【
技术领域：
】本发明属于生物肥料
技术领域：
。更具体地，本发明涉及一种弧菌lx6-2，还涉及所述弧菌lx6-2在制备生物海藻肥中的用途。
背景技术：
：海藻是一种来源丰富的海洋生物，广泛应用于食品、工业原料、植物性药材。将海藻应用于农业和畜牧业生产已有几百年历史。海藻肥是一类纯天然、无毒副作用的新型肥料，它含有丰富的氨基酸、矿物质、多糖、维生素及生理活性物质，具有提高作物产量、改善品质和增强作物抗旱、耐寒、抗病性等作用。因此，利用海藻生产有机肥料成为当今新型肥料研究的重要热点之一。海藻肥是以生长在海洋中的大型速生褐藻类为原料，采用化学、物理或生物的方法提取海藻中的有效成分制成肥料，施予植物能促进植物生长，提高产量，改善农产品品质。海藻肥是天然的有机肥，其肥效依赖于海藻肥中所含有的细胞激动素、植物生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯、甜菜碱、多胺等主要活性物质。海藻肥除含有大量的非含氮有机物和一定数量的氨基酸、蛋白质及微量营养元素外，还含有海洋生物特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不饱和脂肪酸和陆生植物生长需要的锌、溴、碘等微量矿物元素。目前，国内外海藻肥生产方法一般是化学水解法(即氢氧化钾水解法)、物理提取法、生物发酵法(即酶降解法)等。另外，从海藻工业废弃物中提取生物活性物质，再经科学配制而得到的肥料。提取方法对于产品活性物质和营养成分含量的影响极大，相同含量但活性不同的话差异也很大。现在国内外绝大部分厂家主要采用化学水解法生产海藻肥，这种方法的最大缺陷在于强碱高温会破坏海藻内源物质的活性。物理提取法采用高压低温冷却工艺以达到海藻细胞壁破碎的目的，该提取方法优于化学提取法，但物理提纯技术难度大，工业实施困难重重。生物发酵法是利用微生物在以海藻等为养分的代谢过程中产生的多种酶，将构成海藻大分子物质降解成小分子、水溶性的物质，因为发酵过程没有化学法的强碱和高温，也没有物理法的高压和低温，因此最大限度完整地保留了海藻中的生物活性物质和营养物质，且都能被植物吸收利用。目前采用生物发酵法生产海藻肥在国内外仅限于实验室研究，对其研制工艺及应用机理缺乏深入的系统研究，在产业化技术方面尚属空白。海藻肥的使用方法主要有三种：(1)土壤施用：海藻肥含有的天然化合物如海藻多糖是天然土壤调节剂，不仅能螯合重金属离子，增加土壤中有效成分的持久性和有效性，而且能促进土壤团粒结构的形成，改善土壤内部孔隙空间，协调土壤中固、液、气三者比例，提高水分保持率和土壤的通气性，恢复土壤的天然胶质平衡，增加土壤有机质。(2)种子浸泡：种子处理已被证明对于促进提早发芽和提高生长初期抗逆能力十分有效。(3)叶面喷施：叶面喷施是应用最广泛的施肥方式，能快速补充植物对营养成分的边缘缺乏，刺激根茎的发育和对营养成分的吸收。海藻肥中的褐藻酸可以降低水的表面张力，在植物叶表面形成一层薄膜，增大接触面积，使水或水溶性物质比较容易透过叶表面细胞膜进入植物细胞，使植物最有效地吸收海藻提取液中的营养成分。因此海藻肥具有施用方法多样，使用简便，使用范围广泛等优点，所以，以海藻肥为基础根据不同需求开发出更加多样化的海藻产品，必将更加适应市场的需求。技术实现要素：[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种弧菌lx6-2。本发明的另一个目的是提供所述弧菌lx6-2在制备生物海藻肥中的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种弧菌(vibriosp.)lx6-2，该菌株已于2015年3月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为cgmccno.10659。本发明涉及所述的弧菌lx6-2在制备生物海藻肥中的用途。根据本发明的一种优选实施方式，所述生物海藻肥的制备步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度28～30℃的条件下斜面培养2～3d，得到斜面培养物；b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养1～2d，得到种子培养物；c.