本发明涉及农产品副产物综合利用技术领域，属于蛋白提取技术领域，更具体地说是涉及一种核桃粕蛋白的提取方法。
背景技术：
新疆是我国核桃的主要产区之一，近年来新疆核桃种植面积在不断扩大，对优良品种的选育和推广在不断加强，对低产林的改造也在加快进程，核桃产量在逐年攀升，2016年全国核桃产量将达到110万吨以上，占全球产量的50％以上。我国的核桃制品主要为核桃油、核桃乳、核桃粉等。
核桃在榨完油后所剩的残粕中含有30％以上的蛋白质，研究发现，在核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量都相当高。因此如能有效地利用核桃蛋白将具有很高的经济价值。我国的核桃制品主要有核桃油、核桃乳、核桃粉、核桃干等，产品单一，深加工产品较少。核桃在日常的生活和工业生产上的应用也越来越广泛，但是面临的问题也愈来愈明显。现在，我国核桃油生产厂家已达数十家，但是大多数厂家把榨油后的副产物当作饲料原料出售。对核桃蛋白粕进行深加工，才能提高其附加值，提高企业的经济效益，从而提高对核桃资源的综合利用率。目前核桃粕的提取手法主要是水提、超声波辅助提取等方法，蛋白提取率较低，应用有所局限。比如赵见军等，核桃粕中蛋白提取工艺的优化，《食品科学》2014年18期，是以冷榨核桃粕为原料，采用超声波辅助提取核桃粕中蛋白，核桃粕蛋白质的提取率达69.62％。因此，为充分利用我国的核桃资源并提高它的经济价值，提升核桃粕中蛋白提取率显得尤为重要。
亚临界水提取技术是近年来发展起来的新型提取技术。亚临界水又称超加热水、高压热水或热液态水，是指在一定的压力下，将水加热到100℃以上临界温度374℃以下的高温，水体仍然保持在液体状态。常温常压下水的极性较强，亚临界状态下，随着温度的升高，亚临界水的氢键被打开或减弱，从而使水的极性大大降低，由强极性渐变为非极性，其性质更类似于有机溶剂。这样就可以实现天然产物中有效成分从水溶性成分到脂溶性成分的连续提取，并可实现选择性提取。此外，由于亚临界水萃取是以价廉、无污染的水作为萃取剂，因此，亚临界水萃取技术被视为绿色环保、前景广阔的一项变项变革性技术。微波辅助亚临界水提取技术是新兴的提取技术，以微波加热为主要加温方式，通过高压使提取溶剂处于亚临界状态，对目标产物进行提取。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足和缺点，本发明的目的是提供一种核桃粕蛋白的提取方法，采用微波辅助亚临界水提取方法，以期能有效提高核桃粕蛋白提取效率，降低传统蛋白提取工艺中萃取溶剂残留，缩短萃取时间，提高目标提取蛋白物质活性，特别是其抗氧化活性提高20％以上。本发明的提取方法操作简便、高效安全，以使该方法适宜于在核桃加工企业中推广应用。
为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：
一种核桃粕蛋白的提取方法，按以下步骤进行：
(1)核桃粕原料：选取冷压榨后的核桃粕，干燥并粉碎过筛后用碱水浸泡，得到样品溶液，备用，所述的碱水是指pH值为7～9.5的蒸馏水，
(2)微波辅助亚临界水萃取：将样品溶液进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为100W～400W，萃取温度为110℃～180℃，萃取压力为6MPa～20MPa，时间为10min～40min，料液比为1：10mg/L～1：20mg/L，萃取后冷却，
(3)高速离心：将萃取处理后的样品冷却静置，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速3000r/min～5000r/min，时间10min～30min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体，
(4)二次微波辅助亚临界水萃取：将样品一次萃取剩余的残渣进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为100W～400W，萃取温度为110℃～180℃，萃取压力为6MPa～20MPa，时间为10min～40min，料液比为1：5mg/L～1：15mg/L，萃取后冷却；高速离心，收集上清白色蛋白液体，合并两次上清白色蛋白液体，
(5)蛋白沉淀和水洗：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点，搅拌均匀后自然沉降；等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白，加入去离子水，搅拌洗涤，水温控制45℃～50℃，然后离心，收集沉淀物，得到精制蛋白，
