本申请要求2016年1月8日提交的美国临时专利申请号62/276465的优先权，其所有内容通过引用而全部结合于此。本公开内容主要涉及用于标记基因组dna和rna的杂交缓冲液。更具体地，本公开内容涉及可与利用荧光原位杂交("fish")和印迹杂交方法使dna或rna序列杂交的生物学探针和合成探针结合使用的杂交缓冲液组合物。
背景技术：
杂交是单链的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)分子退火至互补dna或rna的现象。虽然双链的dna序列通常在生理条件下稳定，但是在实验室中改变这些条件(通常通过升高周围温度)将导致分子分开成为单链。这些链彼此互补，但是也可与其周围存在的其他序列互补。降低周围温度使得单链的分子能够彼此退火或“杂交”。杂交可用于包括dna印迹和rna印迹在内的多种分子生物学技术和大部分dna测序方法。总体上，可通过使两个物种的dna区段杂交(dna-dna杂交)来确定其遗传相关性。由于密切相关的生物体之间的序列相似性，当与关系更远的生物体相比时，需要较高的温度使这种dna杂合体解链。多种不同的方法使用杂交以精确定位dna样品源，所述方法包括聚合酶链式反应(pcr)。在另一种技术中，使短的dna序列与细胞mrna杂交以鉴定表达的基因。研究人员也在探索使用反义rna与非所需的mrna结合，防止核糖体将该mrna翻译成蛋白。荧光原位杂交(fish)是使用仅与那些具有高度序列互补性的染色体部分结合的荧光探针的技术。其用于检测和定位染色体上特定dna序列的存在与否。荧光显微术可用于找出荧光探针与染色体结合的位置。fish常常用于寻找dna中的特定特征以用于遗传咨询、医学和物种鉴定。fish还可用于检测和定位细胞、循环的肿瘤细胞和组织样品中的特定rna靶标(mrna、lncrna和mirna)。在该背景下，其可助于定义细胞和组织中基因表达的空间-时间模式。为了有效率地且有效果地实施技术例如fish，期望稳健的实验条件以提供可再现的和可靠的结果。因此，存在对用以实施这些实验的可靠的反应介质和条件的需要。概述在一个方面，公开了一种杂交缓冲液组合物，包含加速剂、缓冲剂、溶剂和硫氰酸胍。在另一方面，公开了一种杂交组合物，包含：包含加速剂、缓冲剂、溶剂和硫氰酸胍的杂交缓冲液组合物，和至少一种核酸序列。还公开了制备和使用所述杂交缓冲液和杂交组合物的方法。详述本公开内容涉及杂交缓冲液组合物、制备该组合物的方法和使用该组合物的方法。所公开的杂交缓冲液组合物包括至少一种加速剂、至少一种缓冲剂、至少一种溶剂和硫氰酸胍。杂交缓冲液组合物也可包括聚丙烯酸盐。杂交缓冲液组合物可与一种或多种核酸序列混合以形成杂交组合物。混合杂交缓冲液组合物的组分得到可用作杂交试剂的缓冲液组合物。缓冲液组合物在需要标记基因组dna和rna的测定中可以是有用的。缓冲液可与利用荧光原位杂交("fish")和印迹杂交方法使dna或rna序列杂交的生物学探针和合成探针结合使用。混合缓冲液组合物的具体组分(例如加速剂、缓冲剂、溶剂和硫氰酸胍)提供一种组合物，其是出乎意料地优异的缓冲液组合物。例如，与既有缓冲液组合物相比，使用较高浓度的加速剂例如硫酸葡聚糖可促进fish测定在更短时间段内完成。使用硫氰酸胍也可用于降低探针与非预期靶标杂交的发生，由此改善测定读出的特异性和背景信号。1.定义除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本文件为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献通过引用以其全部结合。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可”、“含有”及其变体旨在是开放式转折短语、术语或单词，其不排除另外的动作或结构的可能性。单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指涉物，除非上下文明确另外指明。本公开内容还涵盖“包含”本文提供的实施方案或要素、“由之组成”和“基本上由之组成”的其他实施方案，无论是否具体示出。“核酸”、“核酸链”和“核酸序列”意指使用碱基配对结合或杂交的任意物，包括具有由天然存在的核苷酸形成的骨架的寡聚物或聚合物和/或包含非标准核碱基和/或非标准骨架的核酸类似物(例如，肽核酸(pna)或锁核酸(lockednucleicacid,lna))或核酸的任何衍生形式。如本文所用，术语“肽核酸”或“pna”意指合成聚合物，其具有带侧垂核碱基(天然存在的和修饰的)的聚酰胺骨架。pna上的侧垂核碱基例如嘌呤或嘧啶碱基可经接头连接至骨架。在一个实施方案中，pna具有n-(2-氨基乙基)-甘氨酸)骨架。可合成pna并任选进行标记。pna紧密地以高序列特异性与dna和rna杂交，因为pna骨架不带电荷。因此，短的pna探针可表现出与较长的dna或rna探针相当的特异性。pna探针也可在与互补dna或rna结合中显示更大的特异性。如本文所用，术语“锁核酸”或“lna”意指包含至少一个或多个lna亚单位的寡聚物或聚合物。如本文所用，术语“lna亚单位”意指含有连接核糖的2′-氧与4′-碳的亚甲基桥的核糖核苷酸。核酸和核酸类似物的实例还包括核苷酸单体的聚合物，包括双链的和单链的脱氧核糖核苷酸(dna)、核糖核苷酸(rna)、其α-异头物形式、其合成和天然类似物等。核酸链可完全由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸(pna)、锁核酸(lna)、其合成或天然类似物或其混合物构成。