制备海藻消化液粉碎的干燥海藻原料与弱碱水溶液混合均匀，然后在温度50～60℃与搅拌的条件下进行消化1～2h，得到一种海藻消化液；d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照0.1～10g/l蛋白胨、0.1～10g/l氯化钠、0.1～10g/l硫酸镁与0.1～10g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的1.5～2.5％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度28～30℃、通气量1:1.0～1.2、压力0.04～0.06mpa与转速100～200rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的生物海藻肥还含有一种选自大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的大分子聚谷氨酸发酵液是根据cn101109010b描述的方法由保藏编号为cgmccno.2108的枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)发酵培养得到的发酵液。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的小分子聚谷氨酸发酵液是根据cn104694437a描述的方法由保藏编号为cgmccno.8821的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis，b.licheniformis)lw发酵培养得到的发酵液。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的荧光假单胞菌发酵液是根据cn104152380a描述的方法由保藏编号为cgmccno.8820的紫外诱变型荧光假单胞菌(pseudomonasflorescens，p.florescens)f1发酵培养得到的发酵液。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液是根据cn105316266a描述的方法由保藏编号为cgmccno.11263的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx-j1发酵培养得到的发酵液。根据本发明的另一种优选实施方式，在含有所述发酵液的生物海藻肥中，枯草芽孢杆菌cgmccno.2108、地衣芽孢杆菌lw、紫外诱变型荧光假单胞菌f1与解淀粉芽孢杆菌lx-j1的有效活菌数分别是5亿/ml以上。根据本发明的另一种优选实施方式，在含有所述发酵液的生物海藻肥中，大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液与解淀粉芽孢杆菌发酵液的含量分别是以所述生物海藻肥总体积计10％～50％。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种弧菌(vibriosp.)lx6-2，该菌株已于2015年3月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为cgmccno.10659。下面将更加具体的描述该菌株的筛选过程。本发明人从腐烂海带中分离出42株细菌，经过下述平板筛选实验确定，其中19株菌株能够在平板培养的条件下不同程度地降解海藻酸，然后对19株菌株进行海藻酸降解初筛，其中7株菌株降解海藻酸效果更好，7株菌16srdna测序确定它们均为弧菌，其菌株编号分别列于表1中。详细筛选方法描述如下：在海边拾取的海带泡于海水中，在室温下放置7天、15天、30天时分别挑取海带腐烂部分，移至由5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉组成的ph7.0平板培养基上。恒温培养2-3天，海带上的微生物菌群得到富集。挑取一环富集菌苔于上述平板培养基上划线培养、纯化，经过反复多次的分离纯化，最终在不同时期不同腐烂程度的海带中分离出42株细菌。在平板上进行透明圈降解实验，将筛选菌株分别在上述平板培养基上划线培养3-4天，有19株菌可以不同程度地降解海藻酸，经初筛，其中7株菌降解效果较好，于是对这7株菌进行16srdna测序，确定它们均为弧菌。16srdna序列测定条件如下：样品总dna的制备：按常规的细菌dna提取方法进行。pcr引物：正向引物27f，反向引物1492r；pcr反应体系：反应体系体积：20μl，反应液组成：1μldna模板、10μl2×mastarmix、0.4μl27f、0.4μl1492r，超纯水补足至20μl。pcr扩增程序：95℃2min；30个循环(84℃1min，52℃1min，65℃8min)；65℃18min。扩增产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京三博远志公司测序。将测到的dna序列进行人工矫正后，使用ncbi中的biast软件在线比对，经过比对，所鉴定的9个菌株与弧菌的相似度为99％，所以断定这9个菌株均为弧菌属。为挑选出更适合处理海藻浸提液的菌株，进行了海藻浸提液处理的比较实验，实验方法如下：首先制备海藻浸提液。