一种检测人乳头状瘤病毒的PCR试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及一种检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒及其制备方法，属于人乳头状瘤病毒亚型的检测领域。本发明涉及应用多重实时荧光定量pcr技术在四个pcr反应管中同时快速地定型定量检测13种人乳头状瘤病毒的方法。

背景技术：

人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)是一种双链dna病毒，属于乳头瘤病毒属，是一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。目前，hpv已被发现的亚型有接近两百种，其中大部分感染人类后并没有表现出明显的症状，少数部分有病理表现，有些可能会引起人类疣，如生长在生殖器附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣。一些高危亚型会引起人类的肿瘤，导致宫颈癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌等的发生。其中超过30种hpv亚型的传播是通过性接触而引起生殖区的病变。

hpv感染是宫颈癌的直接病因，从感染到最终宫颈癌的发生对大多数患者而言有一个缓慢的潜伏期。因此，及时定期对宫颈脱落细胞进行hpv的检测在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。目前hpv的诊断完全依赖于临床标本中hpvdna的检测。hpv分型与临床的结合研究已经证实不同的hpv基因型和不同的病毒载量有着不同的致癌性，因而hpvdna的分型定量检测对宫颈癌及女性生殖道肿瘤的病因学和癌前预报具有重要的意义。

在1995年的iarc专题讨论会上确定了hpv某些亚型长期和反复地感染hpv是宫颈癌发生的主要原因。目前，人类把与宫颈癌发生有关的hpv亚型称为高危亚型，有hpv16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等；与肿瘤不相关的称为低危亚型，最常见的为hpv6，11和44等。

由于hpv至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学鉴定和分子生物学检测技术。目前hpv检测方法主要有组织细胞病理学检测、斑点印迹法、荧光原位杂交法、southern杂交法、多聚合酶链反应法(polymerasechainreaction,pcr)和杂交捕获法等。细胞学法敏感度和特异度较低，斑点印迹法具有放射性。敏感度较高的方法有原位杂交与传统pcr法，但核酶印迹原位杂交法复杂，传统pcr法特异性很低，假阳性率较高，不宜大规模临床使用。

目前hc-ii是一通过食品和药物管理局(fda)批准的可临床使用的检测hpvdna的技术，但其不能对hpv进行具体定量，且存在交叉杂交产生感染的问题。

多重实时荧光定量pcr技术不仅可以检测具体病毒型别还可以检测病毒负荷量，是一个有较大发展前景的方法。针对现有方法的缺点和不足，我们通过不断的努力，将各种检测方法有机结合，取长补短，研发出简单、快速、方便、价廉，且敏感性、特异性很高的hpv检测方法并应用于宫颈癌的筛查中。

以荧光标记探针为基础的实时荧光pcr技术，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。在采用探针法的实时荧光pcr反应体系中，根据所检测病原体的种类，还可以分为单重或多重实时荧光pcr技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性pcr引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(reporter,r)，如fam、vic、rox等，3′端标记有荧光淬灭基团(quencher,q)，如bhq1、bhq2、tamra等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taqdna聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个pcr循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。采用实时荧光pcr技术检测hpv各亚型的关键是需要设计出能够特异、灵敏的检测出各亚型的pcr引物及探针。

目前市场上有两类hpv诊断试剂盒,一类是用pcr荧光法和单一荧光染料生产hpv诊断试剂盒，由于产品中所有的探针分子都使用相同的荧光染料，这种产品不能分辨出hpv亚型类别，也无法检测出hpv不同亚型的量。另一类产品是用杂交蒱捉或基因芯片法生产的，这种产品能分辨出各种不同的hpv亚型类别，但不能检测出它们的量。此外基因芯片法的试剂盒，操作复杂、测试时间长、成本高、不易推广。

专利号为zl201110087602.1的专利提供了检测人乳头状瘤病毒亚型的荧光pcr试剂盒，其保护了一种检测人乳头状瘤病毒21种亚型的荧光pcr试剂盒，但其可检测的乳头状瘤病毒有限，且不能定量出每个亚型hpv病毒负荷量。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种能够准确的检测出高危亚型人乳头状瘤病毒的试剂盒及其制备方法，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高的优点，而且可以定量检测。

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒及其制备方法，其采用的技术方案如下：

检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒采用多重荧光探针pcr技术对宫颈脱落胞标本的hpv(人乳头状瘤病毒)基因组dna的特异性核酸序列扩增并检测，从而判断是否感染对应的13种亚型,并通过世卫组织确认的标准参考基因与待测细胞的线性关系获得13种亚型在单位细胞中的载量。本系列试剂盒独有的采用了四重荧光定量pcr技术，分为4管，每管分为fam、hex、rox、cy5四个通道区分亚型。

