一种酶法制备邻苯酚类化合物的方法与流程

本发明涉及生物催化领域，特别涉及一种酶法制备邻苯酚类化合物的方法。

背景技术：

多酚类化合物广泛存在于植物中，具有较好的抗氧化性、以及良好的抗炎和抗肿瘤等活性，受到越来越多的关注。邻苯酚类化合物属于多酚类化合物，其独特的邻位双羟基结构使其性质更活泼，具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗心血管疾病和抗衰老等活性，如3'-羟基紫檀茋、白藜芦醇、3,4-二羟基苯乙酸等，具有较大的应用和研究价值。因此，探索绿色制备邻苯酚类化合物的方法和工艺具有较大的意义

3'-羟基紫檀茋(3’-Hydroxypterostilbene，(E)-3,5-二甲氧基-3’,4’-二羟基芪)，是天然产物紫檀茋的类似物，最初从灌木苦马豆中分离得到的。近期研究表明，3'-羟基紫檀茋在体外实验中能够有效抑制人类肿瘤细胞(COLO 205,HCT-116,and HT-29)，这在裸鼠的体内也得到了验证。而且，3'-羟基紫檀茋还能够诱导细胞的凋亡和自噬来抑制细胞的增殖，也能够下调磷脂酰肌醇(-3)激酶和胞外信号调节激酶(二者是癌细胞信号通路中重要的酶)。因此，3'-羟基紫檀茋在治疗癌症上有巨大的潜力。目前，3'-羟基紫檀茋的制备主要是靠化学法和植物提取，还未见生物法制备的报道。公开报道化学法制备3'-羟基紫檀茋是以紫檀茋为原料，先用2-碘酰基苯甲酸氧化，再经连二亚硫酸钠还原得到3'-羟基紫檀茋，反应介质为四氢呋喃或其他有机溶剂，反应过程复杂，连二亚硫酸钠是有毒物质，且遇水发生燃烧或爆炸放出有毒气体，绿色不环保。从植物中提取3'-羟基紫檀茋亦不经济，有研究人员从1.8kg的苦马豆中提取到5mg的3'-羟基紫檀茋，且过程繁琐，需要使用到大量有机溶剂，同样不绿色环保。

白皮杉醇(Piceatannol)是白藜芦醇(Resveratrol)的羟基化类似物，属于非黄酮类多酚化合物，是植物在受到外界病原体损害时分泌的植物抗毒素。它们在抗真菌、抗氧化、抗癌、抗肥胖、保护神经、保护心血管等方面具有较好的功效。虽然白皮杉醇和白藜芦醇具有相似的生物活性，由于白皮杉醇具有邻苯酚结构，使得白皮杉醇的抗氧化活性是白藜芦醇的3000多倍，且抗癌活性和其他多种药理活性均优于白藜芦醇，因此绿色高效合成白皮杉醇的方法和工艺受到关注。通过文献检索，目前制备白皮杉醇多是化学法和植物提取。化学法成本较低，但化学合成反应过程复杂，专一性较差，环境污染较大。植物中的白皮杉醇含量较低，从植物中提取白皮杉醇需要大量原料，耗时耗力。

3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DHPAA)是邻苯二酚衍生物，其能够预防胰腺细胞功能失调引起的高胆固醇。3,4-二羟基苯乙酸也被认为是预防或延迟糖尿病前期到糖尿病过程的一种很有前途的药物，还具有抑制前列腺癌和结肠癌细胞增殖的活性。目前，3,4-二羟基苯乙酸的制备以化学法为主，反应过程复杂，专一性较差，使用大量有毒有害试剂，环境污染较大。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种环境友好、成本低、反应条件温和的酶法制备邻苯酚类化合物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种酶法制备邻苯酚类化合物的方法，是采用无载体固定化酪氨酸酶为催化剂，以单苯酚类化合物为底物，二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，L-抗坏血酸为还原剂，在15～40℃下反应1～7h，得到邻苯酚类化合物。

所述单苯酚类化合物的结构式为R-C₆H₄OH，R取代基在苯环的对位；其中，R优选为H-、Me-、MeO-、HO₂C-(CH₂)_n-、HO-(CH₂)_n-、3,5-(HO)₂-Ph-CH₂-CH＝CHC₂-、3,5-(MeO)₂-Ph-CH₂-CH＝CHC₂-或PhCO-NHCH₂-。