称取适量马尾藻，加入为马尾藻体积约10～20倍的水，再加入少量碳酸钠碱将其处理成稀浆糊状浆液，然后按照3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾，往这种浆液中加入蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾，得到所述的海藻浸提液。其次制备种子培养液。将初筛获得的7株菌株分别接种到含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0摇瓶种子培养基中，然后置于恒温摇床中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养1～2d，得到种子培养物；第三，按照海藻提取液体积的2％，将上述菌株种子培养物分别接入到上述海藻浸提液，在温度28～30℃下恒温匀速搅拌，在不同时间取样，采用乌氏粘度计法测定其粘度，其实验结果列于表1中：表1：7株弧菌菌株的海藻浸提液降解效果表1的实验结果清楚表明，弧菌lx6-2菌株(⑥-2)优势明显，在24h就可以将提取液的粘度可降低至60秒以下。弧菌lx6-2具有下述生物学特性：形态特征：通过显微镜和平板菌落观测，该菌属阴性杆菌，端生鞭毛，能运动，无芽孢。在液体培养条件下，该菌成细小杆状，无明显弯曲弧度。在固体培养平板条件下，培养2-3天时，菌落成圆形突起，直径0.5-1.0毫米，边缘整齐，菌落成淡黄色半透明状，表面湿润。结合该菌株的形态特征及16srdna测序结果，将该菌株命名为弧菌(vibriosp.)lx6-2，该菌株已于2015年3月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为cgmccno.10659。本发明还涉及所述的弧菌lx6-2在制备生物海藻肥中的用途。根据本发明，所述生物海藻肥的制备步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度28～30℃的条件下斜面培养2～3d，得到斜面培养物；在制备斜面培养物时使用的蛋白胨例如是由北京奥博星生物技术有限公司生产的商品名为胰蛋白胨产品；琼脂粉例如是由北京奥博星生物技术有限公司生产的商品名为琼脂粉的产品。在这个步骤中，使用的斜面培养设备都是目前市场上销售的产品，例如由上海实验仪器厂有限公司生产的恒温培养箱；灭菌所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由江阴滨江医疗设备有限公司生产的手提式压力蒸汽灭菌器或西安常仪仪器设备有限公司的高压灭菌锅产品。b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养1～2d，得到种子培养物；这个步骤使用的海藻酸钠是目前市场上销售的产品，例如由奥博星公司以商品名海藻酸钠销售的产品，其它试剂如前面所述或是化工
技术领域：
里通常使用的试剂。这个步骤使用的设备如前面所述，在此不再赘述。c.制备海藻消化液粉碎的干燥海藻原料与弱碱水溶液混合均匀，然后在温度50～60℃与搅拌的条件下进行消化1～2h，得到一种海藻消化液；本发明海藻消化液制备方法是根据cn201510287164.1、发明名称《一种活性海藻肥及其生产方法》专利申请说明书第0029-0039段所描述的方法。在本发明中，所述的海藻是一种或多种选自马尾藻、海带或泡叶藻的海藻。马尾藻、海带与泡叶藻都是目前市场上销售的产品。干燥海藻原料是使用目前食品加工
技术领域：
里通常使用的设备进行粉碎的，例如由上海化三粉体设备有限公司公司以商品名scf双轴微粉碎机销售的粉碎设备。干燥海藻原料粉碎粒度不是特别关键，但合适的粒度则有利于后续的消化处理。一般地，干燥海藻的粒度是50～200目。根据本发明，所述的弱碱是碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸氢钠，优选地是碳酸钾、碳酸氢钾或碳酸钠，更优选地是碳酸钾或碳酸氢钾。本发明使用的弱碱水溶液的浓度是0.001～0.004g/ml。如果所述弱碱水溶液浓度过高或过低都是不合适的，因为如果弱碱水溶液浓度高于0.004g/ml，则溶液ph偏高，会破坏海藻中天然营养物质的活性；如果弱碱水溶液浓度低于0.001g/ml，则弱碱对海藻的溶胀作用有限，影响后面的酶解工艺，活性物质提取率下降。根据本发明，所述海藻与所述弱碱的质量比为5～8:1。优选地，所述海藻与所述弱碱的质量比为6～8:1。更优选地，所述海藻与所述弱碱的质量比为7～8:1。在使用弱碱消化时需要不断搅拌，以便让海藻粉颗粒能与弱碱水溶液充分接触，消化反应完全。在这个步骤中，如果消化反应温度低于50℃，则消化反应进行不完全，海藻细胞壁的溶胀作用受限，不利于海藻中营养物质的溶出；如果消化反应温度高于60℃，则海藻中有效成分的活性受破坏，影响海藻肥的使用效果。因此，消化反应的温度为50～60℃，优选地是52～58℃，更优选地是54～56℃。