(6)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，然后进行喷雾干燥，得到核桃蛋白粉。
本发明对核桃油加工的副产物—核桃粕使用微波辅助亚临界水提取核桃蛋白，对核桃粕进行综合利用，提高了核桃的加工水平和商品价值，拓宽了核桃的应用范围，提高了核桃产品附加值和市场竞争力，同时避免了资源的浪费，减少了环境的污染。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(1)中将核桃粕置于40℃～50℃干燥箱中进行干燥处理10h～15h，然后粉碎过筛(15-35目为宜)。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(2)中：萃取前料液需充分混匀，采用涡旋震荡30S～150S。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(4)中：萃取前需将离心后压实的残渣充分搅拌，使其分散，料液混匀，采用涡旋震荡60S～200S。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(5)中蛋白液体等电点时的pH值为4.4～4.5；搅拌均匀后自然沉降60min～100min。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(6)中：用纯水溶解精制蛋白，使固形物含量为10％～15％；喷雾干燥的主要工艺参数包括：喷雾压力4MPa，进风温度150℃～180℃，出口温度60℃～80℃。
作为优选方案，根据本发明所述的一种核桃粕蛋白的提取方法，其中，所述的步骤(6)中：核桃蛋白粉的水分含量低于5％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提出的一种微波辅助亚临界水提取核桃粕蛋白的方法，采用亚临界水提取技术，与传统的提取方法相比，具有提取效率高的特点，较超声波提取效率高60％以上(图1)，提取时间短，较普通超声波水提法，提取时间缩短一倍以上，生产周期短。
(2)本发明提出的一种微波辅助亚临界水提取核桃粕蛋白的方法，不仅可以提高资源利用价值，还可以减少污染，提升新疆核桃种植和加工产业的整体经济效益，在一带一路的发展中发挥积极的作用。
(3)本发明提出的一种微波辅助亚临界水提取核桃粕蛋白的方法，提取液中杂质含量较低，核桃自身风味好，品质高，更加适合作为食品中间加工品，用于其他食品添加等。
(4)本发明提出的一种微波辅助亚临界水提取核桃粕蛋白的方法，克服了传统蛋白提取工艺中萃取溶剂残留、萃取时间过长造成的成分破坏，得到的蛋白抗氧化活性提高20％以上，提取后污染小，蛋白纯度高达95％；本发明提取效率高，溶剂用量少，产品得率高，易于工业化生产。
附图说明
图1是不同提取方法(常规碱溶液浸提，超声波提取，本发明方法)的核桃粕蛋白提取率曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
实施例中选用的核桃为新疆紫皮大核桃，采自新疆阿克苏市。
实施例1
一种核桃粕蛋白的提取方法，按以下步骤进行：
(1)选取新疆核桃仁冷压榨后的核桃粕，要求颗粒大小、色泽均一，无发霉，有核桃粕特有香味。将核桃粕置于45℃干燥箱中进行干燥处理12h，粉碎过筛(25目)，然后用pH值为9的蒸馏水浸泡，得到样品溶液，备用，
(2)微波辅助亚临界水提取一次萃取：萃取前料液需充分混匀，采用涡旋震荡100S，再将样品溶液进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为300W，萃取温度160℃，萃取压力15MPa，时间30min，料液比1:15mg/L，萃取后冷却，
(3)高速离心：将一次萃取处理后的样品冷却静置30min，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速4000r/min，时间25min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体，
(4)微波辅助亚临界二次萃取：萃取前需将离心后压实的残渣充分搅拌，使其分散，料液混匀，采用涡旋震荡120S，再将样品一次萃取剩余的残渣进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为300W，萃取温度160℃，萃取压力15MPa，时间30min，料液比1:10mg/L，萃取后冷却；高速离心，收集上清白色蛋白液体。合并两次上清白色蛋白液体，