本文定义的dna、rna或其他核酸可用于本公开内容的方法和组合物。关于本文数值范围的记载，明确地预期其间的具有相同精确程度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还预期数字7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地预期数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。2.组合物a.杂交缓冲液组合物所公开的杂交缓冲液组合物包括至少一种加速剂、至少一种缓冲剂、至少一种溶剂和硫氰酸胍。杂交缓冲液组合物可进一步包括聚丙烯酸盐。这种组分的组合提供可用作杂交试剂的缓冲液组合物。缓冲液组合物在需要标记基因组dna和rna的测定中可以是有用的。缓冲液组合物可与利用荧光原位杂交("fish")和印迹杂交方法使dna或rna序列杂交的生物学探针和合成探针结合使用。缓冲液组合物可促进荧光标记的分子探针的杂交比既有方法更快地发生。例如，与既有缓冲液组合物相比，使用较高浓度的加速剂例如硫酸葡聚糖可促进fish测定在较短的时间段内完成。使用硫氰酸胍也可用于降低探针与非预期靶标杂交的发生，由此改善测定读出的特异性和背景信号。杂交缓冲液组合物可具有约3.0至约9.0、约3.0至约8.5、约3.5至约8.5、约3.5至约8.0、约4.0至约8.0、约4.5至约8.0、约5.0至约8.0、约5.5至约8.0、约6.0至约8.0、约6.0至约7.5、约6.5至约7.5或约7.0至约7.5的ph。杂交缓冲液组合物可具有约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.5或约9.0的ph。1.加速剂缓冲液组合物包括至少一种加速剂。加速剂能够加速核酸的杂交速率。加速剂可为聚合物，例如蔗聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、肝素或硫酸葡聚糖。加速剂可为蛋白，例如牛血清白蛋白(bsa)。加速剂可为二醇，例如乙二醇、甘油、1,3-丙二醇、丙二醇或二乙二醇。加速剂可为有机溶剂，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺或二甲亚砜。加速剂可为本文所列的加速剂的任何组合，例如登哈特溶液。在某些实施方案中，加速剂是硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖是硫酸化葡萄糖的阴离子型聚合物，能够加速核酸的杂交速率。硫酸葡聚糖的聚阴离子特征有助于接近核酸链，增加其相对于彼此的有效浓度并促进杂交。硫酸葡聚糖还证实与蛋白的螯合作用(sequesteringinteraction)，这可能是通过产生不溶性复合物的在硫酸基团和蛋白的胺基之间的氢键合作用。聚合物从血浆溶液沉淀血纤蛋白原和低密度脂蛋白的能力已被用于分析和用于抗凝剂应用。与既有缓冲液组合物相比，使用较高的硫酸葡聚糖浓度可促进fish测定在较短时间段内完成。杂交缓冲液组合物可包含约10%(w/v)至约40%(w/v)、约10%(w/v)至约30%(w/v)、约20%(w/v)至约30%(w/v)、约24%(w/v)至约32%(w/v)、约24%(w/v)至约29%(w/v)或约28%(w/v)至约30%(w/v)的加速剂。杂交缓冲液组合物可包含以重量计约10%(w/v)、约15%(w/v)、约20%(w/v)、约21%(w/v)、约22%(w/v)、约23%(w/v)、约24%(w/v)、约25%(w/v)、约26%(w/v)、约27%(w/v)、约28%(w/v)、约29%(w/v)、约30%(w/v)、约31%(w/v)、约32%(w/v)、约33%(w/v)、约34%(w/v)、约35%(w/v)或约40%(w/v)的加速剂。2.缓冲剂杂交缓冲液组合物包括至少一种缓冲剂。缓冲剂是弱酸或弱碱，用于在添加另一种酸或碱之后维持溶液的酸度(ph)接近所选的值。也就是说，缓冲剂的功能是防止在将酸或碱添加到溶液中时ph的快速变化。所公开的杂交缓冲液的缓冲剂能够将缓冲液组合物的ph维持于或接近生理ph。缓冲剂可为盐水柠檬酸钠(salinesodiumcitrate,ssc)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、sspe、哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸)(pipes)、四甲基氯化铵(tmac)、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、set(蔗糖/edta/tris)、柠檬酸、磷酸钾或焦磷酸钠。在某些实施方案中，缓冲剂是盐水柠檬酸钠(ssc)，一种在某些杂交程序中的标准试剂。ssc可用于在杂交后控制洗涤步骤的洗涤缓冲液的严格性。该缓冲剂混合有柠檬酸钠和氯化钠，允许其将杂交缓冲液组合物的ph维持在特定ph，包括在或接近生理ph。在某些实施方案中，ssc包含ph7.0的3mnacl和0.3m柠檬酸钠的混合物，被称为20xssc。可稀释20xssc以提供较低浓度的nacl和柠檬酸钠的混合物。例如，2xssc是20xssc稀释了10倍的溶液，产生具有0.3m(300mm)nacl和0.03m(30mm)柠檬酸钠的溶液。