在消化反应温度50～60℃的条件下，如果消化时间小于1h，则消化反应进行不完全，海藻细胞壁的溶胀作用受限，不利于海藻中营养物质的溶出；如果消化时间大于2h，则消化反应趋于平缓，造成能源的极大浪费，成本增加。因此，消化反应的时间为1～2h是合理的，优选地是1.2～1.8h，更优选地是1.4～1.6h。d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照0.1～10g/l蛋白胨、0.1～10g/l氯化钠、0.1～10g/l硫酸镁与0.1～10g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的1.5～2.5％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度28～30℃、通气量1:1.0～1.2、压力0.04～0.06mpa与转速100～200rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。采用高效液相色谱检测，本发明由lx6-2菌株发酵制备的生物海藻肥的赤霉素含量5000ppm以上，与常规化学处理方法和其他生物法相比，赤霉素含量提高了1-2倍，最大程度保护了海藻中原有活性物质，更加有效地促进了植物的生长发育和提高作物产量。根据本发明，所述的生物海藻肥还含有一种选自大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液的发酵液。在本发明中，含有大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液的生物海藻肥，也称之复合生物海藻肥。所述的大分子聚谷氨酸发酵液是根据cn101109010b描述的方法由保藏编号为cgmccno.2108的枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)发酵培养得到的发酵液。所述的小分子聚谷氨酸发酵液是根据cn104694437a描述的方法由保藏编号为cgmccno.8821的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis，b.licheniformis)lw发酵培养得到的发酵液。所述的荧光假单胞菌发酵液是根据cn104152380a描述的方法由保藏编号为cgmccno.8820的紫外诱变型荧光假单胞菌(pseudomonasflorescens，p.florescens)f1发酵培养得到的发酵液。所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液是根据cn105316266a描述的方法由保藏编号为cgmccno.11263的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx-j1发酵培养得到的发酵液。在本发明中，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，在含有所述发酵液的生物海藻肥中，枯草芽孢杆菌cgmccno.2108、地衣芽孢杆菌lw、紫外诱变型荧光假单胞菌f1与解淀粉芽孢杆菌lx-j1的有效活菌数分别是5亿/ml以上。根据本发明，在含有所述发酵液的生物海藻肥中，大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液与解淀粉芽孢杆菌发酵液的含量分别是以所述生物海藻肥总体积计10％～50％。另外，本发明生物海藻肥为母液配以上述其它功能型微生物菌液而得到的复合生物海藻肥，它除了具有本发明生物海藻肥本身功效外，还具有其它功能型微生物肥的功效，功能更加丰富和具体化，可以满足有不同需求的作物，有效的提高了施肥效率。本发明生物海藻肥按照其总体积的10％～50％与枯草芽孢杆菌cgmccno.2108发酵液混合得到的复合生物海藻肥，采用ctab法检测它的聚谷氨酸含量为3g/l～15g/l，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，它的枯草芽孢杆菌有效活菌数≥5亿/ml，这种复合生物海藻肥除具有本发明生物海藻肥的功能功效外，还具有促进土壤形成团粒结构，增强土壤通透性的土壤改良作用。本发明生物海藻肥按照其总体积的10％～50％与地衣芽孢杆菌cgmccno.8821发酵液混合得到的复合生物海藻肥，采用ctab法检测它的小分子聚谷氨酸含量为4g/l～20g/l，并且采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，它的地衣芽孢杆菌有效活菌数≥5亿/ml，这种复合生物海藻肥除具有本发明生物海藻肥的功能功效外，还具有明显提高植物抗旱抗逆能力，促生效果显著的功能。