗体引入含有人类因子viii缺乏血浆及ppp-低试剂、含有4μm磷脂及1pm组织因子的反应物中。对照反应物使用pbs，不含抗体。加入含有荧光凝血酶底物及cacl2的fluca缓冲剂来触发反应。立即使用fluoroskanascent盘式分析仪，使用thrombinoscope软件在60分钟内，每隔20秒读取各反应物的荧光。将各反应物与含有pbs、凝血酶校准器、因子viii缺乏血浆及fluca缓冲剂的校准器对照孔相比较。使用thrombinoscope软件(thrombinoscopebv版本)分析thrombinoscope凝血酶生成曲线(nm凝血酶对时间)以推断出延迟时间、波峰高度及达到峰值时间及曲线下面积或内源性凝血酶潜能(etp)。使用这些数据来计算速度指数(峰值凝血酶浓度/达到峰值时间-延迟时间)。也评估纯化的抗tfpi抗体在因子viii活性减弱的兔子血浆中恢复凝血酶生成的能力。在37℃，以最终浓度为100μg/ml的抗fviii抗体(gm-8015)或浓度为100μg/ml的对照小鼠抗人类igg2a处理正常的新西兰白兔血浆60分钟。在加入反应孔前不久，将兔子血浆在缓冲剂(20mmhepes，140mmnacl)中以1:3稀释。如上所述，以fviii中和的兔子血浆进行凝血酶生成试验。8.产生用于结构研究的食蟹猴(cynomolgus)tfpik2结构域将食蟹猴(cyno)tfpik1k2(表1)表达在hek293细胞中并在转染后120小时收获条件培养基。将纯化的cynotfpik1k2120与人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(hne)以1:70(摩尔比hne:tfpi)在室温一起孵育120分钟以发生裂解。在hq50(poros)上利用阴离子交换色谱法将cynok1从cynok2分离。使用superdex75进行尺寸排阻谱来作为最终纯化步骤。使用内蛋白酶aspn将残基avitag从cynok2结构域的c端修剪掉。9.产生用于结构研究的抗体fab/cynotfpik2复合物依照制造商(thermo/pierce)的方案，用固定的木瓜蛋白酶消化抗tfpi抗体4d8.b1、tfpi-23、tfpi-24、2a8-200(表3)及mab2974(r&d系统)。使用mabselectsure纯化来自消化的fab，再将其与cynotfpik2形成复合物。然后，将fab/cynotfpik2复合物浓缩至约16mg/ml。再使用该浓缩物筛选蛋白质结晶条件。实施例2.产生小鼠抗tfpi抗体1.小鼠免疫和产生杂交瘤将一同龄组共5只的balb/c小鼠各自用在完全弗氏佐剂中乳化的5μghumtfpik1k2和5μgmurtfpik1k2蛋白质混合物皮下免疫。随后每周以在不完全弗氏佐剂中乳化或在pbs中稀释的蛋白质混合物将小鼠免疫2次。在第17天及27天(分别在第五和第七次免疫之后)采取血液样本，通过elisa测试血清中循环抗tfpi抗体的存在。在第27天，每只小鼠通过腹腔内注射接受最后一次蛋白质混合物(10μg)加强注射。四天后，收获引流淋巴结(腋、腹股沟及腘)并将汇集的淋巴结细胞与p3x63.ag8.653细胞以1：1的比例混合并进行电-细胞融合。将融合的细胞铺板在补充有fbs(25％)、nctc-109(12.5％)、glutamax(1％)、青霉素-链霉素(1％)、杂交瘤克隆补充剂(5％)和hat(1×10-4m次黄嘌呤、4×10-7m氨基喋呤(aminopterin)及1.6×10-5m胸苷)的rpmi1640培养基中。14天后通过elisa测试该融合杂交瘤培养上清液与humtfpik1k2的结合。根据其结合活性及其在功能测定中的效力，选择来自三个杂交瘤4d8、6b7和7a4的抗体用于进一步表征。2.衍生自杂交瘤的抗tfpi抗体的克隆和测序制备来自杂交瘤4d8、6b7和7a4的rna并通过rt-pcr克隆获得来自该表达的抗体的可变区dna序列。将pcr产物克隆到topo-ta克隆载体中，然后通过常规方法测序。从杂交瘤6b7和7a4检测到一重链和轻链cdna对。从4d8中检测到二重链和轻链cdna。实施例3.表征小鼠杂交瘤抗tfpi抗体通过有限稀释将亲代杂交瘤4d8、6b7和7a4亚克隆以获得单克隆杂交瘤细胞系。通过elisa筛选与humtfpik1k2的反应性以鉴定阳性亚克隆并扩增。将来自各杂交瘤的一个亚克隆的纯化的抗体进一步表征。1.tfpi结合通过蛋白质结合elisa测试纯化的抗tfpi抗体4d8.b1、6b7.c5和7a4.d9与重组人类和兔tfpi蛋白的结合。各抗体对humtfpik1k2-avihis10及rabtfpik1k2的ec50值显示于表5中。表5小鼠抗tfpi单克隆抗体对人类和兔子tfpi的ec50(nm)值抗体ec50(nm)humtfpik1k2ec50(nm)rabtfpik1k24d8.b10.09590.09766b7.c50.12090.12897a4.d90.08870.0887进行表面等离子体共振实验以评估该纯化的小鼠抗tfpi抗体对人类和兔子tfpik1k2蛋白的亲和性。各抗体与人类和兔子tfpik1k2结合的ka、kd和kd值显示于表6中。表6抗tfpi小鼠杂交瘤克隆结合人类和兔子tfpi的动力学测量分析物配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)humtfpik1k24d8.b19.58x1051.14x10-31.19humtfpik1k26b7.c55.52x1053.63x10-36.58humtfpik1k27a4.d91.48x1069.21x10-36.22rabtfpik1k24d8.b12.01x1061.26x10-30.63rabtfpik1k26b7.c51.14x1065.64x10-34.95rabtfpik1k27a4.d95.30x1061.88x10-23.552.体外活性测定在fxa和tf-fxa-fviia抑制恢复测定及凝血酶生成试验(tga)中测试抗tfpi小鼠单克隆抗体的活性。选择最有效的抗体4d8.b1进行进一步研究。表7抗-tfpi小鼠单克隆抗体在fxa和tf-fxa-fviia抑制恢复测定和凝血酶生成试验(tga)中的活性抗体fxaec50(nm)fxa-fviiaec50(nm)tga在20nm的速率指数4d8.b15.96.6726.36b7.c513.912.1323.57a4.d922.39.3523.3实施例4.从克隆4d8产生嵌合及人源化抗体1.产生小鼠人类嵌合型抗体4d8将衍生自杂交瘤4d8的可变区cdna亚克隆入哺乳动物表达载体中以产生其中小鼠重链可变区与人类igg13m(seq20，表4)在构架中融合，而小鼠轻链可变区与人类igκ恒定区(seq62，表4)在构架中融合的嵌合抗体。将该嵌合构建体瞬时转染入hek293细胞中。以所有可能的重和轻链组合进行共四次的瞬时转染以鉴定来自杂交瘤4d8的正确的重和轻链对。从其中一次转染产生的抗体被称是hu-mu4d8嵌合体(表3和4)。2.表征小鼠-人类嵌合抗体4d8(hu-mu4d8)通过蛋白质结合elisa(表8)和spr(表9)测试mu-hu4d8嵌合体与人类和兔子tfpik1k2蛋白结合的能力。该kd和ec50值与那些纯化的小鼠mab4d8.b1测得的数值非常相当，证明移植到人类igg1背景的小鼠可变区的移植可保留结合活性。表8mu-hu4d8嵌合体对人类和兔子tfpi的ec50(nm)值抗体ec50(nm)humtfpik1k2ec50(nm)rabtfpik1k2mu-hu4d8chimera0.05770.0680表9mu-hu4d8嵌合体对人类和兔子tfpi的动力学测量分析物配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)humtfpik1k2mu-hu4d8chimera9.58x1051.14x10-31.19rabtfpik1k2mu-hu4d8chimera2.01x1061.26x10-30.633.人源化hu-mu4d8嵌合体通过cdr移植到人类受体构架序列上来将hu-mu4d8嵌合体序列人源化。选择dp54构架和dpk9构架。然后表达重和轻链构建体的组合(参见表3)。在elisa结合测定中测试抗体与人类和兔子tfpi结合(表10)及在spr结合测定中测试抗体与人类tfpi结合(表11)。表10人源化4d8抗体结合人类和兔子tfpik1k2蛋白的ec50(nm)值表11人源化4d8抗体结合humtfpik1k2蛋白的spr分析抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd,nm4d8vk1.0xvh1.06.77x1044.70x10-46.94x10-94d8vk1.0xvh1.16.06x1041.54x10-32.54x10-84d8vk1.0xvh1.22.38x1051.65x10-46.95x10-104d8vk1.0xvh1.37.95x1045.71x10-47.19x10-94d8vk1.0xvh1.47.55x1048.35x10-41.11x10-84d8vk1.1xvh1.01.25x1058.35x10-45.50x10-104d8vk1.1xvh1.11.93x1051.61x10-48.32x10-104d8vk1.1xvh1.21.51x1059.49x10-56.27x10-104d8vk1.1xvh1.31.59x1051.31x10-48.23x10-104d8vk1.1xvh1.42.21x1055.28x10-52.93x10-10基于这些数据，选择4d8vk1.1xvh1.4进行进一步表征且命名为hz4d8(表3)。