所述单苯酚类化合物优选紫檀茋、白藜芦醇、4-羟基苯乙酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯丙酸、4-羟基苯甲醇、4-羟基肉桂酸或4-羟基肉桂酸。

所述单苯酚类化合物的用量为溶质总质量的10～50％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量为溶质总质量的5～50％(wt.％)，L-抗坏血酸的用量为溶质总质量的15～80％(wt.％)；所述二甲基亚砜的用量为溶液总体积的10～50％(v/v)。

所述反应是220rmp恒温振荡培养箱中进行。

所述无载体固定化酪氨酸酶，是采用交联酶聚集体技术制备得到，包括下述步骤：

(1)蘑菇中酪氨酸酶的提取：新鲜白色双孢菇洗净晾干后，将双孢菇：磷酸缓冲液(pH6.0，50mM)按质量体积比(g/ml)为1:(1～3)的比例混合，然后用匀浆机捣碎，过滤除去残渣后，将酪氨酸酶溶液冷冻储存；

(2)无载体固定化：在室温下将冻存的酪氨酸酶溶液解冻，加入硫酸铵至40～80％饱和度，继续振摇，待硫酸铵全部溶解后，加入25％(wt.％)的戊二醛，使酪氨酸酶溶液中戊二醛的量达到0.15～0.35％(wt.％)，在4℃下继续搅拌12～18h，得到浊液；然后将浊液离心，去上清后加入磷酸缓冲液(pH6.0，50mM)清洗沉淀，然后离心重复清洗3～5次，至上清完全没有酶活(即把未固定化的酪氨酸酶洗掉)为止；再将沉淀冷冻干燥12～18h至重量不再减少为止，得到无载体固定化酪氨酸酶。

离心条件为10min，8000rmp，4℃。

所述邻苯酚类化合物的结构式为3,4-(HO)₂-C₆H₃-R，R取代基在苯环的对位；其中，R优选为H-、Me-、MeO-、HO₂C-(CH₂)_n-、HO-(CH₂)_n-、3,5-(HO)₂-Ph-CH₂-CH＝CHC₂-、3,5-(MeO)₂-Ph-CH₂-CH＝CHC₂-或PhCO-NHCH₂-。

所述邻苯酚类化合物优选3'-羟基紫檀茋、白皮杉醇或3,4-二羟基苯乙酸。

当采用无载体固定化酪氨酸酶制备3'-羟基紫檀茋时，底物紫檀茋的用量为15～45％(wt.％)，还原剂L-抗坏血酸的用量为15～55％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量为5～40％(wt.％)，反应的温度为15～50℃，反应时间1～7h，合成3'-羟基紫檀茋；生成的3'-羟基紫檀茋会被氧化成相应的醌，再进一步用L-抗坏血酸将醌还原为3'-羟基紫檀茋。

底物紫檀茋的用量优选为30％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量优选为29％(wt.％)，还原剂L-抗坏血酸的用量优选为41％(wt.％)，温度优选为25℃，反应时间优选为4h。

当采用无载体固定化酪氨酸酶制备白皮杉醇时，底物白藜芦醇的用量为15～45％(wt.％)，二甲基亚砜的用量为20～50％(v/v)，无载体固定化酪氨酸酶的用量为5～40％(wt.％)，L-抗坏血酸的用量为15～55％(wt.％)，反应温度为15～40℃下，反应时间为1～7h，合成白皮杉醇；生成的白皮杉醇会被氧化成相应的醌，再进一步用L-抗坏血酸将醌还原为白皮杉醇。

底物白藜芦醇的用量优选为28％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量优选为30％(wt.％)，还原剂L-抗坏血酸的用量优选为42％(wt.％)，温度优选为20℃，反应时间优选为4h。

当采用无载体固定化酪氨酸酶制备3,4-二羟基苯乙酸时，底物4-羟基苯乙酸的用量为10～50％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量为5～20％(wt.％)，L-抗坏血酸的用量为40～80％(wt.％)，反应温度为20～40℃下，反应时间为1～4h，合成3,4-二羟基苯乙酸；生成的3,4-二羟基苯乙酸会继续被氧化成相应的醌，再进一步用L-抗坏血酸将醌还原为3,4-二羟基苯乙酸。

底物4-羟基苯乙酸的用量优选为26％(wt.％)，无载体固定化酪氨酸酶的用量优选为13％(wt.％)，pH优选为6，温度优选为25℃，反应时间优选为2h，还原剂L-抗坏血酸的用量优选为61％(wt.％)。