同样地，0.5xssc是20xssc稀释了40倍的溶液，产生具有0.075m(75mm)nacl和0.0075m(7.5mm)柠檬酸钠的溶液。类似地，0.625xssc是20xssc稀释了32倍的溶液，产生包含0.094m(94mm)nacl和0.0094m(9.4mm)柠檬酸钠的溶液。杂交缓冲液组合物可包含约5mm至约100mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm或约5mm至约10mm的缓冲剂。杂交缓冲液组合物可包含约5mm、约6mm、约7mm、约7.5mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约75mm、约80mm、约90mm或约100mm的缓冲剂。在某些实施方案中，对于缓冲剂所记载的浓度是指缓冲液中柠檬酸钠的浓度。当使用ssc时，nacl也以10倍于柠檬酸钠浓度的浓度存在。杂交缓冲液组合物可包含约5mm至约100mm、约5mm至约50mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm或约5mm至约10mm的柠檬酸钠。杂交缓冲液组合物可包含约5mm、约6mm、约7mm、约7.5mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm或约100mm的柠檬酸钠。杂交缓冲液组合物可包含约50mm至约500mm、约50mm至约100mm、约50mm至约90mm、约50mm至约80mm、约60mm至约80mm、约60mm至约75mm或约70mm至约80mm的氯化钠。杂交缓冲液组合物可包含约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约100mm、约200mm、约300mm、约400mm或约500mm的氯化钠。3.溶剂缓冲液组合物包括至少一种溶剂。选择溶剂，使得其优选溶解组合物的所有其他组分，由此形成均质溶液。在某些实施方案中，溶剂是极性非质子溶剂。通常，极性非质子溶剂是不具有在生理ph下容易互换的氢，且在18-25℃的温度下具有至少5的介电常数的溶剂，如crchandbookofchemistryandphysics,第95版中定义的。溶剂可为甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或乙腈或其组合。在某些实施方案中，溶剂是甲酰胺。甲酰胺可用于杂交缓冲液组合物，因为其可降低原位杂交中核酸链的解链温度和退火温度。甲酰胺的一种有用的性质是由于较低的温育温度而更好地保留形态。杂交缓冲液组合物可包含以体积计约10%至约50%、约20%至约50%、约30%至约40%、约35%至约45%或约38%至约42%的溶剂。杂交缓冲液组合物可包含以体积计约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约33%、约35%、约40%、约45%或约50%的溶剂，或由任意两个前述值定义的范围。在一些实施方案中，杂交缓冲液(例如甲酰胺)可包含约35%至约40%体积的溶剂(例如约35.5%、约36.5%、约37.5%、约38.5%或约39.5%)。4.硫氰酸胍缓冲液组合物包括硫氰酸胍。包括硫氰酸胍有助于降低探针与非预期靶标(非特异性信号或背景信号)杂交的发生。杂交缓冲液组合物可包含约0.3m至约2.0m、约0.4m至约2.0m、约0.4m至约1.6m或约1.0m至约1.6m的硫氰酸胍。杂交缓冲液组合物可包含约0.3m、约0.4m、约0.5m、约0.6m、约0.7m、约0.8m、约0.9m、约1.0m、约1.1m、约1.2m、约1.3m、约1.4m、约1.5m、约1.6m、约1.7m、约1.8m、约1.9m或约2.0m的硫氰酸胍。在其他实施方案中，杂交缓冲液组合物可包含以体积计约10%至约50%、约20%至约50%或约30%至约40%的溶剂。例如，杂交缓冲液组合物可包含以体积计约10%至约20%(例如，约11%、约11.5%、约11.8%、约12%、约12.5%、约12.8%、约13%、约13.5%、约13.8%、约14%、约14.5%、约14.8%、约15%、约15.5%、约15.8%、约16%、约16.5%、约16.8%、约17%、约17.5%、约17.8%、约18%、约18.5%、约18.8%、约19%、约19.5%或约19.8%)的溶剂。5.聚丙烯酸盐缓冲液组合物可包括聚丙烯酸盐。聚丙烯酸盐可作为体积排阻剂(volumeexcluder)起作用。聚丙烯酸盐可为聚丙烯酸钠，一种具有化学式[-ch2-ch(co2na)-]n的聚丙烯酸钠盐。重复单元的数量n可为使得聚丙烯酸钠的平均分子量在约1500g/mol和约10000g/mol之间。聚丙烯酸钠的平均分子量可为约1500g/mol至约6000g/mol、约2000g/mol至约6000g/mol、约2100g/mol至约5100g/mol、约1500g/mol至约2500g/mol或约4500g/mol至约5500g/mol。聚丙烯酸钠的平均分子量可为约1500g/mol、约2000g/mol、约2100g/mol、约2500g/mol、约3000g/mol、约3500g/mol、约4000g/mol、约4500g/mol、约5000g/mol、约5100g/mol、约5500g/mol、约6000g/mol、约7000g/mol、约8000g/mol、约9000g/mol或约10000g/mol。