在抑制恢复测定、两阶段tf-fviia-fx抑制测定和凝血酶生成试验中比较人源化抗tfpi抗体(hz4d8)与小鼠4d8.b1fxa的活性。表12中的数据显示出与小鼠抗体相比，人源化抗体在所有三个测定中均具有提高的活性，这指出tfpi结合活性被完全保留在人源化抗体中。表124d8.b1和hz4d8抗体在fxa和tf-fxa-fviia抑制恢复测定和凝血酶生成试验(tga)中的活性比较抗体fxaec50(nm)fxa-fviiaec50(nm)tga在20nm的速率指数4d8.b14.153.513.5hz4d81.871.5715.7实施例5.通过噬菌体展示技术产生额外的抗tfpi抗体1.通过噬菌体展示选择抗tfpi抗体使用衍生自未经免疫的人类供体的scfv抗体片段的噬菌体展示文库进行4轮选择后鉴定结合重组人类和小鼠tfpik1k2的单链片段可变(scfv)抗体。使用链霉抗生物素小珠在溶液中进行噬菌体选择。通过与140mm的三乙醇胺(tea)ph11.5或50mm的mesph5.5，在室温的旋转振荡器上孵育10分钟来洗脱结合的噬菌体，并以1mtris-hclph7.5中和的。使用洗脱的噬菌体库感染10ml已生长至中期对数期的大肠杆菌er2738培养物(相当于od600为约0.5)。在37℃，以噬菌体感染细菌30分钟，不摇动，通过离心浓缩并进行铺板，再在30℃下生长过夜。在下一轮选择中，通过接种在25ml的2×tyag/四环素达到od600约为0.1，再令其在37℃生长至od600为0.3至0.5来拯救噬菌体。以1:20细胞/辅助噬菌体的比率用mk13k07辅助噬菌体超感染细胞并在37℃不摇动孵育30分钟，再在150rpm摇动60分钟。然后将细胞离心并将沉淀重新悬浮在含卡那霉素/非葡萄糖的培养基中。令此培养物在25℃生长过夜。离心后收获上清液中的噬菌体并用于下一轮的选择。2.制备用于elisa测定的粗周质材料根据所使用的生长条件，scfv抗体片段可表达在噬菌体颗粒表面上或在细菌周质空间的溶液中。为了诱导释放scfv抗体片段进入周质中，将来自解冻的甘油贮存物接种在含有2xty培养基与0.1％葡萄糖/100μg/ml氨苄青霉素的96深孔板中，并在37℃生长约4小时。通过渗透压休克释放细菌周质的内容物(peripreps)。将板离心并收获含有scfv的上清液。3.elisa测量表达在周质中的scfv与人类和小鼠tfpik1k2的结合随机从所有分支选择的第2、3和4轮中挑出总共1984个克隆。通过周质制备物(periprep)结合elisa来鉴定tfpiscfv结合株(binder)。将在pbs中浓度为1μg/ml的生物素化的人类和小鼠tfpik1k2包被在384孔nuncmaxisorp链霉抗生物素板上。将tfpik1k2溶液移除并将该板在室温用0.05％tween20/1％bsa/pbs封闭1小时。制备周质制备物并在室温用等体积的6％乳/1％bsa封闭1小时。将20μl/孔的封闭的周质scfv和对照抗体转移至适当的板中并在室温孵育1小时。加入以1：2,000稀释的抗myc辣根过氧化物酶(hrp)的或以1:10,000稀释的山羊抗人类hrp二次抗体的以检测结合的scfv或抗tfpi对照抗体。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺发展信号并在envision盘式分析仪(perkinelmer)上读取在450nm的吸光度。共有883个scfv克隆被鉴定为tfpi结合株。将该883个tfpi结合scfv进行测序以鉴定独特的克隆。选出288个独特的克隆来测试tfpi/fxa竞争性结合。4.elisa鉴定与fxa竞争结合人类和小鼠tfpik1k2的scfv在fxa/tfpi竞争性结合elisa中共测试288个独特的克隆。将在pbs中浓度为1μg/ml的人类fxa包被在384孔nuncmaxisorp板上过夜。将fxa溶液移除并将该板在室温用0.05％tween20/1％bsa/pbs封闭1小时。制备周质制备物并在室温下用体积的6％乳/1％bsa封闭1小时。将20μl/孔的封闭的周质scfv和对照抗体与生物素化的humtfpik1k2混合并在室温孵育1小时。将混合物转移至fxa包被的板并在室温孵育1小时。加入以1：2000稀释的链霉抗生物素辣根过氧化物酶以检测结合的tfpi。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺发展信号，在envision盘式分析仪(perkinelmer)上，读取在450nm的吸光度。共有48个scfv抗体被归类为tfpi/fxa结合的竞争性抑制剂。5.scfv转化成人类igg共选出48个显示出结合tfpi及在tfpi/fxa竞争性elisa中抑制作用的具有独特序列的scfv抗体，以亚克隆到人类igg-3m克隆载体中。简单地说，通过标准pcr扩增片段。将vh或vl片段进行凝胶纯化并连接入含有人类igg1-3m(vh)或κ或λ恒定区(vk/vl)的哺乳动物表达载体中。然后，使用vh和vk/vl配对的表达载体在hek293细胞中以供瞬时哺乳动物表达并纯化。6.表征人类igg-3m抗tfpi抗体在各种测定(包括fxa和tf/fvii/fxa抑制恢复测定)中将48种抗tfpi抗体分级。tfpi-3、tfpi-21、tfpi-23、tfpi-24和tfpi-26具有所期望的性质，例如tfpi跨物种，与humtfpi2k1k2k3的结合力低或无(表13)。此相同5种抗体的fxa和tf/fviia/fxa抑制恢复测定数据显示于表14中，而spr结合数据显示于表15中。表13tfpi抗体显示结合多种tfpi物种(人、猴子、小鼠、兔子和大鼠)且与人类tfpi2结合弱或无表14tfpi抗体在fxa、tf/fviia/fxa抑制恢复测定和凝血酶生成试验中的活性抗体fxaec50(nm)fxa-fviiaec50(nm)tgavelocityindexat20nmtfpi-3207.937.4nttfpi-2180.6454.124.71tfpi-234632.223.28tfpi-24239.323.21tfpi-2612.89.618.65表15tfpi抗体对人类和小鼠tfpi的spr结合动力学分析物配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)humtfpik1k2tfpi-36.25x1041.7x10-327.05humtfpik1k2tfpi-217.85x1053.47x10-243.95humtfpik1k2tfpi-239.18x1059.71x10-39.89humtfpik1k2tfpi-241.59x1058.62x10-45.46humtfpik1k2tfpi-262.05x1051.18x10-35.79murtfpik1k2tfpi-32.15x1058.24x10-43.81murtfpik1k2tfpi-211.73x1067.71x10-34.54murtfpik1k2tfpi-231.69x1062.48x10-31.46murtfpik1k2tfpi-242.48x1055.96x10-324.1murtfpik1k2tfpi-261.29x1064.76x10-33.68实施例6.通过spr的抗tfpi抗体表位作图使用三明治spr测定来对本文中发现及公开的抗tfpi抗体(tfpi-21、tfpi-23、tfpi-24、4d8、6b7.c5和7a4.d9)的表位作图。其他已知的参考抗体(hz4f36、2a8-200和mab2974)也包括在表位作图实验中。使用nhs化学将抗体1固定在cm5biacore芯片上。首先将人类tfpi(humtfpik1k2)注射在该芯片上直到结合接近表观平衡。停止注射人类tfpi后立即将抗体2注射在该芯片上。如果抗体2结合该cm5芯片表面上的抗体1和人类tfpi的复合物，则抗体2相对于抗体1具有不同且非重叠的tfpi结合表位(记为+)。若抗体2显示出无结合，则其相对于抗体1被记为显著重叠的表位(负(-))。若抗体2显示出结合弱，则抗体1和2被认为在tfpi表位具有部分重叠(记为+/-)。如表16中所示，tfpi-21和tfpi-23具有类似的表位且该数据也显示tfpi-21和tfpi-23具有与mab2974和hz4f36完全不同的表位。表16使用spr三明治测定的抗tfpi抗体的表位作图将抗体1固定在cm5芯片的表面上。然后将人类tfpi(humtfpik1k2)注射到表面上，直到该测量接近表观平衡。停止tfpi注射后立即注射抗体2以测量与抗体1/tfpi复合物的结合。具有完全不同的表位的抗体1和2配对给予“+”记号。具有强烈重叠的表位的抗体配对给予“-”记号。