稀土‑缩合类单宁配合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于稀土配合物及其制备和应用技术领域，具体涉及一种稀土-缩合类单宁配合物及其制备方法和作为抗真菌剂的应用。

背景技术：

植物多酚是广泛存在于植物皮、根、叶、壳和果肉中的化合物，通常将分子量为500～3000的植物多酚称为单宁(石碧.植物多酚[m].科学出版社,2000.)。根据单宁的化学结构特征又可将其分为水解类单宁和缩合类单宁，水解类单宁分子内具有酯键，通常是以一个多元醇为核心，通过酯键与多个酚羧酸相连接而成，易水解；缩合类单宁是黄烷醇的聚合物，分子结构中的芳香环是以c-c键相连接，不易水解。研究发现，植物多酚具有抗氧化、抗病毒、消炎、抗菌等生物活性(石碧.植物多酚[m].科学出版社,2000；olivers,vittorioo,cirillog,etal.enhancingthetherapeuticeffectsofpolyphenolswithmacromolecules[j].polymerchemistry,2016,7(8):1529-1544.)。其中植物多酚的抗菌机理主要表现在如下几方面：与酶本身、酶的辅助因子或酶促反应的底物结合，从而达到对酶促反应的抑制(dasj,ramanir,surajumo.polyphenolcompoundsandpkcsignaling[j].biochimicaetbiophysicaacta,2016；opokutemengc,sintimho.inhibitionofcyclicdiadenylatecyclase,disa,bypolyphenols[j].scientificreports,2016,6.)；与构成核苷酸的嘌呤和嘧啶结合，抑制菌体遗传物质的合成(张力平,孙长霞,李俊清,等.植物多酚的研究现状及发展前景[j].林业科学,2005,41(6):157-162.)；与细胞外膜稳定性相关的二价阳离子发生螯合，破坏细胞膜的完整性(nohyneklj,alakomih,kahahkonenmp,etal.berryphenolics:antimicrobialpropertiesandmechanismsofactionagainstseverehumanpathogens[j].nutrition&cancer,2006,54(1):18-32.)。但遗憾的是，植物多酚的稳定性差、生物利用率较低且膜穿透性不强(olivers,vittorioo,cirillog,etal.enhancingthetherapeuticeffectsofpolyphenolswithmacromolecule[j].polymerchemistry,2016,7(8):1529-1544.)。另外，稀土(re)虽具有很好的抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗菌等生物活性而且对人体毒性小，但是，稀土的水溶性太强且易水解，难以与细胞结合，从而使其抗菌活性大大降低。

有研究发现，植物多酚中大量的酚羟基可以与稀土离子发生配位反应，因此，植物多酚与稀土离子配位形成的配合物不仅能解决植物多酚细胞膜穿透性差的问题，同时也可以解决稀土离子水溶性强的问题，于是有人公开了一些稀土-小分子的植物多酚(分子量通常低于500)配合物，如：稀土-芦丁(吴锦绣.稀土芦丁配合物的合成、抑菌活性及与血清白蛋白的相互作用的研究[d].西北师范大学,2007.)、稀土-槲皮素(zhouj,wanglf,wangjy,etal.synthesis,characterization,antioxidativeandantitumoractivitiesofsolidquercetinrareearth(iii)complexes[j].journalofinorganicbiochemistry,2001,83:41-48.)、稀土-姜黄素(songym,xujp,dingl,etal.syntheses,characterizationandbiologicalactivitiesofrareearthmetalcomplexeswithcurcuminand1,10-phenanthroline-5,6-dione[j].journalofinorganicbiochemistry,2009,103(3):396-400.)、稀土-柚皮苷(夏侯国论,刘霞,丁冶春,等.柚皮苷-稀土配合物的合成及抗肿瘤活性的研究[j].赣南医学院学报,2015(1):30-32.)。这些配合物确有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗癌等生物活性，但美中不足的是所采用的小分子的植物多酚价格较贵，且所得的配合物抑菌活性又较弱，特别是对真菌几乎没有抑制作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，首先提供一种稀土-缩合类单宁配合物的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种由上述方法制备的稀土-缩合类单宁配合物。