(5)蛋白沉淀：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点(pH 4.5)，搅拌均匀后自然沉降80min；
(6)蛋白离心水洗：等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白。加入去离子水，在萃取罐中搅拌洗涤，水温控制在45℃；然后5500r/min离心10min，收集沉淀物，得到精制蛋白，
(7)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，固形物含量15％，进行喷雾干燥，其中：喷雾压力4MPa，进风温度160℃，出口温度80℃。收集干粉，得到核桃蛋白粉。检测该核桃蛋白粉的水分含量为5％以下，得到的蛋白抗氧化活性提高20％，纯度不低于95％。
比较例1超声波蛋白提取方法
(1)选取新疆核桃仁冷压榨后的核桃粕，要求颗粒大小、色泽均一，无发霉，有核桃粕特有香味。将核桃粕置于45℃干燥箱中进行干燥处理12h，粉碎过筛(25目)。然后用pH值为9的蒸馏水浸泡，得到样品溶液，备用，
(2)超声波萃取：将样品溶液进行超声波提取，超声功率为500W，料液比1:15mg/L，超声处理30min，之后恒温搅拌提取3h，萃取后冷却。
(3)高速离心：将萃取处理后的样品冷却静置30min，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速4000r/min，时间25min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体。
(4)蛋白沉淀：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点(pH 4.5)，搅拌均匀后自然沉降80min；
(5)蛋白离心水洗：等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白。加入去离子水，在萃取罐中搅拌洗涤，水温控制在45℃；然后转速5500r/min下离心10min，收集沉淀物，得到精制蛋白，
(6)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，固形物含量15％，进行喷雾干燥，其中：喷雾压力4MPa，进风温度160℃，出口温度80℃。收集干粉，得到核桃蛋白粉。
比较例2常规浸提蛋白提取方法
(1)选取新疆核桃仁冷压榨后的核桃粕，要求颗粒大小、色泽均一，无发霉，有核桃粕特有香味。将核桃粕置于45℃干燥箱中进行干燥处理12h，粉碎过筛(25目)。
(2)浸提：料液比1:15mg/L，提取液pH9(蒸馏水)，浸提温度为65℃，混匀后将溶液进行搅拌，搅拌速度为50r/min，处理3h，浸提后冷却。
(3)高速离心：将浸提处理后的样品冷却静置30min，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速4000r/min，时间25min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体。
(4)蛋白沉淀：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点(pH 4.5)，搅拌均匀后自然沉降80min。
(5)蛋白离心水洗：等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白。加入去离子水，在萃取罐中搅拌洗涤，水温控制在45℃；然后转速5500r/min下离心10min，收集沉淀物，得到精制蛋白。
(6)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，固形物含量15％，进行喷雾干燥，其中：喷雾压力4MPa，进风温度160℃，出口温度80℃。收集干粉，得到核桃蛋白粉。
将实施1、比较例1和比较例2按照凯氏定氮法GB/T 14489.2-1993《油料粗蛋白质的测定法》进行蛋白提取率的检测。
实施例1、比较例1和比较例2的蛋白提取率的测定结果如图1所示。可以看出，本发明方法能有效提升蛋白质的提取效率。使用常规浸提方法，核桃粕提取率最低，提取率为45％±5％；使用超声波辅助提取后，提取率有明显的提升，达到了62％±5％；从图1中可见，使用本发明方法能有效提高提取率，其蛋白提取率达到了82％±5％。表明本发明能显著提高核桃粕蛋白的提取效率，应用于工业生产，效益显著。
