冬凌草甲素衍生物及其制备和应用的制作方法

本发明涉及冬凌草甲素的衍生物及其在制药中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

冬凌草甲素具有较强的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞具有抑制增殖和促凋亡作用，其分子中与环外亚甲基共轭的环戊酮结构是其抗癌活性中心，对白血病、肝癌、食管癌、结肠癌、肺癌等均有一定的疗效。然而冬凌草甲素难溶于水，吸收率低，体内生物半衰期短，这些缺陷都影响了其临床疗效。目前，其有关制剂的临床抗癌疗效并不理想。因此，需要寻求新的方法以增加冬凌草甲素水溶性、改善其生物利用度，从而提高其抗癌疗效。

文献报道含有磷酰二胺结构的化合物可以在DT-心肌黄酶作用下代谢成，杀死癌细胞（J. Med.Chem.2002,45, 3540.）。另有文献报道，在抗癌药物中，引入季铵盐结构，可以增强药物的靶向性，例如，用来治疗软骨肉瘤的前药苯丙氨酸氮介季铵盐（J. Med.Chem.2002,45, 2116.）。引入季铵盐还可以改善药物的溶解度，因此，本发明设计了所述冬凌草甲素衍生物，以期获得具有双重作用的抗癌药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种冬凌草甲素衍生物和其药学可接受的盐，包括其立体异构体和互变异构体，其具有较好的水溶性和抗癌活性。

本发明的另一目的在于提供上述冬凌草甲素衍生物和其药学可接受的盐，包括其立体异构体和互变异构体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述冬凌草甲素衍生物和其药学可接受的盐，包括其立体异构体和互变异构体的用途。

以下对本发明进行详细描述。

本发明提供的冬凌草甲素衍生物和其药学可接受的盐，包括其立体异构体和互变异构体，结构如下所示：

式中，R₁为烷基、环烷基、取代烷基、芳基；R₂，R₃为烷基、环烷基、芳基、含杂原子的环烷基。

所述的冬凌草甲素衍生物代表性的结构实例如下：

本发明还提供的上述化合物的制备方法如下式所示：

式中，R₁为烷基、环烷基、取代烷基、芳基；R₂，R₃为烷基、环烷基、芳基、含杂原子的环烷基。

本发明的冬凌草甲素衍生物和其药学可接受的盐，包括其立体异构体和互变异构体，具有较好的水溶性和治疗癌症的作用。

通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

具体实施方式

实施例1

化合物（1）的制备

在氮气保护下，-78℃，将6.0mL(6.0mmol)LiN(TMS)₂加入1.97g（5.0mmol）冬凌草甲素的THF溶液中，搅拌5min后，慢慢滴加1.55g（6.0mmol）氮芥磷酰二氯，保温反应1h，升温至-20℃，加入10mL二甲胺溶液,保温反应1h, 稀盐酸调pH6，乙酸乙酯萃取，浓缩，得Ia白色固体，收率45%。

将1.25g（2.0mmol）Ia和163mg（2.0mmol）二甲胺盐酸盐混合于无水乙醇中，加入277.2mg（3.3mmol）NaHCO₃粉末，回流6h，冷却，过滤，滤液浓缩至干，乙酸乙酯洗涤，粗品用乙醇-乙酸乙酯重结晶，得化合物（1），收率80.2%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 1.13 (s, 6H), 2.23 (s, 6H), 3.08 (s, 6H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.35-3.37 (m, 4H), 3.43-3.47 (m, 4H), 3.80 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 4.05 (s, 1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s，1H), 5.81 (s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s,1H)。MS (ESI) m/z: 668.9 [M+Cl]^-。

实施例2

化合物（2）的制备

用142mg（2.0mmol）吡咯代替163mg（2.0mmol）二甲胺盐酸盐，其它操作同实施例1，制得化合物（2），收率84.5%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 1.13 (s, 6H), 2.03 (m, 4H), 2.23 (s, 6H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.23-3.37 (m, 8H), 3.40-3.51 (m, 4H), 3.81 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 4.04 (s,1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.81(s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s, 1H)。MS (ESI) m/z: 694.8 [M+Cl]^-。