本发明生物海藻肥按照其总体积的10％～50％与荧光假单胞菌cgmccno.8820发酵液混合得到的复合生物海藻肥，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，它的荧光假单胞菌有效活菌数≥5亿/ml，这种复合生物海藻肥除具有本发明生物海藻肥的功能功效外，还对小麦全蚀病和辣椒青枯病有很好的防效；本发明生物海藻肥按照其总体积的10％～50％与解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11263发酵液混合得到的复合生物海藻肥，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，它的解淀粉有效活菌数≥5亿/ml，这种复合生物海藻肥除具有本发明生物海藻肥的功能功效外，还对禾谷丝核菌、立枯丝核菌、终极腐霉、白绢病菌、马铃薯黑痔病、花生白绢病都有很好的防治效果。[有益效果]本发明的有益效果是：本发明由lx6-2菌株发酵制备的生物海藻肥的赤霉素含量5000ppm以上，与常规化学处理方法和其他生物法相比，赤霉素含量提高了1-2倍，有效地促进植物生长发育和提高作物产量。本发明生物海藻肥为母液配以大分子聚谷氨酸发酵液、小分子聚谷氨酸发酵液、荧光假单胞菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液，得到的复合生物海藻肥除具有上述功能功效外，还具有促进土壤形成团粒结构，增强土壤通透性的土壤改良作用，具有明显提高植物抗旱抗逆能力，促生效果显著的功能，对小麦全蚀病和辣椒青枯病有很好的防效，对禾谷丝核菌、立枯丝核菌、终极腐霉、白绢病菌、马铃薯黑痔病、花生白绢病很好的防治效果。【具体实施方式】通过下述实施例将能够更好地理解本发明。实施例1：本发明生物海藻肥的制备该实施例的实施步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度28℃的条件下斜面培养2d，得到斜面培养物；b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度29℃与转速180rpm的条件下培养1d，得到种子培养物；c.制备海藻消化液按照海藻与弱碱的质量比为6:1，粉碎的干燥马尾藻原料与浓度为0.0034g/ml的碳酸钠水溶液混合均匀，然后在温度58℃与搅拌的条件下进行消化1.8h，得到一种海藻消化液；d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照0.1g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、6g/l硫酸镁与0.1g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的2.2％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度29℃、通气量1:1.0、压力0.04mpa与转速100rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。实施例2：本发明生物海藻肥的制备该实施例的实施步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度29℃的条件下斜面培养3d，得到斜面培养物；b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养2d，得到种子培养物；c.制备海藻消化液按照海藻与弱碱的质量比为7:1，粉碎的干燥马尾藻原料与浓度为0.002g/ml的碳酸氢钠水溶液混合均匀，然后在温度52℃与搅拌的条件下进行消化2.0h，得到一种海藻消化液；d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照2g/l蛋白胨、0.1g/l氯化钠、4g/l硫酸镁与5g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的1.5％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度28℃、通气量1:1.1、压力0.05mpa与转速200rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。实施例3：本发明生物海藻肥的制备该实施例的实施步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度30℃的条件下斜面培养2d，得到斜面培养物；b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度30℃与转速180rpm的条件下培养1d，得到种子培养物；c.