当采用酪氨酸酶溶液制备3,4-二羟基苯乙酸时，底物4-羟基苯乙酸的用量为20～40％(wt.％)，酪氨酸酶溶液的用量为5～20％(v/v％)，L-抗坏血酸的用量为60～80％(wt.％)，反应温度为20～40℃下，反应时间为1～4h，合成3,4-二羟基苯乙酸；生成的3,4-二羟基苯乙酸会继续被氧化成相应的醌，再进一步用L-抗坏血酸将醌还原为3,4-二羟基苯乙酸。

底物4-羟基苯乙酸的用量优选为30％(wt.％)，酪氨酸酶溶液的用量优选为15％(v/v％)，pH优选为6，温度优选为25℃，反应时间优选为2h，还原剂L-抗坏血酸的量优选为70％(wt.％)。

本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：

(1)酪氨酸酶(Tyrosinase)是含铜氧化还原酶，具有独特的双重催化功能，能够催化一元酚氧化成邻位的二元酚并进一步氧化生成邻苯醌。

(2)本发明创新性地用无载体固定化酪氨酸酶为生物催化剂，以单苯酚类化合物为底物合成邻苯酚类化合物，具有反应条件温和、周期短、反应专一性高，工艺步骤简单、操作安全等优点，为白皮杉醇、3'-羟基紫檀茋和3,4-二羟基苯乙酸的绿色生产提供了一种新方法。

附图说明

图1是分别用无载体固定化酪氨酸酶催化由底物4-羟基苯乙酸、白藜芦醇、紫檀茋转化成产物3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇、3’-羟基紫檀茋的反应式及分子结构。

图2是无载体固定化酪氨酸酶催化由单苯酚类化合物合成邻苯酚类化合物的反应机理。

图3-1是用HPLC检测白皮杉醇的标准曲线。

图3-2是用HPLC检测3'-羟基紫檀茋的标准曲线。

图4是3'-羟基紫檀茋的制备时间与产率之间的关系。

图5是3'-羟基紫檀茋的HPLC图谱。

图6是3'-羟基紫檀茋的¹H-NMR图谱。

图7是各种因素对制备白皮杉醇产率的影响以及催化条件的优化：

其中，A是酶量的影响，B是反应温度的影响，C是白藜芦醇的量的影响，D是L-抗坏血酸的量的影响，E是优选条件下的时间与产率的关系，F是扩大体系反应的时间与产率的关系。

图8是白皮杉醇的¹H-NMR图谱。

图9是用HPLC检测3,4-二羟基苯乙酸的标准曲线。

图10是用无载体固定化酪氨酸酶制备3,4-二羟基苯乙酸的反应条件优化：

其中，A是无载体固定化酪氨酸酶的酶量的影响，B是pH的影响，C是反应温度的影响，D是底物4-羟基苯乙酸的量的影响，E是L-抗坏血酸的量的影响，F是优选条件下的时间与产率的关系。

图11是用酶溶液制备3,4-二羟基苯乙酸的反应条件优化：

A是酶溶液的量的影响，B是pH的影响，C是反应温度的影响，D是底物4-羟基苯乙酸的量的影响，E是L-抗坏血酸的量的影响，F是优选条件下的时间与产率的关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1无载体固定化酪氨酸酶的制备

将市场买来的新鲜白色双孢菇洗净晾干后用匀浆机按蘑菇：磷酸缓冲液(50mM，pH6.0)＝1:2(质量体积比，g/ml)的比例将其捣碎，过滤除去残渣，酶溶液分装后于-20℃冰箱冷冻中储存。在室温下将冻存的酶溶液解冻，加入硫酸铵至50％饱和度，继续振摇，待硫酸铵全部溶解后，加入25％戊二醛(wt.％)使酶溶液中戊二醛的量达到0.25％(wt.％)，在4℃下继续搅拌16h。将所得浊液离心(10min，8000rmp,4℃)，去上清后加入磷酸缓冲液(pH6.0，50mM)清洗沉淀，然后离心(10min，8000rmp,4℃)重复清洗4次，至上清完全没有酶活为止(澄清)。然后将所得沉淀冷冻干燥12h，至重量不再减少为止，得到无载体固定化酪氨酸酶，经研磨后置于4℃冰箱保存。