杂交缓冲液组合物可包含约5%(w/v)至约20%(w/v)、约5%(w/v)至约15%(w/v)或约8%(w/v)至约12%(w/v)的聚丙烯酸盐。杂交缓冲液组合物可包含以重量计约5%(w/v)、约6%(w/v)、约7%(w/v)、约8%(w/v)、约9%(w/v)、约10%(w/v)、约11%(w/v)、约12%(w/v)、约13%(w/v)、约14%(w/v)、约15%(w/v)、约16%(w/v)、约17%(w/v)、约18%(w/v)、约19%(w/v)或约20%(w/v)的聚丙烯酸盐。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约28.8%(w/v)硫酸葡聚糖、约6mm柠檬酸钠、约60mm氯化钠、约40%(v/v)甲酰胺和约1.6m硫氰酸胍。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约32%(w/v)硫酸葡聚糖、约6mm柠檬酸钠、约60mm氯化钠、约40%(v/v)甲酰胺和约1.6m硫氰酸胍。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约24%(w/v)硫酸葡聚糖、约7.5mm柠檬酸钠、约75mm氯化钠、约33%(v/v)甲酰胺和约1.0m硫氰酸胍。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约28%(w/v)硫酸葡聚糖、约7.5mm柠檬酸钠、约75mm氯化钠、约30%(v/v)甲酰胺和约1.0m硫氰酸胍。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约18%(w/v)硫酸葡聚糖、约15mm柠檬酸钠、约150mm氯化钠、约33%(v/v)甲酰胺、约1.0m硫氰酸胍和约10%(w/v)聚丙烯酸钠。在某些实施方案中，杂交缓冲液组合物包含约35%(w/v)硫酸葡聚糖、约9.4mm柠檬酸钠、约94mm氯化钠、约37.5%(v/v)甲酰胺和约1.253m硫氰酸胍。b.杂交组合物所公开的杂交组合物包括杂交缓冲液组合物和至少一种核酸序列。杂交组合物在需要标记基因组dna和rna的测定中可以是有用的。杂交组合物可包含与利用荧光原位杂交("fish")和印迹杂交方法使dna或rna序列杂交的生物学探针和/或合成探针。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含加速剂、缓冲剂、溶剂、硫氰酸胍、任选的聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；和至少一种核酸序列。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含加速剂、缓冲剂、溶剂、硫氰酸胍和任选的聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；第一核酸序列；和第二核酸序列。在某些实施方案中，第一核酸序列是分子探针。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含约10%(w/v)至约30%(w/v)加速剂、约5mm至约40mm缓冲剂、约20%(v/v)至约40%(v/v)溶剂、约0.4m至约1.6m硫氰酸胍和任选的约5%(w/v)至约20%(w/v)聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；和至少一种核酸序列。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含约10%(w/v)至约30%(w/v)加速剂、约5mm至约40mm缓冲剂、约20%(v/v)至约40%(v/v)溶剂、约0.4m至约1.6m硫氰酸胍和任选的约5%(w/v)至约20%(w/v)聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；第一核酸序列；和第二核酸序列。在某些实施方案中，第一核酸序列是分子探针。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含约10%(w/v)至约30%(w/v)加速剂、约5mm至约40mm缓冲剂、约20%(v/v)至约40%(v/v)溶剂、约0.4m至约1.6m硫氰酸胍和任选的约5%(w/v)至约20%(w/v)聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；和至少3种核酸序列。在某些实施方案中，至少2种核酸序列是分子探针。在某些实施方案中，杂交组合物包含：包含约10%(w/v)至约40%(w/v)加速剂、约5mm至约100mm缓冲剂、约20%(v/v)至约40%(v/v)溶剂、约0.4m至约1.6m硫氰酸胍和任选的约5%(w/v)至约20%(w/v)聚丙烯酸盐的杂交缓冲液组合物；和至少一种核酸序列(例如，1、2或3种核酸序列)。在杂交组合物包含三种核酸序列的实施方案中，至少两种核酸序列是分子探针。在某些实施方案中，杂交组合物包含：1µl至200µl、1µl至100µl、1µl至50µl、1µl至40µl、1µl至30µl、1µl至20µl、1µl至15µl、1µl至12µl或1µl至10µl的杂交缓冲液组合物，和0.1µl至50µl、0.1µl至25µl、0.1µl至20µl、0.1µl至15µl、0.1µl至10µl、0.1µl至5µl、0.1µl至4µl或0.1µl至3µl的具有至少一种核酸序列的溶液。