本发明的再一目的是提供由上述方法制备的稀土-缩合类单宁配合物的应用。

本发明提供的稀土-缩合类单宁配合物的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：

先将摩尔比1:9-5:9的缩合类单宁和硝酸稀土分别溶于水，然后在20～50℃下，以边搅拌边滴加的方式将硝酸稀土溶液加入到缩合类单宁溶液中，滴加完后再搅拌反应6～10h，离心分离，冷冻干燥即得到稀土-缩合类单宁配合物。

以上方法中所述的缩合类单宁为落叶松单宁(lt)、杨梅单宁(bt)或黑荆树单宁(bwt)中的任一种，优选lt。

以上所述的缩合类单宁是参照《落叶松原花色素的分级及精细化利用研究》(杜晓.落叶松原花色素的分级及精细化利用研究[d].四川大学,2006.)公开的方法提取的，具体的操作方法为：在200质量份的植物树皮粉碎物中，加入250体积份的70％乙醇水溶液，然后在60℃的水浴中回流提取90min，收集提取液，反复三次；提取液趁热粗过滤，除去杂质，自然冷却至室温，过滤除去沉淀物；随后，在50±5℃下，旋转蒸发除去滤液中的乙醇，自然冷却至室温，过滤除去沉淀物；最后在50±5℃下，将浓缩液减压干燥，即得到缩合类单宁。其中所用的植物树皮粉碎物对应为落叶松树皮粉碎物、杨梅树皮粉碎物或黑荆树树皮粉碎物中的任一种。

以上方法中所述的硝酸稀土为硝酸镧la(no3)3、硝酸铈ce(no3)3、硝酸镨pr(no3)3、硝酸钕nd(no3)3、硝酸钐sm(no3)3、硝酸钆gd(no3)3或硝酸镱yb(no3)3中的任一种，优选ce(no3)3。

以上方法中所述的缩合类单宁和硝酸稀土的摩尔比优选2:9-3:9；反应温度优选20～30℃；反应时间优选6～8h。

本发明提供的稀土-缩合类单宁的配合物，其特征在于该配合物中的配体为缩合类单宁，配位金属离子为稀土离子，配位数为4-8，且对黑曲霉、红曲霉、白腐菌和毛霉真菌的最小抑菌浓度(mic)为0.8～6.4mg/ml。

以上配合物中所述的缩合类单宁为落叶松单宁、杨梅单宁或黑荆树单宁中的任一种，优选落叶松单宁(lt)。

以上配合物中所述的稀土离子为镧离子、铈离子、镨离子、钕离子、钐离子、钆离子或镱离子中的任一种，优选铈离子。

当用以上方法中的优选条件制备稀土-缩合类单宁的配合物，该稀土-缩合类单宁的配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌和毛霉真菌的最小抑菌浓度(mic)为0.8～3.2mg/ml。

本发明提供上述方法制备的稀土-缩合类单宁配合物的应用是在抗真菌方面的应用。

本发明与现有技术相比，其具有以下有益效果：

(1)由于本发明提供的制备方法选择的硝酸稀土与缩合类单宁进行配位反应后，其中的re(iii)(re表示稀土)的正电荷部分转移到单宁分子上，使螯合物环上的电子产生了离域效应，降低了re(iii)的极性，增强了配合物的脂溶性，因而使所得配合物能更好的穿透细胞膜，从而能获得杀灭真菌的效果。

(2)由于本发明提供的制备方法选择了价格低廉的缩合类单宁来作为配体，因而既解决了现有技术采用小分子配体价格贵的问题，又提高抗真菌活性，同时也为抗真菌领域提供了一种价廉且活性强的抗真菌剂。

(3)本发明提供的稀土-缩合类单宁配合物抑菌活性较强，尤其是对黑曲霉、红曲霉、白腐菌和毛霉这四种真菌表现出了较强的抗菌活性。

(4)本发明提供的制备方法简单、条件温和、可控性强，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1所使用的配体的分子结构以及制备配合物ce(iii)-lt的合成反应示意图。其中lt分子结构中b环上的邻位酚羟基可与ce(iii)发生配位反应形成ce(iii)-lt配合物。反应过程中溶液的ph降低，也说明ce(iii)确实与lt中b环上的邻位酚羟基发生配位反应并释放出了氢质子。