若抗体2显示出结合弱，则抗体1和2被认为在tfpi表位中有一些部分重叠(记为+/-)。实施例7.生殖系化tfpi-23抗体的人类构架制备两种tfpi-23的变体以增加人类构架生殖系残基的含量。tfpi-106含有h1q至e及h5v至l的突变(kabat编号)，而tfpi-107(表3和4)含有h1q至e、h5v至l及h94i至k的突变(kabat编号)。表达tfpi-106、tfpi-107和tfpi-23，纯化后通过spr测试与humtfpik1k2的结合。表17中的数据显示出与tfpi-23亲本抗体比较时，tfpi-106生殖系变体保留全部结合亲和性。表17tfpi-23人类构架生殖系变体与人类tfpi的spr结合动力学当与亲本tfpi-23抗体比较时，tfpi-106显示出结合适度提高。实施例8.生殖系化tfpi-24抗体的人类构架制备四种tfpi-24vl变体(tfpi-110、tfpi-111、tfpi-112、tfpi-113)并与tfpi-24vh序列配对。制备三种tfpi-24vh变体(tfpi-108、tfpi-109、tfpi-114)并与tfpi-24vl序列配对。根据这些数据，将最佳的vl变体tfpi-113与最佳的vh变体tfpi-108配对以产生抗体tfpi-118。通过spr测试tfpi-118和tfpi-24与人类tfpi的结合，表18中的结果显示出相当的结合动力学。表18使用spr比较tfpi-24和人类构架变体tfpi-118与人类tfpi的结合动力学分析物配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)humtfpik1k2tfpi-249.18x1059.71x10-33.68humtfpik1k2tfpi-1181.25x1051.19x10-39.61tfpi-118显示出与亲本tfpi-23抗体相当的结合动力学。实施例9.抗tfpi抗体与来自不同物种的tfpi的spr结合动力学通过spr分析抗tfpi抗体(tfpi-106、tfpi-118及hz4f36)以测定对来自不同动物物种的tfpi(人类(hutfpik1k2)、食蟹猴(cyntfpik1k2)、兔子(rabtfpik1k2)、小鼠(murtfpik1k2)及大鼠(rattfpik1k2)；表1)的结合动力学。本实验中也包括三种比较(comparitor)抗体(hz4f36、2a8和2a8-200)。表19抗tfpi抗体对人类、食蟹猴、兔子、大鼠和小鼠tfpi的spr结合动力学(kd值是两个实验的平均数)实施例10.抗tfpi抗体/tfpi复合物结构1.4d8.b1fab/cynotfpik2复合物结构将4d8.b1fab和cynotfpik2以1：1的摩尔比混合以形成复合物。使用superdex200柱进行最后的纯化。将复合物浓缩成12.6mg/ml以供结构研究。在100mmtris-hclph8.5-20％peg10000中获得tfpik2+4d8fab复合物的晶体。其产生衍射达的棒状晶体。将晶体瞬时低温保护并在advancedphotonsource远程执行同步加速器数据收集。使用软件autoproc(globalphasingltd)处理影像框。该数据属于空间群p212121，晶胞如下：α＝β＝γ＝90°，每一不对称单位具有一个复合物。使用4d8fab的同源模型及可公开获得的tfpik2结构域的结构(rscbproteindatabank；pdbcodes1tfx和4dtg)进行分子置换搜索来产生令人信服的各组分的解析。使用软件autobuster(globalphasingltd)进行精修，在的最终r/rfree因子分别是0.1707和0.2424，键的rmsd是角度的rmsd是1.26°。基于fab/tfpik2界面处的残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)，测定4d8fab的表位及抗原互补位。下列tfpi的k2结构域中的残基参与直接接触4d8fab(根据bsa的表位)：e101、p103、y109、i110、t111、y113、f114、s119、q121、c122、e123、r124、f125、k126和l140。下列4d8fab的重链中的残基包含重链抗原互补位：d50、t57、l58、y59、q61、k64、d98、y99和d100。下列4d8fab的轻链中的残基包含轻链抗原互补位：h30、w50、h91、y92、t93、t94、p95和y96。该表位和抗原互补位残基的bsa和％bsa值显示于表20中。表20如4d8.b1fab/cynotfpik2复合物结构中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体4d8.b1表位和抗原互补位残基(抗体轻链(lc)和重链(hc)残基使用kabat定义编号).截断或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.残基链残基#分类bsa％bsaglutfpik2101表位33.9348.73protfpik2103表位34.9174.82tyrtfpik2109表位71.5455.15thrtfpik2111表位41.7266.65sertfpik2119表位32.8965.61glntfpik2121表位67.9986.51glutfpik2123表位63.5399.15argtfpik2124表位147.0997.31lystfpik2126表位114.7295.85leutfpik2140表位41.6260.14asp4d8.b1hc50抗原互补位5.9852.56thr4d8.b1hc57抗原互补位26.4842.04leu4d8.b1hc58抗原互补位72.9593.41tyr4d8.b1hc59抗原互补位15.7533.75gln4d8.b1hc61抗原互补位59.1445.41asp4d8.b1hc98抗原互补位62.8750.71tyr4d8.b1hc99抗原互补位44.2859.06asp4d8.b1hc100抗原互补位5.8327.84his4d8.b1lc30抗原互补位53.1856.60trp4d8.b1lc50抗原互补位53.4151.52tyr4d8.b1lc92抗原互补位97.9996.61thr4d8.b1lc93抗原互补位39.8973.42thr4d8.b1lc94抗原互补位48.0095.74tyr4d8.b1lc96抗原互补位15.4972.232.2a8和2a8-200fab/cynok1k2复合物结构将2a8fab和cynotfpik1k2以1：1的摩尔比混合以形成复合物。使用superdex200柱进行最后的纯化。将复合物浓缩成10.8mg/ml以供结构研究。在下列二个条件中获得含有2a8fab及tfpik1k2的复合物的结晶：(1)100mmhepesph7.5、12.5％peg8000，其产生衍射达的针状晶体；(2)100mmhepesph7.5、1600mm硫酸铵、2％peg1000，其产生衍射达的块状晶体。将晶体瞬时低温保护并在advancedphotonsource远程执行同步加速器数据收集。使用软件autoproc(globalphasingltd)处理影像框。该数据属于空间群p3221，晶胞如下：α＝β＝90°，γ＝120°，每一不对称单位具有一个复合物。使用2a8fab的同源模型及可公开获得的tfpik2结构域的结构(rscbproteindatabank；pdbcodes1tfx和4dtg)进行分子置换搜索来产生各组分的令人类信服的解析。使用软件phenix进行精修，在的最终r/rfree因子分别是0.1667和0.2088，键的rmsd是角度的rmsd是1.474°。基于fabtfpik1k2界面处的残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)，测定该复合物的表位及抗原互补位。下列tfpi的tfpik1k2结构域中的残基参与直接接触2a8fab(根据bsa的表位)：d31、d32、g33、p34、c35、k36、e100、e101、p103、g104、i105、c106、r107、g108、y109、e123、k126、y127和g128。下列2a8fab的重链中的残基包含重链抗原互补位：g26，t28，s31，y32，y96，r97，y98，w99和d101(kabat编号)。下列2a8fab的轻链中的残基包含轻链抗原互补位：l28、r29、n30、y31、y32、y49、y50、d51和n66(kabat编号)。该表位和抗原互补位残基的bsa和％bsa值显示于表21中。也使用基本上完全相同的方法解析在具有tfpik1k2的复合物中的密切相关的抗体2a8-200。此抗体的表位和抗原互补位与2a8的一致。表21如2a8fab/cynotfpik2复合物结构中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体2a8表位和抗原互补位残基(抗体轻链(lc)和重链(hc)残基使用kabat定义编号).