在某些实施方案中，杂交组合物包含：1µl、2µl、3µl、4µl、5µl、6µl、7µl、8µl、9µl、10µl、11µl、12µl、13µl、14µl、15µl、16µl、17µl、18µl、19µl、20µl、21µl、22µl、23µl、24µl、25µl、26µl、27µl、28µl、29µl、30µl、31µl、32µl、33µl、34µl、35µl、36µl、37µl、38µl、39µl、40µl、41µl、42µl、43µl、44µl、45µl、46µl、47µl、48µl、49µl、50µl、51µl、52µl、53µl、54µl、55µl、56µl、57µl、58µl、59µl、60µl、61µl、62µl、63µl、64µl、65µl、66µl、67µl、68µl、69µl、70µl、71µl、72µl、73µl、74µl、75µl、76µl、77µl、78µl、79µl、80µl、81µl、82µl、83µl、84µl、85µl、86µl、87µl、88µl、89µl、90µl、91µl、92µl、93µl、94µl、95µl、96µl、97µl、98µl、99µl、100µl、110µl、120µl、130µl、140µl、150µl、160µl、170µl、180µl、190µl或200µl的杂交缓冲液组合物，和0.1µl、0.2µl、0.3µl、0.4µl、0.5µl、0.6µl、0.7µl、0.8µl、0.9µl、1µl、2µl、3µl、4µl、5µl、6µl、7µl、8µl、9µl、10µl、11µl、12µl、13µl、14µl、15µl、16µl、17µl、18µl、19µl、20µl、21µl、22µl、23µl、24µl、25µl、30µl、35µl、40µl、45µl或50µl的具有至少一种核酸序列的溶液。c.使用组合物的方法本公开内容的方法和组合物可完全地或部分地用于细胞学、组织学或分子生物学领域中所有类型的杂交应用。在某些实施方案中，本公开内容的方法中的第一或第二核酸序列存在于生物样品中。这样的样品的实例包括组织样品、细胞制备物、细胞片段制备物、细胞核和分离的或富集的细胞组分制备物。样品可源于：各种组织，例如乳腺、肺、结直肠、前列腺、肺、头颈、胃、胰腺、食管、肝和膀胱，或其他相关组织及其赘生物，任何细胞悬液、血液样品、骨髓、外周血单核细胞、骨髓单核细胞、血浆细胞富集的样本、细针抽吸、腹水液、痰、腹膜洗液、肺洗液、尿、粪便、细胞刮擦物、细胞涂片、细胞离心涂片器细胞或cytoprep细胞。可使用标准方案分离和处理样品。组织样品和细胞样品可使用常规方法获得，例如手术切除、活组织检查、细针抽吸、刷洗、洗涤、起泡作用、涂片、组织的触摸制备物、骨髓抽吸、采血、羊膜采样和类似方法。取决于获得样品的目的和取决于在位点的惯例，分离的样品可以多种方式处理。通常样品用各种试剂处理，以保存组织用于之后的样品分析，备选地可直接分析样品。用于保存样品的广泛使用的方法的实例是甲醇:乙酸固定或福尔马林固定之后石蜡包埋和冷冻保存。对于中期铺展(spread)，细胞培养物通常用秋水仙酰胺或另一种合适的纺锤极破坏剂处理，以在中期停止细胞周期。然后固定细胞，并点到显微镜载玻片上，用甲醛处理，洗涤且在乙醇中脱水。然后添加探针，并通过以下讨论的任何技术分析样品。细胞学包括检查来自生物样品的单个细胞、细胞核和/或染色体铺展。样品的细胞学检查开始于获得细胞的样本，其可典型地如下完成：通过刮擦、擦拭或刷洗某区域，如在宫颈样本的情况下；或通过收集体液，例如获自胸腔、膀胱或脊柱的那些；或通过细针抽吸或细针活组织检查，如在内部肿瘤的情况下。在常规手工细胞学制备中，将样品转移到液体助悬材料中，然后将流体中的细胞直接或通过基于离心的处理步骤转移到玻璃显微镜载玻片上用于观察。在典型的自动化细胞学制备中，将过滤器组件置于液体悬浮液中，过滤器组件分散细胞并将细胞捕获到过滤器上。然后除去过滤器，并将其置于与显微镜载坡片接触。然后将细胞/细胞核固定于显微镜载坡片上，之后通过下文讨论的任何技术分析。在使用细胞学样品的传统杂交实验中，将含有样本的载坡片浸没于甲醇:乙酸或甲醛缓冲液中，洗涤，然后在乙醇中脱水。然后添加探针，并用盖玻片盖住样本。将载玻片在足以使样本中的任何核酸变性的温度下温育(例如，于82℃温育5分钟)，然后在足以允许杂交的温度下温育(例如，于37℃温育过夜)。在杂交之后，除去盖玻片，并使样本经受高严格性洗涤(例如，于65℃洗涤10分钟)，之后是连续低严格性洗涤(例如，于室温洗涤2×3分钟)。然后将样品脱水，并固定用于分析。组织学包括检查薄组织切片中的细胞/细胞核。为了制备用于组织学检查的组织样品，将组织块固定在合适的固定剂(典型地为醛，例如甲醛或戊醛)中，然后包埋于熔化的石蜡蜡中。然后在切片机上切割含有组织样品的蜡块，以产生含有组织的薄石蜡切片，典型地为2至10微米厚。然后将样本切片叠置于显微镜载坡片，空气干燥，并加热以引起样本粘附于玻璃载玻片上。然后将残余石蜡用合适的溶剂溶解，所述溶剂典型地为二甲苯、甲苯等。然后将这些所谓的脱石蜡化溶剂用洗涤-脱水型试剂除去，之后通过以下讨论的任何技术分析样品。备选地，可从冷冻样本制备切片，在10%福尔马林或其他合适的固定剂中简单固定，然后用脱水试剂浸渍，之后分析样品。在使用组织学样品的传统杂交实验中，将福尔马林固定的石蜡包埋的组织样本切割成2-6μm的切片，并收集在载玻片上。