检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒，包括以下各组分：特异性引物，特异性taqman探针，taq酶，pcr反应液,阳性参考品，阴性参考品，核酸萃取液，其特征在于：所述的pcr反应液分四管，每管采用了四重taqman探针实时荧光pcr技术，对宫颈脱落细胞中的13种人乳头状瘤病毒基因组dna的特异性核酸序列扩增并分型检测，所述的四管pcr反应液分别为：101-i用于4种中国人常见高危hpv(16,18,58,52)亚型的分型和定量测定，101-ii用于对中国人较常见的3种高危hpv(39,31,35)亚型的分型和定量测定，101-iii和101-iv用于中国人不常见的6种hpv(68，45，59，56，51，33)高危hpv亚型的分型和定量测定以及作为内参的人类正常基因。

优选的，所述的特异性taqman探针：

hpv16探针-ctgacatatctacttgagaamctag；

hpv18探针-tactacacagtytcgtgtacctgg；

hpv31探针-tagtactaatatgtctatktgtgctacaa；

hpv33探针-tgacttaatgcgcacaagtaactagtgccag；

hpv35探针-tcggtgtgtcctgctgggtctwctagtgcc；

hpv39探针-ccaacttgacatgatcttcctctatagagtgttcc；

hpv45探针-ttctgtggctctacacaacmtcctgtcc；

hpv51探针-ttcaactattagtactgccactgctgc；

hpv52探针-tcgccatgacgaaggtagtcctta；

hpv56探针-caagccaaaacaccaatgttgcagacacat；

hpv58探针-tgccattatgcacggaagtaamtaatgaag；

hpv59探针-tcaacatgtctggcatatacyttaagagt；

hpv68探针-tcctcaacatgcctaatatattccttcaa。

优选的，所述的特异性taqman探针其对应的特异性引物分别如下：

hpv16上游引物5’-catgacgtaggtattccttagagtt-3’；

hpv16下游引物5’-ctgatgttgatgctacacgcaatac-3’；

hpv18上游引物5’-tatgttagtgtgatagattctac-3’；

hpv18下游引物5’-gacaaatagactgtaaatcatagtc-3’；

hpv31上游引物5’-gagcaatcagttagttgttaccgt-3’；

hpv31下游引物5’-aaatgccaatcaaattcgtca-3’；

hpv33上游引物5’-gagcaatcagttattcgttacggt-3’；

hpv33下游引物5’-gaaatttaaactgtttatcatattctcc-3’；

hpv35上游引物5’-agctgatacaccggtagtac-3’；

hpv35下游引物5’-caccatggcttaactattgctt-3’；

hpv39上游引物5’-attcaattattgcttactgttgtgt-3’；

hpv39上游引物5’-ataggttgcaaatcaatctcgtgc-3’；

hpv45上游引物5’-gcgtaaccagttgtttgttactgtag-3’；

hpv45下游引物5’-aagtcatattactccacatgact-3’；

hpv51上游引物5’-catgtgttgatattaccagaagtcc-3’；

hpv51下游引物5’-ataagttgcatatcatactcatgc-3’；

hpv52上游引物5’-tatgtcacagttgtagataccac-3’；

hpv52下游引物5’-gaaatataaatagtaaatcatattc-3’；

hpv56上游引物5’-ctgcatactttagtgctgttgg-3’；

hpv56下游引物5’-acacatactgacagttacttgac-3’；

hpv58上游引物5’-tatgttagcgtggttgatagcac-3’；

hpv58下游引物5’-gaaatacaaactgaaagtcatatgc-3’；

hpv59上游引物5’-agactagtcgcagcacctatct-3’；

hpv59下游引物5’-gacatataaactgcaactcaaattc-3’；

hpv68上游引物5’-actatgttatagtacacaacgta-3’；

hpv68下游引物5’-acgttgtctactactgctgaagc-3’。

优选的，所述的试剂盒对13种phv病毒进行进行定性分辨的步骤如下：

第一步：将待测细胞样本和试剂盒中核酸萃取液按照1:1比例混合在离心管中，混匀，室温静置5-10分钟后，500-1000rpm离心1-2分钟，用移液枪吸取含dna的全部上清液，将所得到含有dna溶液立刻用于实时荧光pcr扩增实验，或者置于－20℃保存；

