本发明涉及物质分离技术领域，特别是涉及提取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法。
背景技术：
南极磷虾(Euphausia superba)是一类生活在南大洋中的甲壳类浮游动物，其具有生物蕴藏量大、分布广等特点，是重要的战略性海洋新资源。据估计，南极磷虾贮藏量有6.5～10亿吨之巨，最大耐受捕捞量约为400～600万吨。南极磷虾是南极海域生态系统的重要环节，近几年受到广泛关注。各国科研机构开展了南极磷虾精深加工技术，在食品、药品、保健品等领域进行了大量研究，是近年来的热点研究课题之一。研究发现，南极磷虾营养价值高，富含蛋白质、脂质、矿物元素，以及酶类、类菌孢素氨基酸、虾青素等活性物质，具有降低胆固醇、预防老年痴呆症、预防动脉硬化、抗炎症、保护视力、及改善大脑学习机能等生理功能。目前国内外对南极磷虾的研究主要围绕蛋白质、脂肪酸、消化酶、矿物元素等组分，而针对南极磷虾中磷脂酰胆碱96孔板固相萃取研究国内外尚未见报道。
磷脂是一类含有磷酸的脂类，磷脂结构主要由甘油骨架、极性基团和不同长度和饱和度的脂肪酸链组成。根据磷脂极性基团不同，可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等类别。生物体中存在的磷脂种数以千计，结构多样、种类复杂，具有独特的化学结构。磷脂是组成细胞膜的主要物质，是磷脂双分子层的基础物质，常见的有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholin,PC)又称卵磷脂，是生物生长所需的最重要的磷脂之一，也是人体获得胆碱的重要途径。研究发现，磷脂酰胆碱在增强记忆、降脂降胆固醇、修复肝细胞以及抗疲劳等生理功能，并且在治疗阿兹海默症方面有一定效果。
复杂样品基质中磷脂酰胆碱的全面提取是脂质组学研究的关键步骤之一，也是当前限制产业发展的技术难题之一。传统提取方法在提取磷脂酰胆碱的同时容易引入小分子杂质，特异性不强，且通量小，样品需要逐个提取，提取效率低。目前现有的从生物中提取磷脂酰胆碱的方法为：溶剂萃取法。该方法采用有机溶剂从固体或者液体样品中萃取磷脂酰胆碱，该方法一方面提取专一性不高，提取磷脂酰胆碱的同时容易共萃取其他杂质；另一方面处理步骤繁琐，操作复杂，通量低，当待测样品量大时需要消耗大量人力物力。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种利用96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法；该方法将液液萃取、96孔板、固相萃取有效结合，高纯度提取南极磷虾中的磷脂酰胆碱，通量高，可一次性同时提取96个样品，从而解决了现有技术中存在的提取效率低、特异性差、产品质量不高、南极磷虾加工利用程度低等问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法，包括以下步骤：
1)、原料预处理：
取南极磷虾肌肉组织(新鲜的南极磷虾肌肉组织)，洗净后研磨成糜，再真空干燥后粉碎成粉末，得南极磷虾粉；
2)、粗提液制备：
在南极磷虾粉中加入有机溶剂Ⅰ后混合均匀，冰浴超声提取，然后加入水震荡离心，待溶液分层后移取下清液；先将下清液减压干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到南极磷虾磷脂粗提液；
所述有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，南极磷虾粉与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/25～35ml(较佳为1g/30ml)；所述水的用量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为甲醇，南极磷虾粉与有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/8～12ml(较佳为1g/10ml)；
3)、96孔板固相萃取：
使用有机溶剂Ⅲ水溶液活化96孔板固相萃取板，经南极磷虾磷脂粗提液上样、有机溶剂Ⅲ水溶液淋洗、有机溶剂Ⅳ或有机溶剂Ⅳ水溶液洗脱后，得到纯化后的磷脂酰胆碱提取物；
有机溶剂Ⅲ水溶液中有机溶剂Ⅲ的体积浓度≤10％，有机溶剂Ⅲ为甲醇或乙腈；
有机溶剂Ⅳ水溶液中有机溶剂Ⅳ的体积浓度为≥75％，有机溶剂Ⅲ为甲醇或乙腈。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的改进：该方法还包括下述步骤4)；
4)、浓缩干燥：