将石蜡熔化(例如，于60℃熔化30-60分钟)，然后通过用二甲苯(或二甲苯替代物)洗涤例如2×5分钟而除去(脱石蜡化)。使样品重新水化，洗涤，然后预处理(例如，于95-100℃预处理10分钟)。洗涤载玻片，然后用胃蛋白酶或另一种合适的透化剂(permeabilizer)处理，例如于37℃处理3-15分钟。洗涤载玻片(例如，2×3分钟)，脱水，并施用探针。用盖玻片盖住样本，并在足以使样本中的任何核酸变性的温度下温育载玻片(例如于82℃温育5分钟)，之后在足以允许杂交的温度下温育(例如，于37℃温育过夜)。在杂交之后，除去盖玻片，并使样本经受高严格性洗涤(例如，于65℃洗涤10分钟)，之后是连续的低严格性洗涤(例如，于室温洗涤2×3分钟)。然后使样品脱水，并固定用于分析。1.杂交技术本公开内容的组合物和方法可完全地或部分地用于细胞学样品和组织学样品的领域中已知的所有类型的rna杂交技术。这样的技术包括例如原位杂交(ish)、荧光原位杂交(fish；包括多色fish和fiber-fish)、产色原位杂交(cish)、银原位杂交(sish)和阵列。本公开内容的组合物可通过降低变性和杂交温度和/或时间来改善传统rna杂交应用的效率。通常，分子探针可如下制备：通过化学合成、pcr或通过利用克隆扩增特定dna序列、将该dna插入到载体中并在合适的大肠杆菌宿主细胞中扩增载体插入序列。常用的载体包括细菌质粒、粘粒、细菌人工染色体(bac)、pi转向人工染色体(pidivertedartificialchromosome,pac)或酵母人工染色体(yac)。然后提取扩增的dna，并纯化用作探针。核酸探针可为双链的或单链的核酸片段或序列，例如dna、rna或类似物，例如pna或lna。可标记探针以使得通过使用例如荧光或明视野显微镜/扫描仪鉴定探针-靶标杂合体成为可能。在一些实施方案中，可使用放射性标记例如31p、33p或32s，非放射性标记例如地高辛配基和生物素，或荧光标记，来标记探针。通常，探针的类型决定可以在杂交测定中检测的特征类型。例如，大的插入序列探针可用于靶向独特的单拷贝序列。对于这些大的探针，杂交效率与探针大小成反比。较小的探针可用于检测畸变，例如缺失、扩增、反转、重复和非整倍性。例如，不同着色的基因座特异性探针可用于经分离信号原位杂交来检测易位。通常，区分密切相关的序列的能力与杂交探针的长度成反比，因为在野生型复合物和突变复合物之间热稳定性的差异随着探针长度增加而降低。通常需要长度大于10bp的探针以获得正确地鉴定独特的目标生物体或临床条件所必需的序列多样性。另一方面，在非常短的寡聚物(<10个碱基对)中微小至单碱基的序列差异(点突变)可足以实现相较于与非靶标序列杂交，区分与互补核酸靶标序列的杂交。在某些实施方案中，至少一组杂交探针可包含一个或多个pna探针。备选地或此外，在以上讨论的任何技术中的至少一组杂交探针可包含一个或多个锁核酸(lna)探针。由于在2′和4′碳之间额外的桥接键，lna骨架对于杂交是预组织的。lna/rna相互作用强于对应的dna/rna相互作用，如由更高的解链温度所指示的。因此，降低杂交所需能量的本公开内容的组合物和方法特别可用于与lna探针的杂交。在一个实施方案中，探针可包含可检测的标记(允许检测探针-靶标杂合体的提供可经分析鉴定的信号的分子)。可检测的标记可直接连接至探针，或通过使用接头间接连接至探针。包括酶促方法和化学方法在内的本领域技术人员已知的任何标记方法均可用于标记在本公开内容的方法和组合物中使用的探针。在其他实施方案中，不标记探针。通常，用于dna检测的原位杂交技术例如fish、cish和sish使用以不同严格性杂交的大的(主要是非特异性的)核酸探针。使用大的探针使得原位杂交技术非常灵敏。然而，在传统杂交测定中成功使用大的探针取决于阻断来源于在整个基因组中存在的重复序列的非所需的背景染色。用于降低非特异性探针结合的传统方法包括使用未标记的“阻断”dna，例如cot-1dna。此外，非特异性探针结合可如下降低：通过将组织与含有蔗聚糖、牛血清白蛋白(bsa)、聚乙烯吡咯烷酮和核酸的预杂交溶液温育，以使蛋白和组织上的结合位点饱和。可直接或间接利用荧光染料(例如，fish)、有机色原体(例如，cish)、银颗粒(例如，sish)或其他金属颗粒(例如，金促进的荧光原位杂交goldfish)，在细胞学样品和组织学样品中检测结合的探针。因此，取决于检测方法，从待测试的样品获得的细胞/细胞核群体可经由荧光显微术或常规明视野光显微镜可视化。对于细胞学样品和组织学样品的杂交测定是用于确定特定dna或rna序列的数量、大小和/或定位的有用的工具。当需要多色成像时和/或当方案要求定量信号时，可使用fish。该技术通常必须制备细胞学样品、标记探针、任选使靶标和探针变性、使探针与靶标序列杂交和检测信号。典型地，杂交反应对靶向的序列进行荧光染色，使得可使用荧光显微术、流式细胞术或其他合适的仪器操作来确定其定位、大小或数量。范围从兆碱基下至数千碱基的rna序列可使用fish研究。利用增强的荧光显微镜技术，例如去卷积，甚至可检测单一mrna分子。fish也可对中期铺展和间期细胞核使用。在检测单拷贝序列、特别是人和其他真核生物模型物种中的疾病相关序列中和检测传染原中，已有fish的一种有用的应用。fish可用于检测：出生前诊断、血液学癌症和实体肿瘤中的染色体非整倍性；基因异常，例如癌基因扩增、基因缺失或基因融合；易位、重复、插入或反转；相邻基因综合征，例如微缺失综合征；各种疗法的遗传效果；和体细胞中的病毒核酸和染色体中的病毒整合位点。