第二步：取出hpv诊断剂，完全退冰溶解，溶解后的含试剂离心管在漩涡混匀震动2-3分钟；

第三步：用10-100ul移液器在第二步所述的离心管中吸取一人份的hpv诊断剂i、ii、iii或iv放入到实时荧光定量pcr仪要求的标准八联管；然后用0.1-2.5ul移液器吸取0.2ulhot+taq酶加入到前述的八联管；用0.1-2.5ul移液器从第一步制作的核酸样本吸取2ul加入到前述八联管中；在漩涡混匀仪上微震上述八联管1-2分钟，然后放在掌上离心机上离心1-2分钟，静置待上机；

第四步：重复步骤三制备阴性水待测样本；重复步骤三制备标准内参待测样本。

第五步：将第三步和第四步制备的待测样本八联管放入仪器的检测样本位置，进行实时荧光pcr扩增；报告荧光通道选择fam、hex、rox和cy5；设置程序为热盖温度105℃，加液量为20ul；运行程序：

恒温段：95℃，4min；循环段：95℃，30s；55℃，40s。

第六步：根据仪器自动读取阈值及达到阈值的ct值与标准值比较判断是否感染13种phv病毒病毒。

优选的，所述的试剂盒对13种phv病毒进行定量检测，其具体技术方案如下：

第一步：标准质粒梯度稀释：对hpv试剂盒中的13个hpv标准质粒和内参品xb质粒，用高纯化水依次10陪梯度稀释，获得50ul的5个不同浓度的质粒样本,放入标有不同浓度的5个离心管；

第二步：对5个不同浓度的同种质粒进行taqman探针单重实时荧光pcr扩增，获得达到阈值的5个不同ct值；

第三步：用第二步所得的5个ct值和相对应的5个copies浓度值建立其hpv亚型的标准校正曲线，并计算出校正曲线的斜率ax；第四步：在hpv样本taqman探针实时荧光pcr扩增实验中获得其hpvct值，这一值除以第三步中对应质粒亚型的校正曲线的斜率ax便是该hpv亚型负荷量(copies浓度)mx；

第五步：重复以上第四步,获得相同hpv样本中人类正常基因负荷量(copies浓度)mxb；

第六步：通过公式m＝mx/mxb,计算出该hpv感染样本中，单位人类正常基因xb中的hpv亚型病毒负荷量(copies浓度)。

所述的101-iv若分型和定量检测所有的hpv高危亚型,系列产品101-i,101-ii，101-iii和101-iv需同时使用；若分型和定量常见及较常见的hpv高危亚型，系列产品中的101-i和101-ii需同时使用；若分型和定量常见的hpv高危亚型，只需使用101-i产品。

本发明的有益效果在于：检测准确度高而且可以定量检测。本发明是一种能在早期快速、简便、有效的检测临床最常见的13种属于高危以及高危亚型但中国人不常见的hpv病毒的多重实时荧光定量pcr检测方法。分型定量分析hpv-16,18,58,52，39,31,35，68，45，59，56，51，33采用合并定型分析，而且不同亚型检测互不干扰，证明其特异性较好；随机检测50个临床样本，与凯普同类产品检测试剂盒的结果进行对比，符合度达到99％，且与测序结果一致；重复性好。本发明为体外诊断试剂，不含任何有害成分，与受检者无直接接触，安全可靠。试剂盒中所采用的内参考品为质粒dna，阴性参考品为空白质粒，pcr反应液(pcrmastermixbuffer)中主要成分为无害的taqdna聚合酶、盐和水组成，以上对人体不存在安全性问题。

附图说明

图1为本发明提供的检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒的生产工艺流程图。

图2为检测人乳头状瘤病毒试剂盒的hpv诊断剂-101i的rt-pcr曲线，图中4条从上至下

图3为检测人乳头状瘤病毒试剂盒的hpv诊断剂-101ii的rt-pcr曲线，图中3条从上至下曲线分别是hpv39，31，35检测实时荧光rt-pcr曲线，hpv39，ct＝15.1；hpv31，ct＝19.8；hpv35，ct＝23.5。

图4为检测人乳头状瘤病毒试剂盒的hpv诊断剂-101iii的rt-pcr曲线，图中4条从上至下曲线分别是hpv68，45，59，56检测实时荧光rt-pcr曲线，hpv68，ct＝17.1，hpv45，ct＝18.2；hpv59，ct＝18.3；hpv56，ct＝26.5。

图5为检测人乳头状瘤病毒试剂盒的hpv诊断剂-101iv的rt-pcr曲线，图中3条从上至下曲线分别是xb，hpv51，33检测实时荧光rt-pcr曲线，xb，ct＝15.2；hpv51，ct＝17.3；hpv33，ct＝17.4。

