一种双向伯克霍尔德氏菌及其复合生物制剂的制备及应用的制作方法

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种双向伯克霍尔德氏菌及其复合生物制剂的制备及应用。

技术背景

目前对伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)的研究已较多，主要集中在应用该属内的菌株产生酶或用于治理环境污染，如以下专利文献：公开号1195373(日本，中山美香等，公开日2004/03/24)的降解卤代烃的微生物及应用；公开号1484703(日本，早出广司，公开日2004/03/24)的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法；公开号1867676(日本，山口将宪等，公开日2006/11/22)的鲨肌醇的制备方法；公开号101198695(德国，贝赛林等，公开日2008/06/11)的生产脂肪酶的方法；公开号101153272(中国，盛下放等，公开日2008/04/02)的一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法；公开号102046778a(日本，古贺一治、增田绅吾，公开日2011/05/04)的降低植物体中的重金属含量的细菌；公开号101671636(中国，郭军康等，公开日2010/03/17)的一种抗重金属植物促生菌制剂及其施用方法。但以上文献都没有涉及到植物病原菌生物防治的相关应用。

在植物病害的生物防治方面，任嘉红等发现吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007对杨树溃疡病具有防治效果(任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007抗菌蛋白的分离纯化，微生物学通报，2010-06-20；任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果，中国生物防治，2010-08-08；叶建仁等，一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用，中国专利，2009-10-14；)；查传勇发现双向伯克霍尔德氏菌lu10-1能够产生抗菌活性物质(查传勇等，双向伯克霍尔德氏菌lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化，蚕业科学，2009-06-15)；林善海等发现伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病具有防治效果(林善海等，拮抗伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病的生物防治试验，中国植物病理学会2007年学术年会论文集，2007-08-01)。

此外，本申请的申请人多年来对伯克霍尔德氏菌研究较为深入，例如申请人本人于2013年7月30日申请了相关专利201310326671.2，其中涉及保藏编号为cctccno:m2013145；该菌株是申请人发现的双向伯克霍尔德氏菌一代菌株，尽管其发酵物在防治病原真菌或病原细菌类病害具有一定的效果，然而申请人仍希望分离或筛选出更优良的菌株，以及采用更有效的方法培养出抗菌效果更优的抗菌剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对植物病原真菌引起的植物病害提供一种生防菌株，以及在该菌株基础上制备高效的复合生物制剂的方法，以及相应的复合生物制剂产品。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于，该菌种分类命名为双向伯克霍尔德氏菌(burkholderiaambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，其地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.13140。

本发明所涉及的上述双向伯克霍尔德氏菌菌株的16srdna序列如附件所示。

进一步地，本发明提供上述双向伯克霍尔德氏菌在制备防治植物病原真菌引起的植物病害抗菌剂中的应用。

所述植物病原真菌为核桃炭疽病菌(glieosporiumrugonmculans(berk)thtim)、油菜菌核(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)、草莓灰霉(strawberrygraymould)、小麦赤霉(fusahumgraminearumsehw)、番茄灰霉(botrytiscinerea)。

进一步地，本发明提供一种制备植物病害抗菌剂的方法，其特征在于，该方法在于将所述双向伯克霍尔德氏菌接入改进的lb液体培养基中发酵培养，其特征在于培养条件如下：按照5％的接种量，将24～36h菌龄的种子接种于装有100mllb液体发酵液的500ml三角瓶中，以180r/min在25℃条件下培养36h；所述改进lb培养基配方为(g/l)：葡萄糖30、蛋白胨15、牛肉膏5、硫酸镁0.5、氯化钠1、磷酸氢二钾5、水1l，ph7.0～7.2。发酵结束后通过离心或者板框过滤获得微生物菌体，然后使用硅藻土吸附来制备菌剂，所述微生物菌体与硅藻土的体积比为1:5-10。