制备海藻消化液按照海藻与弱碱的质量比为5:1，粉碎的干燥海带原料与浓度为0.001g/ml的碳酸氢钾水溶液混合均匀，然后在温度50℃与搅拌的条件下进行消化1.0h，得到一种海藻消化液；d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照10g/l蛋白胨、7g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与10g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的1.8％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度30℃、通气量1:1.2、压力0.06mpa与转速140rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。实施例4：本发明生物海藻肥的制备该实施例的实施步骤如下：a.弧菌lx6-2斜面培养制备斜面培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁、2g/l磷酸氢二钾与20g/l琼脂粉的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的斜面培养基；将弧菌lx6-2菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后在恒温培养箱中在温度29℃的条件下斜面培养3d，得到斜面培养物；b.种子培养制备种子培养基：配制含有5g/l海藻酸钠、3g/l蛋白胨、3g/l氯化钠、0.1g/l硫酸镁与2g/l磷酸氢二钾的ph7.0水溶液，然后在温度121℃的条件下灭菌30min，得到所述的种子培养基；使用接种环取一环步骤a得到的斜面培养物，将它接种到所述的种子培养基中，然后在恒温摇床中在温度29℃与转速180rpm的条件下培养2d，得到种子培养物；c.制备海藻消化液按照海藻与弱碱的质量比为8:1，粉碎的干燥泡叶藻原料与浓度为0.004g/ml的碳酸钾水溶液混合均匀，然后在温度60℃与搅拌的条件下进行消化1.2h，得到一种海藻消化液；d.生物海藻液的发酵在装有海藻消化液的发酵罐中，按照8g/l蛋白胨、10g/l氯化钠、10g/l硫酸镁与5g/l磷酸氢二钾，把蛋白胨、氯化钠、硫酸镁与磷酸氢二钾培养基成分加到步骤c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液体积的2.5％，把步骤b得到的种子培养物接入到发酵罐中，在温度29℃、通气量1:1.1、压力0.05mpa与转速160rpm的条件下恒温搅拌24h，海藻消化液完全发酵，得到所述的生物海藻肥。采用高效液相色谱法检测了实施例1-4制备的生物海藻肥的赤霉素含量，以及从市场中购买的由某公司生物酶法处理得到的液体海藻肥产品与从市场上销售的由化学法生产的液体海藻肥产品对照产品的赤霉素含量，这些结果列于表1中。表1：不同方法生产的海藻肥中赤霉素含量分析结果赤霉素(ppm)某厂家生物酶法生产的海藻液肥产品2284.535某厂家化学法生产的海藻液肥产品2564.006实施例1制备的海藻液肥产品5503.142实施例2制备的海藻液肥产品5211.688实施例3制备的海藻液肥产品5475.269实施例4制备的海藻液肥产品5383.867表1列出的结果表明，与常规化学处理方法和其他生物法相比，本发明方法制备的产品的赤霉素含量提高了1-2倍，因此能够最大程度地保护海藻中原有活性物质，更加有效地促进了植物的生长发育和提高作物产量。试验实施例1：含枯草芽孢杆菌的复合生物海藻肥的应用试验该复合生物海藻肥含有以体积计50％本发明生物海藻肥与50％枯草芽孢杆菌cgmccno.2108发酵液。枯草芽孢杆菌cgmccno.2108是一株高产大分子聚谷氨酸的菌株，大分子聚谷氨酸对改善土壤团粒结构具有明显的作用。本试验实施例使用的是实施例1制备的生物海藻肥；本试验实施例使用的枯草芽孢杆菌cgmccno.2108发酵液是采用领先生物农业股份有限公司拥有的、cn101109010b、发明名称《一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法》中描述发酵方法制备的发酵液；采用cn201510127399.4、发明名称《一株地衣芽胞杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途》中描述提取与纯化方法，从上述发酵液中提取聚谷氨酸并进行了纯化。i、聚谷氨酸对土壤团粒结构的作用将土样风干，在土样潮湿时将大块土用手掰碎，除去植物根系及小石块，准确称量每份为700g的土样。设置3个处理，其大分子聚谷氨酸质量浓度分别为0％(ck)、0.3％、0.6％。