图6为hpv16标准曲线。

图7为hpv18标准曲线。

图8为hpv52标准曲线。

图9为hpv58标准曲线。

图10为hpv33标准曲线。

图11为hpv31标准曲线。

图12为hpv35标准曲线。

图13为hpv39标准曲线。

图14为hpv45标准曲线。

图15为hpv51标准曲线。

图16为hpv56标准曲线。

图17为hpv59标准曲线。

图18为hpv68标准曲线。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明提供的技术方案，下面结合附图和具体的实施例做进一步的说明。

检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒，包括以下各组分：特异性引物，特异性taqman探针，taq酶，pcr反应液,阳性参考品；阴性参考品，核酸萃取液，其特征在于：所述的pcr反应液分四管，每管采用了四重taqman探针实时荧光pcr技术，对宫颈脱落细胞中的13种人乳头状瘤病毒基因组dna的特异性核酸序列扩增并分型检测，所述的四管pcr反应液分别为：101-i用于4种中国人常见高危hpv(16,18,58,52)亚型的分型和定量测定，101-ii用于对中国人较常见的3种高危hpv(39,31,35)亚型的分型和定量测定，101-iii和101-iv用于中国人不常见的6种hpv(68，45，59，56，51，33)高危hpv亚型的分型和定量测定以及作为内参的人类正常基因。

实施例

【核酸dna样本萃取】

1.1将待测细胞样本和试剂盒中核酸萃取液-101或者-303按照1:1比例混合在1.5ml离心管。

1.2移液枪头吸打6-10次混匀，室温静置5-10分钟后，500-1000rpm离心1-2分钟。

1.3用移液枪吸取含dna的全部上清液。将所得到含有dna溶液立刻用于实时荧光pcr扩增实验，或者置于－20℃保存。

【适用仪器】

abiprism7500,vii；博日9600；slan荧光定量pcr检测系统4通道以上仪器以及罗氏的lc480ii仪器。

【hpv亚型定性分辨】

1.待检样本制备

1.1从-20℃or-70℃冰柜中取出hpv诊断剂-101或者hpv诊断剂-303离心管，完全退冰溶解。

1.2溶解后的含试剂离心管在漩涡混匀震动2-3分钟。

1.3用10-100ul移液器在1.2中的离心管中吸取18ul(一人份)的hpv诊断剂-101试剂

i、ii、iii或iv放入到实时荧光定量pcr仪要求的标准八联管。

1.4用0.1-2.5ul移液器吸取0.2ulhot+taq酶加入到1.3的八联管。

1.5用0.1-2.5ul移液器从萃取的核酸样本吸取2ul加入到1.4中的八联管中。

1.6在漩涡混匀仪上微震1.5中八联管1-2分钟，然后放在掌上离心机上离心1-2分钟，静置待上机。

1.7重复以上1.3-1.6制备阴性水待测样本。

1.8重复以上1.3-1.6制备标准内参待测样本

2.实时荧光pcr扩增

2.1根据仪器操作说明书，在实时荧光pcr仪上选择报告荧光通道fam、hex、rox和cy5。

2.2根据仪器操作软件，设置程序为热盖温度105℃，加液量为20ul；运行程序：恒温段：95℃，4min；循环段：95℃，30s；55℃，40s。

2.3根据仪器操作说明书，将1.6，1.7和1.8待测样本八联管放入仪器的检测样本位置，进行实时荧光pcr扩增。

【适用仪器】中的几个仪器自动读取阈值及达到阈值的ct值。

根据下表分析判断hpv亚型定性分辨质量。

表2hpv亚型定性分辨质量标准

注：ct＝36为检测的临界值；若ct>36,无法判断结果，说明核酸提取或者实时荧光pcr

检测存在问题。重新提取10倍浓度高的核酸进行检测实验，若ct值还大于临界值判断为阴性。

【hpv亚型病毒负荷定量检测】

1标准质粒梯度稀释

1.1对hpv诊断剂-101试剂盒中的13个hpv标准质粒(10¹⁰copies/ml)和内参品xb质粒(10¹⁰copies/ml)，用高纯化水依次10陪梯度稀释，获得50ul的5个不同浓度的质粒样本,放入标有不同浓度的5个离心管:

a.10¹⁰copies/ml；b.10⁹copies/ml；c.10⁸copies/ml；d.10⁷copies/ml；

e.10⁶copies/ml。

2待测样本制备

2.1按照【hpv亚型定性分辨】中1.3-1.4操作，制备5个八联管样本。

2.2对于每个hpv亚型质粒和内参质粒，用0.1-2.5ul移液器分别从1.1中离心管吸取1ul5

个不同浓度的质粒，分别加入到2.1的5个八联管。

2.3在漩涡混匀仪上微震2.2中八联管1-2分钟，然后放在掌上离心机上离心1-2分钟，静置待上机。

2.4重复以上2.1-2.3制备阴性水待测样本

3.实时荧光pcr扩增

按照【hpv亚型定性分辨】2进行。

4.定量结果计算

4.1对于每个hpv亚型，例如hpv16,从实时荧光pcr扩增曲线读取达到阈值的5个不同浓度ct值。

4.2以4.1中的ct值作纵坐标，1.1中的质粒浓度作横坐标，建立标准校正曲线。如图6的hpv16标准校正曲线。

从图6中计算校正曲线的斜率a16，用同样的方法分别获得其它12个高危hpv亚型的校正曲线斜率及内参xb质粒校正斜率：a16、a18、a31、a33、a35、a39、a45、a51、a52、a56、a58、a59、a68及ar。

4.3在以【hpv亚型定性分辨】3部分，我们获得hpv样本实时荧光pcr扩增的ct值，这一值除以其对应亚型质粒的校正曲线的斜率便是hpv亚型负荷量(copies浓度)。

m16＝ct16/a16┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈(1)

同样的方法，计算xb的负荷量。

mr＝ctr/ar┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈(2)

把单位人类正常基因xb中的hpv亚型病毒负荷量作为定量标准，

通过公式(3)获得”。

m＝m16/mrr┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈(3)

用以上公式1),2)和3)计算出单位人类基因xb中其它12种hpv亚型病毒负荷量。

式中：

数字—hpv亚型

m—负荷量；

ct—所得ct值；

a—斜率；

r—内参。

由以上检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒的质量标准如图2所示，其保存于-20℃，有效期为12个月，其内参考品的符合率为本试剂盒内参考品检测结果不得出现假阴性；阴性参考品的符合率:本试剂盒阴性参考品检测结果不得出现假性；对hpv亚型定量的技术质量标准如下：

a.本试剂盒对质粒的最低检测限度/灵敏度：1x104copies/ml；

b.阳性标准质粒浓度在1x104-1x108copies/ul,对应的荧光pcr检测ct值：16<ct<32。

本试剂盒使用了含有taqman探针的多重实时荧光pcr技术。pcr(polymerasechainreaction)即聚合酶链式反应，是指在dna聚合酶催化下，以母链dna为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程。taqman探针实时荧光pcr技术是在pcr反应中，引入了一个5’末端连接荧光报告染料，3’末端连接荧光淬灭分子的dna探针；当在pcr延伸扩增中，体系中的taq酶切断探针分子，使得与淬灭分子分离后的报告染料分子发出荧光；每经过一个pcr扩增循环，就会收集到一个荧光强度信号，随着pcr产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。因此，通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板dna定性及定量的分析。多重技术是在taqman探针实时荧光pcr反应体系里加入二对以上引物，一个以上taqman探针，同时扩增和定量出多个核酸片段的pcr反应。基于以上的技术原理，本试剂盒分四管，每管采用了四重taqman探针(fam、hex、rox、cy5)实时荧光pcr技术,对宫颈脱落细胞中的13种人乳头状瘤病毒(humanpapillomavims,hpv)基因组dna的特异性核酸序列扩增并分型检测。

图2-图14分别各类型乳头状瘤病毒的pcr标准校正曲线。

图15-图18分别为检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒诊断剂-101i、ii、iii、iv的rt-pcr曲线。

本发明的有益效果在于：检测准确度高而且可以定量检测。本发明是一种能在早期快速、简便、有效的检测临床最常见的13种属于高危以及高危亚型但中国人不常见的hpv病毒的多重实时荧光定量pcr检测方法。分型定量分析hpv-16,18,58,52，39,31,35，68，45，59，56，51，33采用合并定型分析，而且不同亚型检测互不干扰，证明其特异性较好；随机检测50个临床样本，与凯普同类产品检测试剂盒的结果进行对比，符合度达到99％，且与测序结果一致；重复性好。本发明为体外诊断试剂，不含任何有害成分，与受检者无直接接触，安全可靠。试剂盒中所采用的内参考品为质粒dna，阴性参考品为空白质粒，pcr反应液(pcrmastermixbuffer)中主要成分为无害的taqdna聚合酶、盐和水组成，以上对人体不存在安全性问题。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式之一，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。