截断(20或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.3.mab2974fab/tfpik2复合物结构将mab2974(r&d系统)fab和cynotfpik2以1：1.2的摩尔比混合以形成复合物。使用superdex200柱进行最后的纯化。将复合物浓缩成17.5mg/ml以供结构研究。在100mm柠檬酸钠ph5.6、20％异丙醇、20％peg4000中获得含有mab2974fab及tfpik2的复合物的晶体，其产生衍射达的块形晶体。将晶体瞬时低温保护并在advancedphotonsource远程执行同步加速器数据收集。使用软件autoproc(globalphasingltd)处理影像框。该复合物的数据属于空间群p212121，晶胞如下：α＝β＝γ＝90°，每一不对称单位具有三个复合物。由于mab2974fab的序列无法获得，收集单独的的高分辨率数据组，连同生物信息学分析以破译蛋白序列。使用mab2974fab的结构及可公开获得的tfpik2结构域的结构(rscbproteindatabank；pdbcodes1tfx和4dtg)进行分子置换搜索可产生令人信服的各组分的解析。使用软件autobuster进行精修，在的最终r/rfree因子分别是0.1702和0.2161，键的rmsd是角度的rmsd是1.13°。基于fabtfpik2界面处的残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)，测定该复合物的表位。下列tfpi的tfpik2结构域中的残基参与直接接触mab2974fab(根据bsa的表位)：e100、e101、p103、r107、y109、t111、n116、q118、s119、q121、e123、r124、f125。表位残基的bsa和％bsa值显示于表22中。表22如mab2974fab/cynotfpik2复合物结构中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体mab2974表位截断(20或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.残基链残基#分类bsa％bsaglutfpik2100表位25.916.8glutfpik2101表位42.254.7protfpik2103表位26.858.5argtfpik2107表位32.316.4tyrtfpik2109表位83.162.9thrtfpik2111表位13.818.9asntfpik2116表位23.971.9glntfpik2118表位107.062.7sertfpik2119表位48.487.6glntfpik2121表位51.653.3glutfpik2123表位61.679.8argtfpik2124表位56.033.2lystfpik2126表位114.891.84.tfpi-23fab/cynotfpik2复合物结构将tfpi-23fab和cynotfpik2以1：2的摩尔比混合以形成复合物。使用superdex200柱进行最后的纯化。将复合物浓缩成12.4mg/ml以供结构研究。在100mmbis-trisph6.5、20％pegmme5000中获得tfpik2+4d8fab复合物的晶体。其产生衍射达的纤维状结晶。将晶体瞬时低温保护并在advancedphotonsource远程执行同步加速器数据收集。使用软件autoproc(globalphasingltd)处理影像框。该数据属于空间群p1，晶胞如下：α＝101.83°，β＝92.27°，γ＝96.78°，每一不对称单位具有六个拷贝的复合物。使用tfpi-23fab的同源模型及可公开获得的tfpik2结构域的结构(rscbproteindatabank；pdbcodes1tfx和4dtg)进行分子置换搜索来产生各组分的令人类信服的解析。使用软件autobuster进行精修，且在的最终r/rfree因子分别是0.1961和0.2344，键的rmsd是角度的rmsd是1.22°。基于fabtfpik2界面处的残基的bsa及bsa百分比(％bsa)，测定该复合物的表位及抗原互补位。下列tfpi的k2结构域中的残基参与直接接触tfpi-23fab(根据bsa的表位)：d102、i105、c106、r107、g108、r112、y127、g129、c130、l131、g132、m134和e138。下列在4d8fab的重链中的残基包含重链抗原互补位：a33、w47、a50、i51、s52、s56、y58、l95、g96、a97、t98、s99、l100和s100a。下列4d8fab的轻链中的残基包含轻链抗原互补位：a29、y31、y91、s95a、g95b及s95c。表位和抗原互补位残基的bsa和％bsa值显示于表23中。表23如tfpi-23fab/cynotfpik2复合物结构中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体tfpi-23表位和抗原互补位残基(抗体轻链(lc)和重链(hc)残基使用kabat定义编号).截断(20或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.5.tfpi-24fab/猕猴tfpik2结构复杂将tfpi-24fab和cynotfpik2以1：2的摩尔比混合以形成复合物。使用superdex200柱进行最后的纯化。将复合物浓缩成12.2mg/ml以供结构研究。在20％peg3350、200mm硝酸铵中获得tfpik2/tfpi-24fab复合物的晶体。其产生衍射达的晶体。将晶体瞬时低温保护并在advancedphotonsource远程执行同步加速器数据收集。使用软件autoproc处理影像框。该数据属于空间群p212121，晶胞如下：中，α＝β＝γ＝90°，每一不对称单位具有一个复合物。使用tfpi-24fab的同源模型及可公开获得的tfpik2结构域的结构(rscbproteindatabank；pdbcodes1tfx和4dtg)进行分子置换搜索来产生令人信服的各组分的解析。使用软件autobuster进行精修，在的最终r/rfree因子分别是0.1900和0.2269，键的rmsd是角度的rmsd是1.18°。基于fab/tfpik2界面处的残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)，测定该复合物的表位及抗原互补位。下列tfpi的k2结构域中的残基参与直接接触tfpi-24fab(根据bsa的表位)：e100、e101、d102、g104、i105、c106、r107、g108、y109、i110、g129、c130、l131和g132。下列tfpi-24fab的重链中的残基包含重链抗原互补位：a33、q35、w47、g50、i51、s52、n53、r55、s56、i57、g58、f95、l96、h97、s99和d101。下列tfpi-24fab的轻链中的残基包含轻链抗原互补位：m31、y32、h34、y36、l46、r50、w91和y96。表位和抗原互补位残基的bsa和％bsa值显示于表24中。表24如tfpi-24fab/cynotfpik2复合物结构中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体tfpi-24表位和抗原互补位残基(抗体轻链(lc)和重链(hc)残基使用kabat定义编号).截断(或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.6.hz4f36的表位分析具有人类tfpik2结构域的复合物中的hz4f36fab的结构可从proteindatabank获得(pdb登记号4dtg)。基于hz4f36/tfpik2复合物结构中的界面残基的bsa和bsa百分比(％bsa)，所定义的表位残基显示于表25中。表25如hz4f36fab/cynotfpik2复合物结构(pdb登记号4dtg)中界面残基的隐藏的表面区域(bsa)及bsa百分比(％bsa)所定义的抗tfpi抗体hz4f36表位残基。截断(或更大的bsa,或参与静电相互作用)应用于bsa分析.7.抗tfpi抗体表位的比较表26和表27中比较表20至25中所显示的抗tfpi抗体的表位。表26显示特异于tfpik2结构域的抗体的表位。表27包括另外2个同时结合k1和k2结构域的抗体(2a8和2a8-200)。表26基于表20、22-25中数据的抗tfpi抗体表位残基x表示表位的一部分的tfpi氨基酸残基。x(粗体)表示本发明公开的抗体的新型表位残基。注意，tfpi-23不会与hz4f36、4d8或mab2974竞争结合tfpi，但确实与tfpi-24竞争结合tfpi。抗体2a8和2a8-200不包括在此表中，因为它们需要k1&k2结构域两者以用于结合且不单独结合k2结构域。表27基于表20-25的数据比较抗tfpi抗体表位残基x表示表位的一部分的tfpi氨基酸残基。x(粗体)表示本发明公开的抗体的新型表位残基。抗体2a8和2a8-200同时需要k1&k2结构域二者以用于结合且不单独结合k2或k1结构域。