fish技术包括多重fish(m-fish)、光谱核型分析(sky)、混合二元定量标记(combinedbinaryrationlabeling,cobra)、颜色变化的核型分析、交叉物种颜色带型分析、高分辨多颜色带型分析、端粒多重fish(tm-fish)、分离信号fish(ssfish)和融合信号fish。cish和sish可用于许多相同应用如fish，并具有额外的允许分析基础的组织形态学的优点，例如在组织病理学应用中。如果进行fish，则杂交混合物可含有不同和平衡对的探针组。对于cish，杂交混合物可含有配置为用一种或多种常规有机色原体检测的至少一组探针，而对于sish，杂交混合物可含有配置为用银颗粒检测的至少一组探针，如powellrd等,“metallographicinsituhybridization,”hum.pathol.,38:1145-59(2007)中所述。本公开内容的组合物也可完全地或部分地用于涉及杂交的所有类型的分子生物学技术，包括印迹和探测(probing)(例如，rna印迹和dna印迹)和测定。2.杂交条件使用本公开内容的组合物的杂交方法可包括施用组合物至包含靶标核酸序列(最可能是呈双链形式)的样品。一般，为了保证探针与靶标序列杂交的机会，加热样品和组合物以使靶标核酸变性。在变性期间，溶剂与序列相互作用，并促进靶标的变性和探针重新退火至靶标。使用本公开内容的组合物的杂交可使用与关于利用传统组合物进行的杂交相同的测定方法进行。然而，本公开内容的组合物允许较短的杂交时间。例如，热预处理、消化、变性、杂交、洗涤和固定步骤可使用与关于传统组合物相同的体积、温度、试剂和温育时间方面的条件。在本领域已知的传统杂交方案中存在大的变化。例如，一些方案规定在不存在探针的情况下潜在双链核苷酸的单独的变性步骤，之后是杂交步骤。本公开内容的组合物可用于本领域中已知的任何传统杂交方案。备选地，使用本公开内容的组合物的测定可自传统方法改变和优化，例如通过减少杂交时间、升高或降低变性和/或杂交温度和/或增加或减少杂交体积。在某些实施方案中，当变性温度是60℃至100℃且杂交温度是20℃至60℃时，本公开内容的组合物会产生强的信号。在其他实施方案中，当变性温度是60℃至70℃、70℃至80℃、70℃至90℃、80℃至90℃或90℃至100℃，且杂交温度是20℃至30℃、30℃至40℃、35℃至50℃、40℃至50℃或50℃至60℃时，本公开内容的组合物会产生强的信号。在其他实施方案中，当变性温度是72℃、73℃、82℃、85℃或92℃，且杂交温度是37℃、40℃、45℃或50℃时，本公开内容的组合物会产生强的信号。在其他实施方案中，当变性时间是0至10分钟且杂交时间是0分钟至24小时时，本公开内容的组合物会产生强的信号。在其他实施方案中，当变性时间是0至5分钟且杂交时间是0分钟至8小时时，本公开内容的组合物会产生强的信号。在其他实施方案中，当变性时间是0、1、2、3、4或5分钟，且杂交时间是0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟或240分钟时，本公开内容的组合物会产生强的信号。本领域技术人员应理解的是，在rna检测的一些情况下，不需要变性步骤。因此，使用本公开内容的组合物的杂交可在少于8小时内进行。在其他实施方案中，杂交在少于6小时内进行。在又其他的实施方案中，杂交在4小时内进行。在其他实施方案中，杂交在3小时内进行。在又其他的实施方案中，杂交在2小时内进行。在其他实施方案中，杂交在1小时内进行。在又其他的实施方案中，杂交在30分钟内进行。在其他实施方案中，杂交可在15分钟内发生。杂交甚至可在10分钟内或少于5分钟内发生。随着杂交时间变化，探针浓度也可变化，以便产生强的信号和/或减少背景。例如，随着杂交时间减少，探针的量可增加，以便提高信号强度。另一方面，随着杂交时间减少，探针的量可减少，以便改善背景染色。与传统杂交组合物相比，本公开内容的组合物通常允许更好的信噪比。例如，与传统组合物中的过夜杂交相比，利用特定探针，利用本公开内容的组合物的一小时杂交会产生类似的背景和更强的信号。当不添加探针时，观察不到背景。当使用本公开内容的组合物时，也可改变和优化传统测定方法，这取决于系统是手工的、半自动化的或自动化的。例如，半自动化的或自动化的系统获益于利用本公开内容的组合物获得的短杂交时间。当在这样的系统中使用传统组合物时，短杂交时间可减少遇到的难题。例如，利用半自动化的和自动化的系统的一个问题是在杂交期间可发生样品的显著蒸发，因为这样的系统需要小的样品体积(例如，10-150μl)、升高的温度和延长的杂交时间(例如，14小时)。因此，在传统杂交组合物中组分的比例是相当不变的。然而，因为本公开内容的组合物允许更快的杂交，所以减少了蒸发，允许在半自动化的和自动化的系统中使用的杂交组合物中组分比例的灵活性增加。利用自动化成像分析的另一个问题是所需的图像数量、需要的大量的贮存空间和拍摄图像所需的时间。与传统组合物相比，本公开内容的组合物可产生非常强的信号。因为本公开内容的组合物产生的非常强的信号，所以与传统组合物所需的放大率相比，成像可在更低的放大率下完成，并仍可检测并通过算法分析。因为焦平面在低放大率下变得更宽，所以本公开内容的组合物可减少或消除获取样品的连续切片的要求。因此，总体成像可快得多，因为本公开内容的组合物需要更少的连续切片或不需要连续切片，且每个图像覆盖大得多的区域。此外，用于分析的总体时间可更快，因为总的图像文件小得多。本发明具有通过以下非限制性实施例阐述的多个方面。3.实施例实施例1.