实施例2HPLC测定白皮杉醇和3'-羟基紫檀茋浓度

高效液相色谱采用反向C18柱(日本GL Sciences，Inc公司，Inertsil ODS-SP，4.6×150mm，5μm)对白皮杉醇和3'-羟基紫檀茋含量进行测定，该液相条件为：流动相A为：0.5％乙酸/乙腈＝95/5(v/v)，流动相B为：乙腈/0.5％乙酸＝95/5(v/v)，A/B＝75/25(v/v)；进样量：10μL；总流速为1ml/min；白皮杉醇检测波长为320nm，3'-羟基紫檀茋检测波长为306nm；柱温为29℃。

用乙腈精确配制系列浓度的白皮杉醇和3'-羟基紫檀茋标准液，每个系列重复3次，经HPLC检测得到峰面积并取平均值，以白皮杉醇或3'-羟基紫檀茋浓度(X,mM)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的白皮杉醇3'-羟基紫檀茋经适当稀释后以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量，如图3-1和图3-2所示。

实施例3酶法制备3'-羟基紫檀茋

准确称取29％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入的紫檀茋的量为30％(wt.％)，L-抗坏血酸的量为41％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在20℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。在反应1、2、3、4、5、6、7h后，在6000rpm条件下离心2min，取20μl上清液，其余反应液放回恒温振荡培养箱中继续反应，如图4所示。上清液稀释20倍(稀释至400μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量，如图5所示，反应在进行到5h时，3'-羟基紫檀茋的产率达到了最大，为61.8％。反应如图1和图2所示。

收集3’-羟基紫檀茋峰对应的高效液相色谱流动相，旋转蒸发仪蒸干后固体用乙醇-水重结晶后得到白色固体3'-羟基紫檀茋。

产物的核磁表征数据为：¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:ppm 9.12(s，1H),8.94(s，1H)，7.06(d,J＝16.40Hz，1H)，6.96(d,J＝2.00Hz，1H),6.85(dd,J1＝8.40Hz，J2＝2.40Hz，1H),6.83(d,J＝16.40Hz，1H)，6.72(d,J＝8.40Hz，1H)，6.70(d,J＝2.00Hz，2H)，6.34(t，J＝2.00Hz,1H),3,75(s,6H)；结果如图6，经分析该产物确为3’-羟基紫檀茋。

在酶量29％(wt.％)，反应温度25℃，紫檀茋30％(wt.％)，L-抗坏血酸41％(wt.％)，反应时间4h的条件下，3'-羟基紫檀茋的产率为61.8％。

实施例4白皮杉醇的制备

准确称取4.1％、7.9％、11.4％、14.7％、17.7％、30％、39.2％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入相应的白藜芦醇的量为37.7％、36.2％、34.8％、33.5％、32.4％、28％、23.9％(wt.％)及对应的L-抗坏血酸的量为58.2％、55.9％、53.7％、51.8％、49.9％、42％、36.9％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在30℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。在5h后，在6000rpm条件下离心2min，取100μl上清液稀释20倍(稀释至2000μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-A所示，无载体固定化酪氨酸酶的用量为30％(wt.％)时，白皮杉醇的产率最高，为45.2％。

实施例5考察反应温度对白皮杉醇产率的影响

准确称取30％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入的白藜芦醇的量为28％(wt.％)，L-抗坏血酸的量为42％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在15、20、25、30、35、40、45℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。在5h后，在6000rpm条件下离心2min，取100μl上清液稀释20倍(稀释至2000μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-B所示，反应温度为20℃时，白皮杉醇的产率最高，为46.3％。

实施例6考察底物白藜芦醇浓度对白皮杉醇的产率的影响

准确称取34.9％、30％、26.5％、23.6％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入相应的白藜芦醇的量为15.9％、28％、36.2％、43.1％(wt.％)及对应的L-抗坏血酸的量为49.2％、42％、37.3％、33.3％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在30℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。在5h后，在6000rpm条件下离心2min，取100μl上清液稀释20倍(稀释至2000μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-C所示，底物白藜芦醇的用量为34.9％(wt.％)时，白皮杉醇的产率最高，为71.1％。

实施例7考察还原剂L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇的产率的影响

准确称取38.2％、33.7％、30％、27.2％、24.8％、21.1％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入相应的白藜芦醇的量为34.9％、30.7％、28％、24.8％、22.7％、19.3％(wt.％)及对应的L-抗坏血酸的量为26.9％、35.6％、42％、47.9％、52.5％、59.6％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在30℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。每个反应一式三份。在5h后，在6000rpm条件下离心2min，取100μl上清液稀释20倍(稀释至2000μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-D所示，L-抗坏血酸的用量为42％时，白皮杉醇的产率最高，为47.3％。