表28通过丙氨酸扫描使用计算的方法(accelrysdiscoverystudio4.1)预测关键tfpi表位残基用于tfpi-23根据>1kcal/mol的任意阈值，预测当3个tfpi残基(ile105、arg107及leu131)突变为丙氨酸时对tfpi-23与tfpi的结合具有显著贡献。表29a在tfpik2表位范围内的tfpi-23cdr和构架残基使用计算预测方法(accelrysdiscoverystudio4.1)，也显示被预测不会负面影响tfpi-23的稳定性或对tfpi的亲和性的各cdr/抗原互补位残基的可能的氨基酸取代(<0.5kcal/mol，第4至6列)。这些被分为三组：(1)对结合具有至少是中性的影响(<0.5kcal/mol亲和性，第4列)，(2)对结合具有中性/稳定的影响(<-0.5kcal/mol亲和性，第5列)及(3)对亲和性具有最稳定的影响的前3个预测位点。所有残基均使用kabat编号(第6列)。138glu/l93ser和131leu/l96gly由于距离略微超过(分别是和)，但足够接近(四舍五入后是)，其被包括在内作为可选择的接触残基。表29btfpi表位残基和对应的tfpi-23抗原互补位残基表29c通过bsa的tfpi表位残基和对应的tfpi-23抗原互补位残基(无最小bsa应用)实施例11.稀释凝血酶原时间(dpt)利用稀释凝血酶原时间(pt)测定来研究抗tfpi抗体抑制人类fviii缺乏的血浆(血友病a)中的内源性tfpi的能力。稀释pt是利用稀释的组织因子(innovin)延长凝血时间的修饰的pt检测。在人类fviii缺乏的血浆(georgekingbiomedical)中的dpt分析方面，将试剂在稀释缓冲剂(咪唑50mm、氯化钠0.1m、bsa1mg/ml、cacl28.34mm，ph7.4)中以1：3000稀释并预孵育至37℃。在测定前不久，将血浆在37℃水浴中解冻5分钟。在pbs中制备抗tfpi抗体的稀释液并加入血浆中，再将该血浆在室温孵育20分钟。孵育后，将50μl的血浆在37℃孵育1分钟，加入50μl的暖至37℃的以1：3000稀释的试剂后立即起始凝血反应。在37℃使用凝血分析仪进行达到凝血的时间。收集数据点，两次重复，将数据输入microsoftexcel并使用graphpad估计50％有效浓度(ec50)。结果显示于表30中。tfpi下调凝血的外源性fviia/tf/fxa途径，减少产生fxa且最终减少凝血酶。dpt测量对外源性凝血途径的影响。数据显示出在血友病a血浆中添加抗tfpi抗体会剂量依赖地缩短凝血时间。300nm的对照igg对凝血时间没有影响。表30实施例12血栓弹力图(thromboelastography)(teg)血栓弹力图(teg)是测量全血中血块形成的动力学的全面止血测定。从健康人类供体分离出全血并抽入含有3.2％柠檬酸钠的塑料血液收集管中并使引入的凝血活化剂例如组织因子最少，丢弃第一管抽出的血。以对照小鼠抗人类igg2(100μg/ml)或以抑制性fviii抗体(gm1805(greenmountain)，100μg/ml)处理该柠檬酸化的全血1小时以抑制内源性fviii，诱导血友病a样表型。将给予抗tfpi抗体或igg1对照抗体的剂量的全血(320μl)加入反应杯中，该反应杯中含有20μl的0.2m氯化钙及20μl的在20mmhepes、150mm氯化钠、ph7.4中稀释的脂化的组织因子而导致在每个反应中最终以1:200,000稀释的脂化组织因子稀释液。反应以两次重复运行，并在将全血加入teg杯时立即开始。根据制造商的指示以第i级和第ii级对照校准后利用软件在teg5000止血分析仪上进行分析(haemonetics)。在37℃进行该反应60分钟。参见表31。表31在用抗tfpi抗体处理的抗体诱导的血友病a(ha)血液中的teg参数表31显示以fviii抗体处理全血显著延长teg-r值达41.5分钟。在全血的存在下，抗tfpi106显示出相对于2a8-200和4f36的有利的谱。添加tfpi-106、2a8-200或4f36(300nm)导致teg-r值分别达17.85分钟、20.4分钟及24.05分钟。由teg-r值的下降及观察到的teg-α角度的增加显示出抗tfpi106促进血友病血液凝固。实施例13.中和tfpi及凝血酶生成利用两种显色测定，直接因子xa活性测定及基于tfpi抑制tf-fviia产生fxa的两阶段fviia/tf/fxa测定来测量通过tfpi抗体中和tfpi。在第一种测定中，将不同浓度(0至500nm)的tfpi-106、tfpi-118、hz4d8和两种参考抗体4f36或2a8-200与固定浓度的人类重组tfpik1k2和fxa预孵育以允许形成复合物。使用显色fxa底物评估fxa活性。在此测定中添加本发明的tfpi抗体引起fxa活性剂量依赖性增加(参见表32，xa抑制测定，ec50值)。在体内，两种主要形式的tfpi是tfpi-α(k1k2k3)及tfpi-β(k1k2)。在两阶段fviia/tf/fxa测定中评估tfpi抗体抑制重组tfpik1k2或tfpik1k2k3的能力。该测定测量中和tfpi抑制fxa和fviia/tf/fxa的合并效果。将递增浓度(0至500nm)的抗体与tfpi一起孵育，加入使用fxa显色底物来测量fviia/tf/fxa和fxa活性的测定中。本发明的tfpi抗体中和tfpik1k2对由fviia/tf介导的fx活化的抑制(参见，表32，fviia/tf/xaec50值)。本发明的示例性抗体也能有效抑制tfpik1k2k3(tfpi-106的用于中和tfpik1k2k3对fviia/tf/fxa的抑制的ec50是8.47nm)。该数据证明全长和截短的tfpi的抑制。血友病的临床严重性与凝血因子活性的残留水平有关。<1％的因子活性与重型表型相关，中间型血友病与2至5％的因子活性相关，而轻型与>5％至<40％的因子活性相关)。血友病的内源性凝血途径的缺陷导致凝血酶生成不足。利用凝血酶生成试验(tga)来检查对血小板贫乏的血友病血浆中的内源性tfpi的抑制作用。该tga测定测量凝血酶生成的初始阶段、活化阶段和失活阶段。利用校准的自动凝血酶(calibratedautomatedthrombin)(cat)生成测定测试tfpi抗体恢复血小板贫乏的血友病血浆中的凝血酶生成的能力。将tfpi-106、tfpi-118、hz4d8和两种参考抗体4f36或2a8-200(0至500nm)在血友病血浆中孵育以中和tfpi，再加入该测定中。与正常人类的混合(pooled)血浆相比较，人类血友病血浆中的凝血酶生成显著减少。当将正常对照fact(其经标准化为1u/mlfviii)掺入血友病a血浆中时可观察到剂量依赖性反应。类似地，加入200ng/ml(1u/ml)的b结构域缺失型fviii可恢复凝血酶生成达100nm。在60分钟的测定时程内，在血友病血浆中观察到最少的凝血酶生成。将血浆与本发明的抗体一起孵育导致峰值凝血酶、内源性凝血酶潜能和速度指数剂量依赖增加。也测定参考抗体2a8-200和4f36以供比较(表32，tga速度ec50值)。实施例14.在血友病小鼠模型中的体内效力在血友病小鼠中利用急性尾部横断测定测试某些抗tfpi抗体作为促凝血剂的效力。在该测定中，将尾巴的远端部分截断导致大量失血，若在切断前或切断后不久施用止血剂可减少失血。血友病小鼠经尾静脉接受体积为4ml/kg的抗tfpi抗体(6mg/kg)、非特异性igg对照(6mg/kg)或盐水载剂的单次静脉(iv)剂量。在给药后不同的时间，依下述评估抗体对出血的影响。通过腹膜内途径以氯胺酮/二甲苯胺噻嗪混合物将小鼠麻醉。将尾巴浸入37℃、50毫升预温热的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中2分钟。制造3mm的尾部横断并收集血液到pbs中共10分钟。利用下列技术通过测量该pbs的血红蛋白含量来定量失血体积。将试管离心以收集红细胞，重悬于5毫升的裂解缓冲剂(8.3g/l氯化铵、1.0g/l碳酸氢钾及0.037g/ledta)中并通过分光光度计测量样本在575nm的吸光度。利用标准曲线将吸光度数值转化成总失血(μl)。通过方差分析(anova)，再使用graphpadprism软件进行dunnett多重比较检验以评估各种方式之间的差异的统计显著性。结果以平均值±平均值的标准偏差(sem)表示。在下文描述的附图中，统计显著性定义为p值<0.05，并通过数据上方星号指明。图3a显示与载剂对照(盐水)相比，在尾部横断前的不同时间给予2a8-200抗体剂量对血友病a小鼠(表示为fviii-/-)在尾部横断后的失血的影响。图3b显示与载剂对照(盐水)和非特异性人类igg1(表示为higg1)相比，在尾部横断前的不同时间给予2a8抗体剂量对血友病a小鼠(表示为fviii-/-)在尾部横断后的失血的影响。图3b也显示在尾部横断前的二个不同时间给予2a8抗体剂量对正常小鼠(表示为fviii+/+)在尾部横断后的失血的影响。图3c显示与载剂对照(盐水)相比，在尾部横断前的不同时间给予抗体4d8、21、23、24剂量对血友病a小鼠在尾部横断后的失血的影响。图3d显示与载剂对照(盐水)相比，在尾部横断前的不同时间给予抗体106剂量对血友病a小鼠在尾部横断后的失血的影响。