优选地，微生物菌体与硅藻土二者的体积比为1:6。

进一步地，本发明提供一种新型复合生物制剂，其特征在于，所述复合生物制剂包括上述抗菌剂与5％的苦参碱混合；二者的重量比为2:1-1:3。

优选地，二者的重量比为1:2。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、相比在先专利201310326671.2，本专利涉及的生防菌cgmccno.13140分离于健康果实表面，属于植物表面定殖的益生菌，作为生防菌更加安全可靠；

2、菌株cgmccno.13140来源于健康植物表面，因此，该菌株作为生防菌在防治过程中更易定殖于果实和植株表面，能够起到长效防治的效果；

3、本专利选用植物源的苦参碱与其菌剂复合组成强效生物制剂，相比于单一的微生物制剂，混合生物制剂的抑菌谱更广，且兼容了苦参碱速效防治效果和微生物制剂长效防治的特点，抑菌效果显著提高。本复合生物制剂对番茄灰霉的抑制率为92.45％，对核桃炭疽病菌的抑制率为85％，对油菜菌核的防效为83％，对草莓灰霉的室内生防效果也达78％，此外，对小麦赤霉、香蕉炭疽病、荔枝霜疫霉病等均具有良好的防效；

4、相比在先专利201310326671.2中所涉及到的保藏编号为cctccno:m2013145的双向伯克霍尔德氏菌而言，二者的来源不同，在先专利从土壤中分离；此外二者能有效防治的对象也不同，本发明所分离的菌株具有更好的应用前景。

附图说明：

图1：生防菌伯克霍尔德氏菌菌落形态照片

图2：生防菌伯克霍尔德氏菌显微照片

图3：生防菌伯克霍尔德氏菌16srrna测序序列

图4：生防菌伯克霍尔德氏菌的进化树

图5：生防菌伯克霍尔德氏菌对多种植物病原真菌的抑制

图6：生防菌伯克霍尔德氏菌剂对番茄灰霉的抑制

图7：生防菌剂与苦参碱组成复合生物制剂与单纯菌剂对番茄灰霉的平板抑制比较

图8：生防菌剂与苦参碱组成的复合生物制剂对番茄灰霉的抑制的植物离体实验

具体实施方式

实施例1：保藏编号为cgmccno.13140的特定双向伯克霍尔德氏菌菌株的筛选及鉴定

1、菌株的筛选

(1)果实样品的采集

以陕西省洛川县为基地，选择树龄较小的苹果示范园，挑选树势旺盛的植株，选取健康苹果采摘，用无菌袋装好后带回实验备用。

(2)植物表面微生物富集

将新鲜采集的苹果，在超净工作台里用无菌水清洗表面，将清洗表面的水加入lb液体培养基中，37℃，200rpm，富集培养48h。然后将富集好的发酵液逐级稀释，分别选择10^-2,10^-4,10^-5稀释液作为分离源。

(3)分离方法

吸取100μl稀释液到预先倒好的营养琼脂培养基的90mm培养皿中，用灭菌的玻璃刮刀涂布均匀，待晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，培养温度37℃，培养时间24h，将平板上长出的单菌落挑出后到新的培养基上纯化培养，对全部分离获得的菌株进行编号，然后，以植物病原真菌为指示菌进行拮抗活性的初筛和复筛。

(4)拮抗剂的初筛和复筛

初筛方法：将分离获得的菌株进行发酵，离心获得发酵液。按照5％，将发酵液加入到pda，待凝固后，在pda平板中央接种病原指示菌，以不加发酵液的pda平板接种病原指示真菌作为对照，培养5d，测量指示菌菌落，筛选具有抑制效果的。

复筛方法：用打孔器在培养好的番茄灰霉和草莓灰霉等病原真菌的菌落边缘打孔取直径5mm的菌块，接种到pda平板中央，再将初筛获得菌株活化后接种于番茄灰霉和草莓灰霉的菌丝体周围2～3cm处，每个处理3次重复。在25～30℃下培养3d，然后测量待测菌株与病原真菌之间的抑菌带宽宽度，作为拮抗活性强弱的指标。