实施例8考察反应时间与白皮杉醇的产率之间的关系

准确称取30％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入的白藜芦醇的量为28％(wt.％)，L-抗坏血酸抗坏血酸的量为42％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，在20℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。在反应1、2、3、4、5、6、7h后，在6000rpm条件下离心2min，取20μl上清液，其余反应液放回恒温振荡培养箱中继续反应。上清液稀释20倍(稀释至400μl)，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-E所示，在反应进行4h时，白皮杉醇的产率最高，为74.7％。

实施例9考察扩大反应体系后白皮杉醇的产率

准确称取21％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入白藜芦醇的量为24％(wt.％)，L-抗坏血酸的量为55％(wt.％)，用25％(v/v％)的DMSO助溶，反应体积扩大到前面的12.5倍，在25℃，220rpm的恒温振荡培养箱中反应。反应0.5，1,2,3,4,5h后，取1ml反应液离心(6000rpm，1min)后取100μl上清液稀释20倍(稀释至2000μl)，其余反应液倒回反应体系。漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图7-F所示，扩大反应体系后在反应进行4h时，白皮杉醇的产率最高，为53.3％。

收集白皮杉醇峰对应的高效液相色谱流动相，旋转蒸发仪蒸干后固体用乙醇-水重结晶后得到粉红色固体。

产物的核磁表征数据为：¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：ppm 9.11(s，4H)，6.96(s，1H)，6.86(d，J＝10.9Hz，1H)，6.83(s，1H)，6.73(d，J＝4.0Hz，lH)，6.70(d，J＝3.8Hz，1H)，6.37(s，2H，4-H),6.11(s，1H)；结果如图8，经分析该产物确为白皮杉醇。

优选的转化条件为：无载体固定化酪氨酸酶30％(wt.％),反应温度20℃，白藜芦醇28％(wt.％)，L-抗坏血酸42％(wt.％)，反应时间4h。在该优选条件下，白皮杉醇的产率为74.7％。

实施例10HPLC测定3,4-二羟基苯乙酸浓度

高效液相色谱采用反向C18柱(日本GL Sciences，Inc公司，Inertsil ODS-SP，4.6×150mm，5μm)对3,4-二羟基苯乙酸含量进行测定，该液相条件为：流动相为/水/乙腈/冰醋酸＝87.5/12/0.5(v/v)；进样量：10μL；总流速为0.7ml/min；检测波长为278nm；柱温为29℃。

精确配制系列浓度的3,4-二羟基苯乙酸标准液，每个系列重复3次，经HPLC检测得到峰面积并取平均值，以3,4-二羟基苯乙酸浓度(X,mM)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的3,4-二羟基苯乙酸经适当稀释后以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量，如图9所示。

实施例11无载体固定化酶制备3,4-二羟基苯乙酸

考察酶量对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响。准确称取4.7％、9％、13％、16.5％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入到相应的4-羟基苯乙酸的量为28.7％、27.7％、26％、25.2％(wt.％)及对应的L-抗坏血酸的量为66.6％、63.3％、61％、58.3％(wt.％)的溶液中，在30℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，每1h取0.15ml反应液，跟踪5h。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-A所示，无载体固定化酪氨酸酶的用量在13％(wt.％)时，投入产出比最高，3,4-二羟基苯乙酸的产率为32.5％。

实施例12考察pH对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

准确称取13％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入到4-羟基苯乙酸的量为26％(wt.％)，L-抗坏血酸的量为61％(wt.％)，溶液用pH为4,5,6,7,8的磷酸缓冲液配制，在30℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-B所示，pH为5时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为32.5％。

实施例13考察温度对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

准确称取13％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入到4-羟基苯乙酸的量为26％(wt.％)和L-抗坏血酸的量为61％(wt.％)的溶液中，在25、30、35、40、45℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-C所示，反应温度为25℃时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为40.5％。

实施例14考察底物浓度对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

准确称取14.9％、13％、10.3％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶加入到相应的4-羟基苯乙酸的量为15.1％、26％、41.6％(wt.％)和对应的L-抗坏血酸的量为70％、61％、48.1％％(wt.％)的溶液中，在30℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。每个反应一式三份。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-D所示，底物的用量为15.1％时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为49.6％。