实施例3

化合物（3）的制备

用0.85g（6.6mmol）正丁胺代替10mL二甲胺溶液，其它操作同实施例1，制得化合物（Ib），收率50.5%。

用170mg（2.0mmol）哌啶代替163mg（2.0mmol）吡咯与Ib反应，其它操作同实施例2，制得化合物（3），收率85.8%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 0.91 (t, 6H), 1.13 (s, 6H), 1.21-1.56 (m, 8H), 1.71-1.75 (m, 6H), 2.59 (m, 4H), 3.01-3.23 (m, 4H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.34-3.36 (m, 12H), 3.81 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 4.04 (s, 1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s，1H), 5.81 (s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s,1H)。MS (ESI) m/z: 794.0 [M+Cl]^-。

实施例4

化合物（4）的制备

用0.80g（6.6mmol）N-甲基苄胺代替10mL二甲胺溶液，其它操作同实施例1，制得化合物（Ic），收率47.0%。

用174mg（2.0mmol）吗啉代替163mg（2.0mmol）吡咯与Ic反应，其它操作同实施例2，制得化合物（4），收率81.1%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 1.13 (s, 6H), 2.23 (s, 3H), 2.45 (t, J=7.2Hz, 2H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.38-3.41 (m, 4H), 3.48-3.53 (m, 8H), 3.81 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 3.87-3.90 (t, 4H), 4.04 (s,1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.81(s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s,1H), 7.25-7.30 (m, 5H)。MS (ESI) m/z: 786.9 [M+Cl]^-。

实施例5

化合物（5）的制备

用0.48g（6.6mmol）二乙胺代替10mL二甲胺溶液，其它操作同实施例1，制得化合物（Id），收率51.0%。

用352mg（2.0mmol）N-苄基哌嗪代替163mg（2.0mmol）吡咯与Id反应，其它操作同实施例2，制得化合物（5），收率82.5%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 0.92 (t, 6H), 1.13 (s, 6H), 2.59 (m, 4H), 3.04-3.18 (m, 2H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.37-3.41 (m, 12H), 3.57 (s, 2H), 3.81 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 4.04 (s,1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s，1H), 5.81 (s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 7.25-7.31 (m, 5H)。MS (ESI) m/z: 827.9 [M+Cl]^-。

实施例6

化合物（6）的制备

用198mg（2.0mmol）高哌嗪代替163mg（2.0mmol）吡咯与Ia反应，其它操作同实施例2，制得化合物（6），收率79.6%。¹H NMR（400MHz, D₂O)δ: 1.13 (s, 6H), 1.68-1.73 (m, 6H), 3.02-3.16 (m, 8H), 3.20 (d, J=9.9Hz, 1H), 3.28-3.41 (m, 12H), 3.81 ( dd, J=10.4, 3.8Hz, 1H), 4.04 (s,1H), 4.20, 4.28 (d, J=11.2Hz, 2H), 4.24 (s, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 5.51 (s，1H), 5.81(s, 1H), 6.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 6.17 (s, 1H)。MS (ESI) m/z: 722.9 [M+Cl]^-。

实施例7

冬凌草甲素衍生物抗肿瘤活性

细胞株采用人肝癌细胞BEL7402、人肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7。

四种细胞分别经消化、计数制成浓度为5x10⁴个/mL的细胞悬液。96孔板中每孔加入100µL细胞悬液（每孔5x10³个细胞），置于37℃，5%CO₂培养箱中培养24h，用培养基稀释药物至所需浓度（浓度10µmol/L)，每孔加100µL相应含药培养基，同时设阴性对照组和阳性对照组。然后，96孔板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养72h，每孔加入20µLMTT（5mg/mL)染色，继续培养4h，弃去培养基，每孔加150µLDMSO溶解，λ=490nm测OD值，计算IC₅₀值（表1）。