图3e显示与载剂对照(盐水)相比，在尾部横断前的不同时间给予抗体118剂量对血友病a小鼠在尾部横断后的失血的影响。图4显示与载剂对照(盐水)相比，在尾部横断前的不同时间给予抗体106剂量对血友病b小鼠在尾部横断后的失血的影响。如图3d和图4所示，在急性创伤性损伤模型中，当抗体是在尾部横断损伤前的不同时间施用时，经施用6mg/kg的抗tfpi抗体106的血友病a或血友病b小鼠失血减少。在血友病a小鼠中，该止血效果在施用后可持续至少长达189小时，虽然在施用后240小时该效果恢复成对照水平。在血友病b小鼠中，该效果在施用后可持续至少长达72小时并在施用后192小时恢复成基线水平。上述数据和结果表明该测试的抗体(包括抗体tfpi106)可预防性地施用于血友病a或血友病b的对象以在创伤性损伤或其他类型的出血事件前减少出血。也测试抗体tfpi106在血友病a小鼠中作为止血剂的效果以测定当在尾部横断后不久施用是否能减少出血。使用类似用于测试在尾部横断前施用抗体的效果的方法进行这些实验，但在尾部横断后立即通过插入颈静脉的导管输注tfpi106(6mg/kg)或重组因子viii(200单位/kg)的iv剂量，然后，收集血液10分钟以再定量失血。在第二组实验中，在夹住尾巴后分别施用血友病a小鼠不同剂量的tfpi106和因子viii(200u/kg)2分钟，然后，收集血液10分钟再定量失血。图9a显示出与载剂对照相比，尾部横断后立即施用6mg/ml的抗体tfpi106能有效减少血友病a小鼠中的失血，虽然没有达到以同样方式施用的200u/kg的因子viii所获得的相同程度。图9b显示出在尾部横断的损伤后施用抗体tfpi1062分钟可剂量反应性地减少血友病a小鼠的出血，且当在尾部横断后同时施用抗体tfpi106和重组因子viii2分钟时，在所测试的最高剂量(6mg/kg)的tfpi106约与200u/kg的重组因子viii同样有效。这些图中所描述的数据和结果表明抗体tfpi106可有效地作为已因为创伤或某些其他原因而开始出血的对象的需求性治疗(on-demandtreatment)。实施例15.药代动力学和产物代谢通过静脉(iv)和/或皮下(sc)途径给予剂量后在wistarhan大鼠、新西兰白兔和食蟹猴中表征tfpi-106的药代动力学(pk)和/或毒物动力学(tk)。在gyrolab上使用三明治免疫测定定量在柠檬酸钠化的兔子血浆中的抗tfpi。通过gyrolab仪器，在1％光电倍增管(pmt)装置读取反应单位。通过内插法从标准曲线测定样本浓度，该标准曲线使用配上1/y2反应加权的5参数逻辑曲线拟合。含有5％汇集的柠檬酸钠化兔子血浆的测定缓冲剂中的标准点范围为0.78ng/ml至891ng/ml，而在100％兔子血浆基质中的定量范围为90ng/ml至5500ng/ml。使用在含有5％汇集的柠檬酸钠化兔子血浆的测定缓冲剂中的五个抗tfpi样本(浓度为0.45、8.0、47.15、153、275ng/ml)作为定量对照。依上述，也在gyrolab上使用三明治免疫测定定量在柠檬酸钠化大鼠血浆中的抗tfpi。含有5％汇集的柠檬酸钠化大鼠血浆的测定缓冲剂中的标准点范围为0.78ng/ml至891ng/ml，而在100％大鼠血浆基质中的定量范围为90ng/ml至5500ng/ml。使用在含有5％汇集的柠檬酸钠化大鼠血浆的测定缓冲剂中的五个抗tfpi样本(浓度是0.45、8.1、47.15、153、275ng/ml)作为定量对照。使用利用mesoscalediscovery(msd)测定平台的全人类ig定量性配体结合测定定量在食蟹猴血浆中的抗tfpi抗体。以钌化的(ruthenylated)小鼠抗-人类iggfc抗体检测结合的抗tfpi抗体以在msd仪器内产生电化学发光(electrochemiluminescence)信号。通过内插法从使用5-参数逻辑等式拟合的标准曲线测定样本浓度，用于标准曲线的加权公式是1/y^2。在5％猴子血浆中的标准点范围为0.999ng/ml至1156ng/ml的抗tfpi抗体，而在100％血浆中的定量范围为64.8ng/ml至7136ng/ml。将五个在100％血浆中，浓度为64.8、117、680、3964及7136ng/ml的抗tfpi抗体样本稀释成1:20的mrd(在5％血浆中分别是3.24、5.83、34.0、198和357ng/ml)作为定量对照。与同种型对照单克隆抗体(mab)相比，tfpi-106在新西兰白兔中显示出较快的清除率(cl)。在食蟹猴中，tfpi-106在低剂量显示出非线性pk动力学，与在抗tfpi抗体所观察到的靶介导的药物分布(tmdd)相一致。参见表32。表32总结本发明的示例性抗tfpi抗体(hum4d8、tfpi-106和tfpi-108)及二个参考抗体(4f36和2a8-200)的某些药代动力学性质和药理学活性。表32示例性抗tfpi抗体的药代动力学性质和药理学活性实施例16.抗体在激光诱导的血友病小鼠损伤模型中抑制tfpi的止血作用增强体内血小板累积及纤维蛋白生成如本发明他处的陈述，组织因子途径抑制剂(tfpi)是直接结合并抑制组织因子(tf)/因子viia/因子xa复合物并调控由tf诱导的凝血起始的血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂。阻断tfpi可潜在地促进由tf/fviia启动的止血，补偿在血友病a或b中因子viii(fviii)或因子ix因子的损失。本发明的抗体以广泛的物种交叉反应性抑制tfpi。此处，使用活体显微镜(ivm)在血友病a和b小鼠中评估tfpi-106对体内血小板血栓形成及纤维蛋白沉积的止血效果。材料与方法：依先前本发明他处的描述制备tfpi-106抗体、重组因子viii及载剂(磷酸盐缓冲的盐水)。从emfretanalytica(germany)获得dylight-649抗cd42c抗体。根据制造商的说明书(lifetechnologies，carlsbad，ca)使用蛋白质标记试剂盒，以alexafluor488标记纤维蛋白抗体克隆59d8(huikyetal.(1983)science222(4628):1129-1132)。从保持在charlesriverlaboratories(wilmington，ma)的专有线获得平均体重为30至35克的雄性血友病a小鼠(f8ko)。在实验程序前使小鼠至少适应环境3天。给予雄性血友病a、血友病b或c57bl/6j野生型(wt)小鼠tfpi-106(6mg/kg)、载剂、重组人类fviii(rfviii，200iu/kg)或alexa-488标记的tfpi-106(0.7mg/kg)单次静脉剂量。使用ivm观察麻醉的小鼠的提睾肌微循环。在对提睾肌动脉的血管壁进行激光热损伤后定量血小板累积和纤维蛋白生成。使用dylight-649抗cd42c(gp1bβ)将血小板可视化并通过alexa-488抗纤维蛋白克隆59d8检测纤维蛋白。更具体地，为了准备用于活体显微镜成像的血友病a小鼠，通过腹膜内递送氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来将动物麻醉。在颈静脉插管并使用戊巴比妥钠(5mg/kg，静脉内)维持麻醉。在气管插管以保持气道通畅。然后，使提睾肌暴露以令微血管可视化。在整个成像期间将动物保持在温暖的加热垫上，并以温暖的缓冲剂浸泡暴露的提睾肌组织。通过颈部导管输注针对血小板的标记的抗体dylight649cd42c(gp1bβ)及不会与纤维蛋白原交叉反应的纤维蛋白抗体(alexafluor488anti-fibrinclone59d8)。使用聚焦的激光束(532nm)在小鼠提睾肌微血管上启动损伤。每只小鼠接受2次由激光诱导的损伤。在未经处理的小鼠中制造第一个损伤作为对照。在相同小鼠中制造第二个损伤并立即通过颈部导管静脉施用tfpi-106(6mg/kg)。从血小板累积和纤维蛋白沉积的荧光强度监测二个损伤中的血块形成。收集数据点(荧光强度)并使用slidebook软件(版本6.0)分析。绘制中位数荧光强度作为每一个凝血的时间函数并使用软件(版本编号6.03)测量对应的曲线下面积。使用软件(版本编号6.03)，利用mann-whitney检验测定统计的显著性。结果：使用alexa488标记的tfpi-106检测wt小鼠中血小板血块及内皮中的血小板聚集部位的tfpi(图5)。图5a包含六个在上方的图(编号1至6)，其显示出在施用对照igg(使用alexa488标记)的wt小鼠中，使用激光诱导损伤后0秒(图5a-1)、15秒(图5a-2)、30秒(图5a-3)、60秒(图5a-4)、90秒(图5a-5)和120秒(图5a-6)后以dylight649cd42c检测血小板。在损伤部位的血小板血栓中未检测(使用dylight649cd42c检测)到alexa488标记。图5b包含在该图形底部的六个图(编号1至6)，其显示出在wt小鼠中使用激光诱导损伤后约15秒，可在沿着内皮的血小板血栓中开始检测到alexa488标记的tfpi-106(图5b-2)，荧光强度从约30秒(图5b-3)、60秒(图5b-4)和90秒(图5b-5)逐渐增加，然后持续强度至约120秒(图5b-6)，其中该血小板使用dylight649标记的cd42c检测到。