将步骤3)所得的纯化后的磷脂酰胆碱提取物低温减压浓缩，得到南极磷虾磷脂酰胆碱浓缩液。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：96孔板固相萃取板的每个孔中的填料为25±5mg的二氧化锆。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：
所述步骤1)中：
真空干燥至含水率≤5％(质量％)；
粉碎至粉末能过80～100目筛。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：
所述步骤2)中，以移取下清液后的残渣(该残渣包括离心所得的固体物和上清液)替代南极磷虾粉，以机溶剂Ⅰ中的氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；
合并所有提取步骤所得的下清液再减压干燥，然后用有机溶剂Ⅱ复溶后，得到南极磷虾磷脂粗提液。
说明：甲醇、氯仿、水三者在一起的时候不会混溶，会分成上下两相，甲醇极性较强会与水混溶，因此在离心管中，氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相后，实际大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重复提取的时候只需要加入氯仿即可。即，重复提取时氯仿的体积用量＝机溶剂Ⅰ中的氯仿的体积用量。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：
所述步骤2)中，
震荡离心为于12,000±1000rpm/min的速度、4±0.5℃的温度下高速冷冻离心5±1分钟。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：
所述步骤2)中，
每0.1～1g的南极磷虾粉，对应的超声功率为200W，冰浴(0℃)超声提取30±5min。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：
所述步骤3)中，上样、淋洗和洗脱的流速均为0.4～1mL/min(优选流速为0.6mL/min)。
作为本发明的96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法的进一步改进：所述步骤4)中于10～25℃、0.7～0.1Mpa(优选0.9Mpa)下进行低温减压浓缩。
在本发明中，
步骤1)：取新鲜的南极磷虾组织，洗净后研磨成糜，真空干燥后粉碎成粉末，得南极磷虾粉；
步骤2)：在0.1g南极磷虾粉中加入有机溶剂甲醇：氯仿＝1：0.5～2的混合液3ml后充分混合均匀，冰浴超声提取，然后加入0.5～1体积倍数的水震荡离心，待溶液分层后移取下清液；先将下清液减压干燥，然后用有机溶剂甲醇1ml复溶后，得到南极磷虾磷脂粗提物；
步骤3)：取规格为8*12孔的96孔板固相萃取板，向每个孔中填装二氧化锆填料25mg。
该步骤3)具体包括以下步骤：
A)填料活化：使用有机溶剂Ⅲ水溶液对填料层进行活化处理，使用3mL注射器将有机溶剂水溶液流经填料层，将流出液收集并丢弃，达到固相萃取柱活化与清洗的目的。
B)上样：取3mL注射器抽取适量样品溶液(即，步骤2)所得的南极磷虾磷脂粗提液)100μL，注入固相萃取柱，目标组分被吸附在填料上，杂质直接随样品溶液流出固相萃取柱并丢弃。
C)淋洗：向固相萃取柱注入3mL淋洗液，所述的淋洗液为含0～10％甲醇或乙腈的超纯水，目的是为了洗去与目标组分共吸附的杂质。
D)洗脱：向固相萃取柱加入1～3mL洗脱剂，所述洗脱剂为含75～100％甲醇或乙腈的超纯水，收集洗脱液。
本发明的方法以南极磷虾肌肉组织为原料，前期采用液液萃取法提取脂质粗体物，后期采用以二氧化锆为填料的96孔板固相萃取磷脂酰胆碱，从而实现了高通量高纯度提取南极磷虾中的磷脂酰胆碱。本发明最终所得的南极磷虾磷脂酰胆碱浓缩液于低温(≤4℃)避光保存。
本发明具有如下技术优势：
A)、工艺简洁，样品制备、填料活化、上样、淋洗和洗脱步骤，均简单易培训，且无需特殊仪器设备，实用性强，适合广泛使用。
B)、本发明的方法稳定、提取效果好；通量高，可一次性同时提取96个样品。
C)、本发明首次使用二氧化锆提取净化南极磷虾中的磷脂酰胆碱。相比传统磷脂酰胆碱提取方法---液液萃取法和硅胶G层析法，不仅产物的磷脂纯度高(>90％)，且二氧化锆几乎不存在死吸附，提取率在90％以上。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明所得的南极磷虾磷脂酰胆碱浓缩液的质谱检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、一种96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法，依次进行以下步骤：