图2为本发明实施例1所制备的配合物ce(iii)-lt及其配体的红外光谱图。从图中可见，与配体的谱图相比，配合物红外谱图发生了较大变化。lt在3354cm^-1处有一个明显的大峰，这是lt分子中o-h键的伸缩振动产生的，而此峰的宽度取决于lt分子与水分子之间形成氢键的强弱，ce(iii)-lt中此峰明显变窄，说明lt分子中的酚羟基中氧原子的孤对电子与ce(iii)的空轨道结合后，与水分子形成的氢键就被削弱了；lt在1613、1517、1446cm^-1处的三个吸收峰则是lt分子中苯环骨架的伸缩振动吸收峰，在ce(iii)-lt中，这三个吸收峰向高波数移动或消失；lt在1362、1280cm^-1的吸收峰是酚羟基的c-o键伸缩振动与o-h键面内变形振动耦合所致，在ce(iii)-lt中，这两个峰向高波数移至1353cm^-1、1324cm^-1，说明酚羟基参与了配位成键；ce(iii)-lt在588cm^-1处观察到ce-o键伸缩振动吸收峰，说明配合物中含有ce-o键。

图3为本发明实施例1所制备的配合物ce(iii)-lt及其配体的o1sxps谱图。从lt的o1s图谱可见只有一个位于532.57ev处的峰，此峰对应于lt中的酚羟基的氧原子(c-oh)，而ce(iii)-lt中有两个峰，其533.38ev处的峰为酚羟基中的氧原子，532.16ev处的峰为酚羟基的氧原子与稀土离子发生络合反应(c-o-ce)形成的，由此引起氧原子上的电子密度降低，其电子结合能向高场位移。

图4为本发明实施例1所制备的配合物ce(iii)-lt及其配体的紫外光谱图。从lt的紫外图谱中可见273nm处出现一个明显的特征峰，该峰是lt分子结构中酚羟基的特征吸收峰，但与ce(iii)反应后，该特征吸收峰红移至278nm且吸光度值减小。红移是因为形成配合物后，整个分子中电子的离域程度增大，电子跃迁所需能量降低所致。

图5为不同摩尔比的儿茶素与ce(iii)反应后ph的减小的曲线图。从图中可见随着摩尔比的增加，体系ph有下降趋势并于摩尔比大于等于4时趋于稳定。根据常见ce(iii)的配位数为4、6、7、8、9、10以及12，但由于lt分子量大、空间位阻较大，且水分子也可以参与ce(iii)的配位反应，故实施例1制备的配合物ce(iii)-lt的配位数为4-8。

图6为本发明实施例1所制备的配合物ce(iii)-lt和水(空白对照)对黑曲霉的抑菌圈照片(左为实验组，右为对照组)。很显然，与对照组相比，ce(iii)-lt对黑曲霉具有明显的抑制作用，且其抑菌圈直径高达26.66mm。

图7为用本发明实施例1所制备的配合物ce(iii)-lt和水(空白对照)处理的红曲霉的生长曲线。与空白对照相比，ce(iii)-lt几乎完全抑制了红曲霉的生长。

图8为本发明实施例2所制备的配合物ce(iii)-lt和水(空白对照)处理的红曲霉的透射电镜照片(左为实验组，右为对照组)。从照片对比可见，正常生长的红曲霉细胞壁完整，细胞基质均匀(右图)，而在ce(iii)-lt的作用下，红曲霉细胞壁脱落、破裂，细胞基质已被溶解、消失，说明ce(iii)-lt具有较强的抗真菌活性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

值得说明的是：1)为了叙述更为简单，首先按照以下方法分别提取lt、bt、bwt：即分别在200质量份的落叶松树皮粉碎物、杨梅树皮粉碎物或黑荆树树皮粉碎物中，加入250体积份的70％乙醇水溶液，然后在60℃的水浴中回流提取90min，收集提取液，反复三次；提取液趁热粗过滤，除去杂质，自然冷却至室温，过滤除去沉淀物；随后，在50±5℃下，旋转蒸发除去滤液中的乙醇，自然冷却至室温，过滤除去沉淀物；最后在50±5℃下，将浓缩液减压干燥，即得到固体缩合类单宁lt、bt、bwt。2)配位数是按这样一种方法测定的：由于re(iii)与缩合类单宁发生配位反应时，会有氢质子的释放，使体系的ph降低.所以是根据配位反应后ph的减小量来确定re(iii)的配位数。由于以下实施例所用的lt、bt、bwt分别以儿茶素(c)、表棓儿茶素没食子酸酯(egcg)、焦性没食子酸(pa)为结构单元，故以其模型分子模拟其配位反应过程。其操作步骤为：按摩尔比2:1-6:1分别称模型分子和re(iii)，并分别溶于适量的水中，并分别测其ph。在30℃下，以滴加方式将re(iii)溶液加入模型分子溶液中，混合搅拌反应至稳定，并测其ph。3)以下实施例抗菌活性的测试所采用的是琼脂扩散法和微量稀释法。其中琼脂扩散法是利用抗菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抗菌作用的定性实验。微量稀释法是按照临床试验室标准化委员会(clsi)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(m38-a)进行的定量测试。