实施例2
一种核桃粕蛋白的提取方法，按以下步骤进行：
(1)选取新疆核桃仁冷压榨后的核桃粕，要求颗粒大小、色泽均一，无发霉，有核桃粕特有香味。将核桃粕置于50℃干燥箱中进行干燥处理10h，粉碎过筛(15目)，然后用pH值为7的蒸馏水浸泡，得到样品溶液，备用，
(2)微波辅助亚临界水提取一次萃取：萃取前料液需充分混匀，采用涡旋震荡30S，再将样品溶液进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为100W，萃取温度110℃，萃取压力6MPa，时间40min，料液比1:20mg/L，萃取后冷却，
(3)高速离心：将一次萃取处理后的样品冷却静置30min，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速5000r/min，时间10min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体，
(4)微波辅助亚临界二次萃取：萃取前需将离心后压实的残渣充分搅拌，使其分散，料液混匀，采用涡旋震荡120S，再将样品一次萃取剩余的残渣进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为400W，萃取温度180℃，萃取压力20MPa，时间40min，料液比1:5mg/L，萃取后冷却；高速离心，收集上清白色蛋白液体。合并两次上清白色蛋白液体，
(5)蛋白沉淀：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点(pH 4.4)，搅拌均匀后自然沉降60min；
(6)蛋白离心水洗：等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白。加入去离子水，在萃取罐中搅拌洗涤，水温控制在45℃；然后5500r/min离心10min，收集沉淀物，得到精制蛋白，
(7)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，固形物含量10％，进行喷雾干燥，其中：喷雾压力4MPa，进风温度180℃，出口温度80℃。收集干粉，得到核桃蛋白粉。检测该核桃蛋白粉的水分含量为5％以下，得到的蛋白抗氧化活性提高20％，纯度不低于95％。
经检测可达到实施例1的技术效果，此处不再一一赘述。
实施例3
一种核桃粕蛋白的提取方法，按以下步骤进行：
(1)选取新疆核桃仁冷压榨后的核桃粕，要求颗粒大小、色泽均一，无发霉，有核桃粕特有香味。将核桃粕置于40℃干燥箱中进行干燥处理15h，粉碎过筛(35目)，然后用pH值为9.5的蒸馏水浸泡，得到样品溶液，备用，
(2)微波辅助亚临界水提取一次萃取：萃取前料液需充分混匀，采用涡旋震荡150S，再将样品溶液进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为400W，萃取温度180℃，萃取压力20MPa，时间10min，料液比1:10mg/L，萃取后冷却，
(3)高速离心：将一次萃取处理后的样品冷却静置30min，样液配平后放入高速离心机内，设置参数转速3000r/min，时间30min，去除油层和下层沉底，收集上清白色蛋白液体，
(4)微波辅助亚临界二次萃取：萃取前需将离心后压实的残渣充分搅拌，使其分散，料液混匀，采用涡旋震荡200S，再将样品一次萃取剩余的残渣进行亚临界提取，主要工艺参数包括：微波功率为100W，萃取温度110℃，萃取压力6MPa，时间10min，料液比1:15mg/L，萃取后冷却；高速离心，收集上清白色蛋白液体。合并两次上清白色蛋白液体，
(5)蛋白沉淀：用HCl和NaOH调整蛋白液体等电点(pH 4.5)，搅拌均匀后自然沉降100min；
(6)蛋白离心水洗：等电点调整后的蛋白浑浊液，离心分离得到粗蛋白。加入去离子水，在萃取罐中搅拌洗涤，水温控制在50℃；然后5500r/min离心10min，收集沉淀物，得到精制蛋白，
(7)喷雾干燥：用纯水溶解精制蛋白，固形物含量15％，进行喷雾干燥，其中：喷雾压力4MPa，进风温度150℃，出口温度60℃。收集干粉，得到核桃蛋白粉。检测该核桃蛋白粉的水分含量为5％以下，得到的蛋白抗氧化活性提高20％，纯度不低于95％。
经检测可达到实施例1的技术效果，此处不再一一赘述。