经过上述初筛和复筛，获得一株对番茄灰霉和草莓灰霉等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株，编号为snnh-08。

2、菌株鉴定

形态鉴定：在lb培养基上培养48h，菌落为圆形，乳白色，边缘完整，凸起，菌落不透明，如图1所示。显微照片显示，该菌为小杆状，如图2所示。

分子生物学鉴定：dna提取采用试剂盒。pcr选用通用引物27f5′-agagtttgatcctggctcag-3′,1504r5′-aaggaggtgatccagccgca-3′。测序工作由华大基因(北京)有限公司完成，得到的序列长度为1395bp，如图3所示。将所测的16srrna序列采用clustalx1.83软件对菌株进行系统发育分析,采用邻接法(neighbor-joining)法,用mega5.05构建供试菌株和实验菌株之间的系统进化树，结果如图4所示。该菌株与burholderiaambifariaammd(af043302)具有最高的相似性。

实施例2、本发明菌株对多种植物病原真菌的抑制作用

(1)供试菌株

供试病原真菌分别选择核桃炭疽病菌(glieosporiumrugonmculans(berk)thtim)、油菜菌核(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)、草莓灰霉(strawberrygraymould)、小麦赤霉(fusahumgraminearumsehw)、番茄灰霉(botrytiscinerea)。这些病原真菌都是由发病植株分离且鉴定过。

(2)对多种植物病原真菌的抑制作用

将活化24h的双向伯克霍尔德氏菌(burkholderiaambifaria)cgmccno.13146接种于装有100ml改进lb液体发酵培养液中，培养温度35℃，200rpm恒温摇床培养36h；

试验组：将获得的发酵液按照5％的量加入45～50℃的pda培养基中，待凝固后，在pda平板中央接种预先活化好的各种病原真菌，28℃，培养3d，测定菌落直径dsy；

空白组：直接将活化好的病原真菌接种于pda平板中央，28℃培养3d，测定菌落直径dck；

抑制率计算：

抑制率(％)＝(dck-dsy)×100/dck

本发明菌株对多种植物病原真菌和细菌的抑制效果(如图5所示)

综上所述，本发明菌株对多种重要的植物病原真菌均具有抑制作用，为广谱拮抗菌，可用于防治多种植物病害，尤其是对番茄灰霉的防治效果最佳。

(3)本发明菌株对番茄灰霉的拮抗效果(如图6所示)

将预先活化好的植物病原真菌用无菌打孔器打孔，挑取一小块菌块接种于预先倒好的pda平板上。将生防菌接种于pda平板的两边，28℃培养3d，如图6所示。结果可以看出，双向伯克霍尔德氏菌对番茄灰霉具有很好的拮抗作用。

实施例3本发明微生物复合菌剂的制备

(1)固体斜面菌种的制备

将双向伯克霍尔德氏菌(burkholderiaambifaria)接种于营养琼脂(na)斜面培养基上，于37℃恒温静置培养24h备用。

所用的na培养基配方(g/l)：蛋白胨10，牛肉膏粉3，氯化钠5，琼脂15，蒸馏水1000ml，ph7.3。121℃，灭菌20min。

(2)摇瓶液体种子制备

取上述活化好的斜面种子一环，接种于装有50ml液体发酵液的250ml的摇瓶中，于37℃，200rpm，恒温摇床培养24h，获得摇瓶种子。

摇瓶种子培养基配方(g/l)：葡萄糖20,蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠1，蒸馏水1000ml，ph7.4,121℃，灭菌20min。

(3)发酵培养

按照5％的接种量将上述获得的摇瓶种子接种于装有7l发酵培养液的10l发酵罐中，培养温度37℃，转速400rpm，通气量1vvm，发酵周期36h。

发酵培养基配方(g/l):葡萄糖30，蛋白胨15，牛肉膏5，硫酸镁0.5，氯化钠1，磷酸氢二钾5，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。