1)、原料预处理：
取新鲜南极磷虾，去头去壳后得到肌肉组织，洗净后研磨成糜，真空干燥至含水率≤5％(重量％)后，粉碎成粉末(能过80～100目筛)，得到南极磷虾粉末。
2)、粗提液制备(液液萃取)：
精密称定研磨好的南极磷虾粉末0.1g，用氯仿-甲醇(2：1，体积比)混合液3mL冰浴超声(0℃、功率为200W)提取30min，加入超纯水1.5mL并以12,000rpm/min高速冷冻(即，4℃)离心5分钟。使用200mL移液枪转移下清液，向余下的上清液和固形物中加入2mL氯仿，根据上述操作重复提取两次。合并3次的下清液并减压蒸干(0.9MPa的压力下干燥至恒重)，加入1mL甲醇复溶，过0.22μm有机膜后即得到南极磷虾磷脂粗提液。
3)、96孔板固相萃取：
取规格为8*12孔的96孔板固相萃取板，向每个孔中填装作为填料的二氧化锆25mg。SPE柱使用前用5％乙腈3ml进行活化和平衡。用移液枪取南极磷虾磷脂粗提液100μL后上样，并以0.6mL/min流速通过柱床。用5％乙腈3ml清洗SPE柱，弃去淋洗液后用90％乙腈1mL进行洗脱，收集获得洗脱液1mL。
淋洗和洗脱时的流速均为0.6mL/min，所得的洗脱液为纯化后的磷脂酰胆碱。
4)浓缩干燥：
将纯化后的磷脂酰胆碱低温(10～25℃)减压(0.9MPa)浓缩至为0.1ml(即为原体积的1/10)，得到南极磷虾磷脂浓缩液。
储存：得到的南极磷虾磷脂浓缩液于4摄氏度避光保存。
备注说明：上述步骤1)～步骤4)没有明确提及的，均是指在10～25℃的室温下进行。
质谱检测：针泵注射进样器流速为5μL/min。质谱扫描范围从m/z 450到950。磷脂酰胆碱在母离子和中性丢失两种扫描模式下检测，并通过多通道监测(MCA)将谱图累加。正离子模式下离子喷雾电压分别为5.5kV。离子源温度为450℃。雾化气和气帘气分别为35和20psi。去簇电压和碰撞电压分别为100和40V。
将处理后的样品直接注入ESI离子源，选定特征离子碎片即可通过质谱扫描得到所有含有该碎片的母离子。磷脂酰胆碱含有特征碎片[C5H15O4NP]+，故选定m/z 184为子离子，经PIS扫描后即可得到所有磷脂酰胆碱类磷脂分子(图1)。
使用本发明的方法南极磷虾组织磷脂的提取量为：565.08μg/g；共检出36种不同碳链长度和不饱和度的磷脂酰胆碱分子。如下表1所述。
表1
备注说明：上述提取量是以步骤1)所得的南极磷虾粉末计算的。
对比例1-1、将实施例1步骤3)中的淋洗液由“5％乙腈”改成“50％乙腈”，体积量不变；其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1步骤3)中的洗脱液由“90％乙腈”改成“70％乙腈”，体积量不变；其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1步骤3)中的填料由“二氧化锆”改成硅胶G，重量不变，其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1步骤3)中的填料由“二氧化锆”改成C18，重量不变，其余等同于实施例1。
对比例2-3、将实施例1步骤3)中的填料由“二氧化锆”改成HLB，重量不变，其余等同于实施例1。
对比例2-4、将实施例1步骤3)中的填料重量变为20mg，其余等同于实施例1。
对比例3-1、将实施例1步骤3)中淋洗和洗脱时的流速均由0.6mL/min改成1.6mL/min，其余等同于实施例1。
对比例3-2、将实施例1步骤3)中淋洗和洗脱时的流速均由0.6mL/min改成0.2mL/min，其余等同于实施例1。
对比例4-1、将实施例1步骤2)有机溶剂Ⅰ改成由“甲醇：二氯甲烷＝3:1”组成，体积量不变，其余等同于实施例1。
对比例4-2、将实施例1步骤2)有机溶剂Ⅰ改成由“甲醇：二氯甲烷＝1:3”组成，其余等同于实施例1。
上述对比例所得的提取量等与本发明实施例1的对比如下表2所述。
表2
备注说明：PC 16:0/18:1指该磷脂酰胆碱分子的其中一条脂肪酸链为16个碳原子，无不饱和双键；另一条碳链为18个碳原子，含一个不饱和双键。两条脂肪酸链的碳原子数和不饱和双键数的差异会造成磷脂酰胆碱分子结构多样化。
综上可见，本发明的利用96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法可以快速、有效的对南极磷虾中的磷脂酰胆碱富集净化，将液液萃取与固相萃取有效结合，高通量高纯度提取南极磷虾中的磷脂，解决了现有技术中存在的提取效率低、产品质量不高、南极磷虾加工利用程度低等问题。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。