用于fish测定的杂交缓冲液组合物混合硫酸葡聚糖、盐水柠檬酸钠、甲酰胺和硫氰酸胍以制备杂交缓冲液组合物1-4。表格中的制剂是15μl反应物中最终的工作浓度，其使用12μl的主体缓冲液和3μl的含水探针混合物。混合硫酸葡聚糖、盐水柠檬酸钠、甲酰胺、硫氰酸胍和聚丙烯酸钠(平均mw为2100g/mol或5100g/mol)，以制备杂交缓冲液组合物5。混合硫酸葡聚糖、盐水柠檬酸钠、甲酰胺和碳酸亚乙酯，以制备杂交缓冲液组合物6。混合硫酸葡聚糖、盐水柠檬酸钠、甲酰胺和琥珀酸二甲酯，以制备杂交缓冲液组合物7。缓冲液组合物的组分和其浓度详述于表1。缓冲液制备物:制备1ml大小/体积的缓冲液。对于各个缓冲液管，将硫酸葡聚糖以小份添加到硫氰酸胍、milli-q水(缓冲液中总水的~1/3-2/3)、甲酰胺和20xscc缓冲液的溶液中。将缓冲液搅拌至少12小时，之后是最终ph验证和体积调整。表1.实施例2.利用杂交缓冲液组合物评价fish测定使用三色bcr(spectrumorange)/abl(spectrumgreen)/ass(spectrumaqua)探针组评价杂交缓冲液3、4和5的fish性能。在80℃进行thermobrite共变性2分钟，之后在37℃杂交2小时。各缓冲液的杂交性能的评价基于至少2名独立的评论者对强度、特异性、背景和交叉杂交的质量等级评定(1-5级，其中5最好)，使用以下显微镜滤色镜：单带通浅绿色(aqua)、绿色(green)和橙色(orange)以及三带通(橙色/绿色/dapi)。表2报告了fish测定中缓冲液组合物的性能结果，列出了关于所有滤色镜的平均强度、平均特异性、平均背景和总体等级评定(由杂交中探针信号的强度、特异性和背景的最低值确定)，以及按滤色镜的平均总体等级评定。缓冲液4评分良好，因为其平均总体等级评定(由杂交中探针信号的强度、特异性和背景的最低值确定)是3.9，且其利用三通滤色镜的平均总体等级评定是4.0。表2.基于密度，主体的缓冲液组合物包含以重量计大约23.7%水、34.2%甲酰胺、29.1%硫酸葡聚糖、12.3%硫氰酸胍、0.45%氯化钠和0.23%柠檬酸钠。缓冲液密度是1.20g/ml。硫酸葡聚糖:0.35gds/ml缓冲液x1mlb/1.20gb*100=29.1wt.%甲酰胺:0.375mlf/mlbx1.13gf/mlfx1mlb/1.20gbx100=34.2wt.%硫氰酸胍(gitc):0.148gg/mlbx1mlb/1.20gb=12.3wt.%nacl:0.0312mlssc/mlbx3mmolnacl/mlsscx0.0585gnacl/mmolnaclx1mlb/1.2gbx100=0.45%柠檬酸钠:0.0312mlssc/mlbx0.3mmolsc/mlsscx0.294gsc/mmolsclx1mlb/1.2gbx100=0.23%水(通过差异)=23.7%水(基于最小体积实际配方)=30mlw/100mlbx1mlb/1.2gb=25.0%(注意初始添加20ml水，并添加额外的10ml用于qs)杂交缓冲液组合物4可利用表3中所示的组分制备。为了制备工作溶液，将12ul的该缓冲液与3ul的含水探针混合物在杂交反应中一起使用。表3.缓冲液组合物硫酸葡聚糖盐水柠檬酸钠甲酰胺硫氰酸胍初始水总计40.350g0.031x0.375ml0.148g0.200ml1.0ml实施例3.评价杂交缓冲液组合物组分浓度使用实施例1中所述的方法，制备含有不同浓度的硫酸葡聚糖(ds)、甲酰胺(fa)和硫氰酸胍(gitc)以及恒定浓度的ssc的杂交缓冲液，并示于表4。使用三色bcr(spectrumorange)/abl(spectrumgreen)/ass(spectrumaqua)探针组评价这些缓冲液的fish性能。在80℃进行thermobrite共变性2分钟，之后在37℃杂交2小时。表4报告了fish测定中缓冲液组合物的性能结果，列出了平均强度、平均特异性、平均背景和按滤色镜的平均总体等级评定。表4。基于这些结果，选择以下杂交缓冲液制剂作为顶级性能者：(1)27%ds,32%fa,0.8mgitc(2)g1–24%ds,33%fa,1.2mgitc以及(3)28%ds,30%fa和1mgitc。实施例4.评价杂交缓冲液中不同的硫酸葡聚糖来源在称为“g12”的杂交缓冲液中测试来自多种不同商业来源的硫酸葡聚糖，该杂交缓冲液含有32%(w/v)ds、40%(w/v)fa和1.6mgitc。ds供应商包括sigma、pkchemicals、tdb、amserco、mpbiomedicals和dextranproductsltd.(affymetrix)。使用三色bcr/abl/ass探针组以及双色p53/cep17和p16/igh探针组评价这些缓冲液的fish性能。缓冲液组合物和fish结果示于表5。表5.该实施例的结果证实，g12gitc缓冲液的性能视ds来源而变化。然而，两个ds供应商(affymetrix和tdb)显示可接受的性能。affymetrixds批号170是酸性的，且在gitc缓冲液中性能差。然而，ph调整挽救了其性能。应当理解，前述详细说明和伴随的实施例仅是说明性的，而不应被视为对本发明范围的限制，本发明范围只由所附权利要求书及其等同物限定。所公开的实施方案的各种变化和改变对于本领域技术人员会是显而易见的。可在不偏离其精神和范围的情况下作出这样的变化和改变，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些。当前第1页12