约0.5小时与载剂处理的血友病a小鼠相比，tfpi-106增强在血友病a(f8ko)小鼠中的血小板累积和纤维蛋白生成且该效果持续约168小时。更具体地，在tfpi-106处理的f8ko小鼠(血友病a)中，ivm显示出损伤部位在约0.5小时绿色荧光(alexa488抗纤维蛋白克隆59d8)和红色荧光(dylight649标记的cd42c抗gp1bβ检测血小板)增加，其持续约168小时且该荧光模式类似于在载剂处理的wt小鼠中所观察到的。然而，在载剂处理的血友病a小鼠(其中既未观察到血小板累积也未观察到纤维蛋白生成)中并未检测到这类荧光。血友病a小鼠显示出在给予tfpi-106剂量后约0.5小时血小板累积(图6a)和纤维蛋白沉积(图6b)增加，类似于通过rfviii所达到的水平(*＝p<0.005指示在每个图上)。tfpi-106处理的血友病a小鼠的止血效果持续达168小时。类似地，tfpi-106处理的血友病b小鼠同样显示出与载剂对照相比，在给药后约30分钟提高的止血，且血小板累积且纤维蛋白生成增加。接受tfpi-106和rfviii剂量的血友病小鼠无一达到在非血友病wt小鼠中所观察到的纤维蛋白沉积的最高水平。因此，该数据表明在激光伤害内皮后，tfpi可在损伤部位检测到。更重要的是，该数据证明施用给血友病小鼠tfpi-106可在激光损伤模型中导致显著且持久的止血提高。实施例17.抗tfpi抑制与fviia的组合在血友病a和btga中对凝血酶生成的影响方法：凝血酶生成试验(tga)使用凝血酶生成试验(tga)评估单独的抗tfpi抗体tfpi-106及其与重组fviia(rfviia)的组合在血友病血浆中对凝血酶生成的影响。从来自georgekingbiomedical(overlandpark，ks)和hrf(raleigh，nc)的先天不足的供体获得柠檬酸化的血小板贫乏的重型血友病a(fviii缺乏)、具有抑制剂的重型血友病a或血友病b(fix缺乏)血浆。从georgekingbiomedical获得正常的混合血浆(非血友病)。凝血酶生成试剂；ppp-试剂low(在最终反应中是4μl磷脂及1pm组织因子)；fluca缓冲剂(含有氯化钙和荧光底物)及从diagnosticastago(parsippany，nj)获得的凝血酶校准剂。使用包括fluoroskanascent荧光盘式分析仪(thrombinoscopebv，maastricht，netherlands)的校准的自动凝血酶生成图(cat)进行凝血酶生成试验。将浓度达20μg/ml的重组fviia(rfviia在20mmhepes、150mm氯化钠、1％牛血清白蛋白(bsa)、ph7.4)加入70μl的血友病a血浆中。将20μl的ppp-试剂low和10μl的抗tfpi106加入反应孔中，使最终浓度为16μg/ml。参考的校准的对照反应包括20μl的凝血酶校准剂与70μl血浆。使用载剂(磷酸盐缓冲的盐水(pbs))来测试浓度0μg/ml。将10μl载剂加入参考校准剂的孔中。在第二组反应中，将在hepes缓冲剂中的rfviia(5μl)或hepes缓冲剂(5μl)加入70μl的血友病血浆样本(血友病a、具有抑制剂的血友病a或血友病b)中，使血浆中的rfviia的最终浓度为2μg/ml。将20μlppp试剂low和5μl的抗tfpi106(在pbs中稀释)或pbs(5μl)加入经给予rfviia剂量的血友病血浆样本(75μl)及hepes缓冲剂处理的血友病血浆(75μl)中，使最终浓度为16μg/ml。此外，测定在hepes缓冲剂处理的非血友病血浆(75μl)中的抗tfpi106(16μg/ml)。该分析中包括未经处理的非血友病血浆(80μl)对照。平行运行参考校准反应(20μl凝血酶校准剂与80μl载剂剂量的血友病或非血友病血浆，或80μl未经处理的非血友病血浆)。所有反应均以两次重复运行。将样本在37℃孵育5分钟，然后通过添加20μl的fluca使总反应体积是120μl来启动反应。在fluoroskanascent荧光计上，在37℃每隔20秒读取血浆反应的荧光并与参考凝血酶校准剂反应相比较，以测定凝血酶浓度。在37℃，使用cat持续监控荧光信号的强度。结果：凝血因子fviii(血友病a)和fix(血友病b)缺乏妨碍生成足够的凝血酶来将纤维蛋白原转化为纤维蛋白以发展稳定的血块。抗tfpi-106(一种特异性结合并抑制和/或中和tfpi的抑制活性的新型单克隆抗体)靶向外源性组织因子/fviia凝血途径。接受tfpi-106的具有抑制剂的患者也可接受rfviia以治疗突破性出血。因此，在有或无rfviia的存在下，使用本领域所认可的tga(凝血酶生成试验)在体外检查tfpi-106对血友病血浆中的凝血酶生成的影响。在柠檬酸化的血小板贫乏的因子viii缺乏的人类血浆中使用凝血酶生成试验进行体外研究以研究在rfviia存在下的tfpi-106活性。在一项研究中，将固定浓度(16μg/ml)(已知此浓度的rfviia会增加血友病a血浆中的凝血酶生成)的抗tfpi106加入因子viii缺乏的人类血浆中。将最多20μg/ml的递增浓度的rfviia加入测定中。令人惊讶地，tfpi-106和rfviia的组合恢复凝血酶生成至正常血浆中所观察到的水平。以tfpi-106与范围在0.2、2和20μg/ml的rfviia(依他凝血素α，eptacogalfa)的组合观察到的峰值凝血酶水平相似。如图7中所示的数据证明tfpi-106可提高经给予rfviia剂量的重型血友病a血浆的凝血酶生成反应(图7，实心黑色、深灰色和浅灰色线)。也在非血友病血浆(其将具有充分补充的凝血因子)中测量tfpi-106(16μg/ml；图7，深灰色虚线)对凝血酶生成的影响。与tfpi-106的tfpi外源性途径抑制活性一致，添加抗tfpi106导致凝血酶生成增加，伴随时滞减少及峰值凝血酶增加。添加tfpi-106和rfviia的峰值凝血酶是在正常非血友病血浆的报告范围内。在另外的血友病a血浆(图8a；1pm组织因子及4μm磷脂)、血友病b血浆(图8c；3bu抑制剂)及具有抑制剂的血友病a血浆(图8b；3bu抑制剂)中进一步研究在有和无rfviia的存在下，tfpi-106的tfpi抑制活性对凝血酶生成的结果分别以图形显示于图8a、图8c和图8b中。将tfpi-106加入该血浆中使最终浓度为16μg/ml。在这些研究中，rfviia的最终浓度为2μg/ml。与载剂对照相比，在血友病血浆中加入2μg/mlrfviia导致凝血酶生成适度增加。与添加单独的rfviia相比，加入单独的16μg/mltfpi-106或16μg/mltfpi-106与rfviia的组合可导致凝血酶生成增加，包括较高的峰值凝血酶浓度及缩短的时滞。在以rfviia和tfpi-106共同处理后观察到凝血酶生成的最小加成效果。以单独的16μg/mltfpi-106或16μg/mltfpi-106与rfviia的组合所获得的峰值凝血酶水平与那些在非血友病血浆中所观察到者相当，且不超过在给予tfpi-106剂量的非血友病血浆中所观察到的水平。这些数据证明tfpi-106能有效地绕过在血友病a、血友病b及具有抑制剂的血友病a血浆中的凝血酶生成缺乏。实施例18.人类血友病血液和血浆中的促凝血活性本实施例描述当使用得自具有血友病a和b的人类对象的全血和血浆测试时，抗体tfpi-106与重组凝血因子viii和因子ix的止血活性的比。材料和方法。在机构审查委员会批准的方案下，得自年满18岁的志愿血友病患者全血和血浆(富含血小板及血小板贫乏的)。该对象具有中间型或重型因子viii(fviii)或因子ix因子(fix)缺乏、具有或不具有抑制性抗体，但在其他方面是健康且为非出血状态。若志愿者们在进入研究前48小时内曾使用任何因子替代疗法、具有活动性出血或具有血栓形成的医疗史或家族史则将他们排除在外。在11位志愿者中，5位是重型fviii缺乏，2位是中间型fviii缺乏，1位是中间型fix缺乏且3位是具有fviii抑制剂的重型fviii缺乏。为了完成该研究的所有目标，通过无菌静脉穿刺从每个志愿者采集46ml的血液(10管血)入含有3.2％柠檬酸钠的真空管中。测试物包括tfpi106、阴性对照组同种型匹配的抗人类igg1、重组人类因子viii及重组人类因子ix，根据实验，将其加入全血或血浆中。根据该测定，测试1、5、20、50或100nm的tfpi106、100nm的对照igg1抗体及可达到正常因子活性的5％、10％或40％的重组fviii或fix水平(基于活化部分促凝血酶原激酶(thromboplastin)时间(aptt)测定)。为了获得所需浓度，以稀释缓冲剂，ph7.4(包含20mmhepes、150mmnacl及0.5％牛血清白蛋白)稀释试验品。使用三种类型的测定来测定该试验品的促凝血剂(procoagulant)效果，包括旋转血栓弹性测定(rotem)、凝血酶生成试验(tga)及稀释凝血酶原时间(dpt)测定。rotem测量该全血样本在低剪切条件下凝血时的黏弹性性质。当凝血进行时，该样本的黏度增加，此可通过图形分析。使用rotem分析仪(pentapharmgmbh，munich，germany)，利用pentapharm软件1.0.04进行rotem以评估全血中的凝血。