实施例15考察L-抗坏血酸对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

准确称取18.7％、15.3％、13％、11.2％、9.9％、8.1％、6.8％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶，加入到相应的4-羟基苯乙酸的量为37.7％、31％、26％、22.8％、20.3％、16.3％、13.7％(wt.％)及对应的L-抗坏血酸的的量为43.7％、53.8％、61％、66％、69.9％、75.6％、79.5％(wt.％的溶液中，在30℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-E所示，L-抗坏血酸的用量为53.8％(wt.％)时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为36.3％。

实施例16考察优选条件下时间与3,4-二羟基苯乙酸的产率之间的关系

准确称取13％(wt.％)的无载体固定化酪氨酸酶加入到4-羟基苯乙酸的量为26％(wt.％)和L-抗坏血酸的量为61％(wt.％)的溶液中，在25℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，1h后取0.15ml反应液，跟踪4h。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图10-F所示，在反应进行2h时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为40.5％。

优选的转化条件为：无载体固定化酪氨酸酶13％(wt.％),反应温度25℃，4-羟基苯乙酸26％(wt.％)，L-抗坏血酸61％(wt.％)，反应时间2h。在该优选条件下，3,4-二羟基苯乙酸的产率为40.5％。

实施例17酶溶液制备3,4-二羟基苯乙酸

考察酶量对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响。取2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％(v/v％)的酶溶液，加入到4-羟基苯乙酸的量为30.2％(wt.％)和L-抗坏血酸的量为69.8％(wt.％)的溶液中，在30℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，每1h取0.15ml反应液，跟踪4h。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-A所示，在酶溶液的用量为15％(v/v％)时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为39.9％。

实施例18考察pH对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

取15％(v/v％)酶溶液加入到4-羟基苯乙酸的量为30.2％(wt.％)和L-抗坏血酸的量为69.8％(wt.％)的溶液(溶液用pH为4,5,6,7,8的磷酸缓冲液配制)中，在30℃、200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-B所示，pH为6时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为42.5％。

实施例19考察温度对3,4-二羟基苯乙酸的产率的影响

取15％(v/v％)酶溶液加入到4-羟基苯乙酸的量为30.2％(wt.％)和L-抗坏血酸的量为69.8％(wt.％)的溶液中，在20、25、30、35、40和45℃，200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-C所示，反应温度为25℃时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为49.1％。

实施例20考察底物浓度对3,4-二羟基苯乙酸的产率之间的影响

取15％(v/v％)酶溶液加入到4-羟基苯乙酸的量为17.8％、30.2％、46.3％(wt.％)和相应的L-抗坏血酸的的量为82.2％、69.8％、53.7％(wt.％)的溶液中，在30℃、200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-D所示，底物的用量为17.8％时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为54.3％。

实施例21考察L-抗坏血酸对3,4-二羟基苯乙酸的产率之间的影响

取15％(v/v％)酶溶液加入到4-羟基苯乙酸的量46.3％、36.5％、30.2％、25.7％、22.4％、17.8％、14.7％(wt.％)和相应的L-抗坏血酸的的量为53.7％、63.5％、69.8％、74.3％、77.6％、82.2％、85.3％(wt.％)的溶液中，在30℃、200rmp的恒温振荡培养箱下反应，2h后取0.15ml反应液。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-E所示，L-抗坏血酸的用量为30.2％(wt.％)时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为43.9％。

实施例22考察优选条件下时间与3,4-二羟基苯乙酸的产率之间的关系

取15％(v/v％)酶溶液加入到4-羟基苯乙酸的量30.2％(wt.％)和L-抗坏血酸的的量为69.8％(wt.％)的溶液中，在25℃、200rmp的恒温振荡培养箱下反应，1h后取0.15ml反应液,跟踪4h。将取得的反应液加入0.45ml磷酸缓冲液(pH6.0 50mM)稀释4倍，漩涡震荡混合均匀后过滤，用HPLC检测底物和产物的含量。结果如图11-F所示，在反应进行2h时，3,4-二羟基苯乙酸的产率最高，为49.1％。

优选的转化条件为：氨酸酶溶液15％(v/v％),反应温度25℃，4-羟基苯乙酸30.2％(wt.％)，L-抗坏血酸69.8％(wt.％)，反应时间2h。在该优选条件下，3,4-二羟基苯乙酸的产率为49.1％。