(4)菌体分离

按照上述发酵条件获得的发酵液，通过离心机离心获得菌体，离心机转速为6000rpm。

(5)菌剂制备

将上述获得的菌泥按照体积比1:6的比例与硅藻土混匀晾干，制备成固体菌剂。

(6)复合生物制剂制备

将上述获得的固体菌剂按照1:2的重量比与5％的苦参碱混匀制成复合生物制剂。

实施例4本发明复合生物制剂与单纯微生物菌剂对植物病原菌的抑制作用

1、复合生物制剂对番茄灰霉病抑制的平板试验

将预先制备好的复合生物制剂(发酵液离心获得菌泥之后，按照1:6的比例与硅藻土混匀晾干，并按照1:2的重量比与5％的苦参碱混匀柘城复合生物制剂。其中，活菌浓度为5×10¹⁰cfu/g)和单纯菌剂(发酵液离心获得菌泥之后，按照1:6的比例与硅藻土混匀晾干，其中，活菌浓度为8×10¹⁰cfu/g)制成100倍水溶液；((2)分别按照5％的加量将配置好的复合生物制剂和单纯菌剂添加到50℃的pda培养基中，等待冷却，对照组添加等量的无菌水，其中复合生物制剂为试验组，单纯菌剂为对照组。(3)将预先活化好的番茄灰霉接种于冷却的pda培养基中央，28℃，恒温培养3d，测定病原菌的直径

结果如图7所示，从左到右依次为空白组，对照组和试验组。其中，单纯菌剂制备的防效为75％，复合生物制剂的防效为88％。因此，相比于单纯菌剂，复合生物制剂对番茄灰霉的抑制率显著增强。

2、复合生物制剂对番茄灰霉病抑制的离体试验

(1)挑选大小一致的番茄若干个，分成3份；

(2)将预先制备好的复合生物制剂和单纯菌剂配制成100倍的水溶液；

(3)空白组：用水喷番茄；

试验组：用复合生物制剂的100倍水溶液喷洒番茄；

对照组：用单纯菌剂的100倍水溶液喷洒番茄

(4)接种病原菌，将预先活化好的番茄灰霉接种于处理过的番茄表面，于人工气候箱培养3d，培养温度28℃，湿度50％；

(5)防效评估，将上述接过病原菌的番茄培养3d，测定病原菌在番茄表面的菌落直径。

抑制率(％)＝(dck-dsy)×100/dck

其中dck为对照组的病原菌直径，dsy为试验组的病原菌直径。

结果如图8所示，从左到右依次为空白组、对照组和试验组。因此，可以看出，相比于单一菌体制剂，复合生物制剂对番茄灰霉的抑制效果显著提高。其中，复合生物制剂对番茄灰霉的抑制率达到95％，而单一菌株制剂对番茄灰霉的抑制率为65％,抑制率增效145。

本发明的复合生物制剂已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

gtgaccgtcctccttgcggttagactagccacttctggtaaaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccggactacgatcggttttctgggattagctccccctcgcgggttggcacaccctctgttccgaccattgtatgacgtgtgaagccctacccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgctcttgcgtagcaactaaggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgcgccggttctctttcgagcactcccacctctcagcaggattccgaccatgtcaagggtaggtaaggtttttcgcgttgcatcgaattaatccacatcatccaccgcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtcaacttcacgcgttagctacgttactaaggaaatgaatccccaacaactagttgacatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcatgagcgtcagtattggcccagggggctgccttcgccatcggtattcctccacatctctacgcatttcactgctacacgtggaattctacccccctctgccatactctagcctgccagtcaccaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatcggtcttaacaaaccgcctgcgcacgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgccaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcttccggtaccgtcatcccccggctagtattagaaccaaggatttctttccggacaaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggcattgctggatcaggctttcgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctggtcgtcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatcagccatcggccaaccctatagcgcgaggcccgaaggtcccccgctttcatccgtagatcgtatgcggtattaatccggctttcgccgggctatcccccactacaggacatgttccgatgtattactcacccgttcgccactcgccaccaggtgcaagcacccgtgctgccgt