通过在0.300ml的柠檬酸化的全血中添加0.020ml以1:2333稀释的脂化组织因子(innovin，siemenshealthcare)(使最终反应以1:42000稀释)及添加0.020mlcacl2来启动凝血。所有反应均以两次重复运行。监测rotem参数并分析rotem凝血时间(ct)。将通过设备软件收集的数据输出到microsoftexcel2010和/或graphpadprism(第6版)以供分析。对于每位志愿者，根据来自相同志愿者的未经处理的样本，计算该经处理的样本的rotem凝血时间的变化百分比。使用凝血酶生成试验(tga)，在富含血小板的血浆(prp)和血小板贫乏的血浆(ppp)中评估凝血酶生成的动力学，该富含血小板的血浆(prp)和血小板贫乏的血浆(ppp)是根据hemker,etal.,calibratedautomatedthrombingenerationmeasurementinclottingplasma.pathophysiololhaemostthromb,33:4-15(2003)的方法从志愿者的血液制备。简单地说，将给予试验品的剂量的全血样本在室温以150xg离心10分钟以获得prp，或在室温以2500xg离心15分钟以获得ppp。将未使用的血浆冷冻并储存在-80℃。在prp血浆中，以自体ppp将血小板计数调整成每微升含150,000个血小板。立即在新鲜prp中测量凝血酶生成。对于prp样本，在96孔微量滴定板的孔中添加20μl的1pm组织因子(prp试剂，diagnosticastago，inc.，parsippany，nj)及80μl的prp，三次重复。通过加入20μl的fluca缓冲剂(最终浓度16.7mmol/l的cacl2及417mmol/l的z-gly-gly-arg-amc荧光凝血酶底物)来启动凝血酶生成。使用fluoroskanascent荧光仪检测荧光强度。对于ppp样本，使用ppp试剂-low(最终浓度是1pm的组织因子及4微摩尔的促凝血磷脂)代替prp-试剂并按照prp样本的描述运行。使用thrombinoscope软件版本5.0.0.742(thrombinoscopebv，maastricht，thenetherlands)计算凝血酶生成。将从thrombinoscope软件获得的数据输出到microsoftexcel2010和/或graphpadprism(第6版)以供分析。在各志愿者方面，根据来自同一志愿者的未经处理的样本，计算经处理的样本的tga峰值凝血酶浓度的百分比变化。在start4凝血分析仪(diagnosticastago，parsipanny，nj)上进行稀释凝血酶原时间(dpt)分析。将冷冻的ppp解冻并给予浓度为1、5、20和100nm的抗tfpi106剂量或浓度为100nm的同种型对照抗体浓度。在dpt测定分析前将经给予剂量的血浆在37℃孵育30分钟。将50微升的血浆加入start4比色皿中并在37℃孵育60秒。通过加入在稀释缓冲剂(50mm咪唑、0.1m氯化钠、1mg/ml牛血清白蛋白及8.34mmcacl2，ph7.4)中制备的以1:6000稀释的组织因子试剂(innovin)来活化反应物并在37℃预孵育。在37℃测量达到凝血的时间，以两次重复运行反应。将凝血时间输出到microsoftexcel2010或graphpadprism(第6版)以进行分析。根据各志愿者的未经处理的样本的dpt凝血时间，计算经测试品处理的样本的dpt凝血时间的变化百分比。如图中所描述的，如使用rotem方法所测量的，抗体tfpi-106造成得自具有血友病a或b的志愿者的全血的凝血呈剂量依赖增加。具体地说，与阴性对照相比，该抗体缩短凝血时间并增加最大血块硬度。此外，与阴性对照组相比当添加在得自血友病患者的富含血小板和血小板贫乏的血浆中，tfpi-0106导致凝血酶生成呈剂量依赖增加，此可由时滞减少及生成的峰值凝血酶浓度增加证明。图10a和10b说明tfpi-106在得自重型血友病a的志愿者的全血和血浆中的促凝血效果。图10a显示出与阴性对照igg和足以获得5％、10％和40％的正常活性的重组fviii浓度相比，两种浓度的tfpi106在rotem测定中对血液凝固的影响。图10b显示出与阴性对照和fviii相比，三种浓度的tfpi-106在富含血小板的血浆中的峰值凝血酶生成。该测定显示出由tfpi106所导致的剂量依赖性凝血时间减少及峰值凝血酶生成增加的效果。图11a、11b及11c说明tfpi-106在来自具有重型血友病a及针对fviii的抑制性抗体(抑制剂)的志愿者的全血和血浆中的促凝血效果。图11a显示出与阴性对照igg相比，两种浓度的tfpi-106在rotem测定中对血液凝固的效果。图11b显示出与阴性对照igg相比，三种浓度的tfpi-106在富含血小板的血浆中的峰值凝血酶生成。图11c显示出与阴性对照igg相比，四种浓度的tfpi-106在稀释pt测定中对血小板贫乏血浆的血块形成的影响。该测定显示出由tfpi106所导致的剂量依赖性凝血时间减少及峰值凝血酶生成增加的效果。图12a、12b及12c说明tfpi-106在来自具有中间型血友病a的志愿者的全血和血浆中的促凝血效果。图12a显示出与阴性对照igg及足以获得5％、10％和40％的正常活性的重组fviii浓度相比，两种浓度的tfpi106在rotem测定中对血液凝固的影响。图12b显示出与阴性对照和fviii相比，三种浓度的tfpi-106在富含血小板的血浆中的峰值凝血酶生成。图12c显示出与阴性对照igg相比，四种浓度的tfpi-106在稀释pt测定中对血小板贫乏血浆形成血块的影响。该测定显示由tfpi106所导致的剂量依赖性凝血时间减少及峰值凝血酶生成增加的效果。图13a、13b及13c说明tfpi-106在来自具有中间型血友病b的志愿者的全血和血浆中的促凝血效果。图13a显示出与阴性对照igg及足以获得5％、10％和40％的正常活性的重组fviii浓度相比，两种浓度的tfpi106在rotem测定中对血液凝固的效果。图13b显示出与阴性对照和fix相比，三种浓度的tfpi-106对富含血小板的血浆中的峰值凝血酶生成的效果。图13c显示出与阴性对照igg相比，四种浓度的tfpi-106在稀释pt测定中对血小板贫乏血浆形成血块的影响。该测定显示由tfpi106所导致的剂量依赖性凝血时间减少及峰值凝血酶生成增加的效果。图14a、14b及14c说明tfpi-106在来自具有中间型血友病a的志愿者的全血和血浆中的促凝血效果。图14a显示出与阴性对照igg及足以获得5％、10％和40％的正常活性的重组fviii浓度相比，三种浓度的tfpi106在rotem测定中对血液凝固的效果。每个数据点代表相对于来自相同志愿者的未经处理的血液样本的凝固时间，以tfpi-106或fviii处理的单一志愿者的血液样本的凝血时间的减少百分比。代表每一处理的数据点的间的最宽水平棒代表所有测试的志愿者样本的凝血时间的平均减少百分比。图14b显示出与fviii相比，三种浓度的tfpi-106对富含血小板的血浆中的峰值凝血酶生成的效果。每个数据点代表相对于来自相同志愿者的未经处理的血液样本的峰值凝血酶生成，以tfpi-106或fviii处理的单一志愿者的血浆样本的峰值凝血酶生成的增加百分比。代表每一处理的数据点的间的最宽水平棒代表所有测试的志愿者样本的峰值凝血酶生成的增加百分比。图14c显示出四种浓度的tfpi-106在稀释pt测定中对从血小板贫乏血浆形成血块的效果。每个数据点代表相对于来自相同志愿者的未经处理的血液样本的凝固时间，以tfpi-106处理的单一志愿者的血浆样本的凝血时间的减少百分比。每一处理的数据点的间的最宽水平棒代表所有测试的志愿者样本的凝血时间的平均减少百分比。该稀释pt测定显示出由tfpi106所导致的剂量依赖性凝血时间减少且该凝血酶生成试验显示出由tfpi106所导致的剂量依赖性峰值凝血酶生成增加。表33序列抗体seqid(序列识别)编号的描述和序列组成(当指特定残基时，使用kabat编号。通过使用kabat定义来定义vh和vlcdr开始点和结束点)上文的个别章节中所提及的本发明的各种特征和实施方案如做适当变动，根据合适情况也适用于其他章节。因此，在一个章节中具体说明的特征可与其他章节中具体说明的特征根据合适情况组合。本文所引用的所有参考数据，包括专利、专利申请、论文、教科书和列举的序列登记号，及其中引用的参考文献的全文以引用方式并入本文。当一或多个该并入的文献及类似材料与本申请不同或互相矛盾时(包括，但不限于定义的术语、术语用途、所描述的技术，等)，以本申请为准。序列表<110>辉瑞公司<120>组织因子途径抑制剂抗体及其用途<130>pc72096a<150>us62/207,229<151>2015-08-19<150>us62/360,205<151>2016-07-08<160>178<170>patentinversion3.5<210>1<211>149<212>prt<213>homosapiens<400>1aspserglugluaspglugluhisthrileilethraspthrgluleu151015proproleulysleumethisserphecysalaphelysalaaspas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