实施例1

先将摩尔比2:9的lt和ce(no3)3分别溶于水，然后在25℃下，以边搅拌边滴加的方式将ce(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再搅拌反应8h，离心分离，冷冻干燥即得到ce(iii)-lt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达20.66～36.18mm，其最小抑菌浓度分别为1.6、1.6、0.8和1.6mg/ml。

实施例2

先将摩尔比1:9的bt和pr(no3)3分别溶于水，然后在20℃下，以边搅拌边滴加的方式将pr(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再搅拌反应7.5h，离心分离，冷冻干燥即得到pr(iii)-bt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达14.82～17.73mm，其最小抑菌浓度分别为3.2、1.6、1.6和6.4mg/ml。

实施例3

先将摩尔比3:9的lt和gd(no3)3分别溶于水，然后在50℃下，以边搅拌边滴加的方式将gd(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再搅拌反应6h，离心分离，冷冻干燥即得到gd(iii)-lt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达13.80～19.10mm，最小抑菌浓度分别为1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

实施例4

先将摩尔比2:9的bt和nd(no3)3分别溶于水，然后在30℃下，以边搅拌边滴加的方式将nd(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再搅拌反应10h，离心分离，冷冻干燥即得到nd(iii)-bt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达14.55～20.01mm，最小抑菌浓度分别为3.2、1.6、1.6和3.2mg/ml。

实施例5

先将摩尔比2.5:9的lt和la(no3)3分别溶于水，然后在20℃下，以边搅拌边滴加的方式将la(no3)3溶液加入到lt溶液中，滴加完后再搅拌反应7h，离心分离，冷冻干燥即得到la(iii)-lt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达16.56～30.69mm，最小抑菌浓度分别为1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

实施例6

先将摩尔比4:9的bt和sm(no3)3分别溶于水，然后在30℃下，以边搅拌边滴加的方式将sm(no3)3溶液加入到bt溶液中，滴加完后再搅拌反应9h，离心分离，冷冻干燥即得到sm(iii)-bt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达13.77～20.21mm，最小抑菌浓度分别为1.6、1.6、1.6和3.2mg/ml。

实施例7

先将摩尔比5:9的bwt和yb(no3)3分别溶于水，然后在40℃下，以边搅拌边滴加的方式将yb(no3)3溶液加入到bwt溶液中，滴加完后再搅拌反应6h，离心分离，冷冻干燥即得到yb(iii)-bwt配合物。

该配合物对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抑菌圈可高达15.10～18.30mm，最小抑菌浓度分别为3.2、1.6、3.2和3.2mg/ml。

对比例1-3

测定lt、bt、bwt三种单宁对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抗菌活性，结果表明lt只对白腐菌有抑制作用且抑菌圈为13.66mm；bt只对白腐菌、红曲霉有抑制作用且抑菌圈为11.61～13.78mm；bwt只对红曲霉、白腐菌有抑制作用且抑菌圈为12.60～14.80mm。

对比例4-11

测定la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、sm(iii)、gd(iii)和yb(iii)八种稀土离子对黑曲霉、红曲霉、白腐菌、毛霉四种真菌的抗菌活性，结果表明:ce(iii)、gd(iii)和yb(iii)对四种真菌没有抑制作用；pr(iii)、nd(iii)与sm(iii)只对红曲霉、白腐菌有抑制作用且抑菌圈为10.60～12.80mm；la(iii)对红曲霉、白腐菌以及毛霉均有抑制作用但抑菌圈为11.27～14.80mm。