将称量风干土样与大分子聚谷氨酸混合均匀装入盆钵中，浇150ml水，重复2次，根据沙维诺夫分级法(湿筛法)的标准方法检测在处理10个月后土壤团粒结构，其检测结果列于表2中。表2：聚谷氨酸纯品对土壤团粒结构的改良作用由表2列出的结果可以看出，纯聚谷氨酸对促进土壤团粒结构具有明显的作用。ii、复合生物海藻肥对土壤团粒结构的作用取供试土样，准确称量一份为1000g的土样。以体积计50％本发明生物海藻肥与50％枯草芽孢杆菌cgmccno.2108发酵液混合得到的复合生物海藻肥含有16g/l聚谷氨酸。将这种复合生物海藻肥用水稀释100倍，按照每次300ml将稀释复合生物海藻肥浇灌到土样中，半个月一次，连续浇灌5次，以清水浇灌为对照，根据沙维诺夫分级法(湿筛法)的标准方法检测在处理10个月后土壤团粒结构，其检测结果列于表3中。表3：复合生物海藻肥对土壤团粒结构的改良作用名称>5mm(％)2～5mm(％)1～2mm(％)0.5～1mm(％)0.25～0.5mm(％)汇总(％)ck1.255.99811.16416.76820.81855.998复合生物海藻肥2.4267.94411.95417.74419.79859.866由表2列出的结果可以看出，本发明复合生物海藻肥对土壤团粒结构具有明显的改善作用。试验实施例2：含荧光假单胞菌的复合生物海藻肥的小麦全蚀病防治试验该复合生物海藻肥含有以体积计80％本发明生物海藻肥与20％荧光假单胞菌cgmccno.8820发酵液，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，荧光假单胞菌cgmccno.8820为7.2亿/ml。其中，本试验实施例使用的生物海藻肥是实施例2制备的生物海藻肥；本试验实施例使用的荧光假单胞菌cgmccno.8820发酵液是采用领先生物农业股份有限公司的cn201410386364、发明名称《一株紫外诱变型荧光假单胞菌及其用途》中描述的发酵方法制备的发酵液。试验地点：秦皇岛抚宁地区，全蚀病发病严重地块。试验方法，该试验设置三个处理：ck：基肥处理1：基肥+本发明生物海藻肥处理2：基肥+含荧光假单胞菌的复合生物海藻肥其中：基肥为每亩n量23kg、p2o5量15kg、k2o量23kg。从小麦出苗期开始施肥直到分蘖期共施肥2次，每次用量为20l/亩，浇灌，在小麦结穗期开始调查，在此期间观察小麦长势情况及全蚀病的发病情况。调查结果列于表4中。表4：不同处理的小麦生长势况调查分别调查200棵小麦全蚀病发病情况，根据下式能够计算出平均防治效果。防效(％)＝(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数×100％调查结果如下：对照处理的小麦全蚀病病情指数为97％，处理1使用本发明生物海藻肥浇灌，小麦全蚀病病情指数为47％，只是使用本发明生物海藻肥除促进生长外，还提高了植株的抗病性，防病效果达51.5％；处理2使用了本发明复合生物海藻肥的小麦全蚀病的病情指数为10％，防病效果达到89.7％。这些调查结果表明，本发明含有荧光假单胞菌的复合生物海藻肥除了对植株生长具有明显的促进作用外，还起到了很好防治效果，提高了施肥效率，降低了用肥成本。试验实施例3：含地衣芽孢杆菌的复合生物海藻肥的小白菜应用试验该复合生物海藻肥含有以体积计70％本发明生物海藻肥与30％地衣芽孢杆菌cgmccno.8821发酵液，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，地衣芽孢杆菌是8.5亿/ml；其中，本试验实施例使用的生物海藻肥是实施例3制备的生物发酵液；本试验实施例使用的复合生物海藻肥是采用领先生物农业股份有限公司的、cn201510127399.4、发明名称《一株地衣芽胞杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途》中描述的发酵培养方法制备得到发酵液；该试验在泡沫箱中进行，通过控水验证肥料对小白菜抗旱的影响。试验方法：该试验设置四个处理，每组2个平行；处理1：不控水(清水浇灌，按正常供水，持水量65％～75％)处理2：控水(清水浇灌，中度干旱，持水量40％～50％)处理3：控水(浇灌本发明生物海藻肥，中度干旱，持水量40％～50％)处理4：控水(浇灌本发明复合生物海藻肥，中度干旱，持水量40％～50％)每个泡沫箱中装9kg土；设计控水量为中度干旱(土壤最大持水量的40％～50％)，苗期首次施肥后开始控水，待自然干旱至设定的土壤含水量标准范围后，在每晚17:00～18:00用数字水分仪测定土壤含水量，并补水控水，整个生长期35天，共计施肥2次(20l/亩用量)。试验结果列于表5中。表5：在生长期结束后调查各处理小麦生长情况：处理1处理2处理3处理4株高cm27.7818.5629.1630.8鲜重g/株16.955.3620.9628.17从试验结果可以看出，添加含地衣芽胞杆菌发酵液的复合生物海藻肥能明显提高植物的抗旱抗逆性，在干旱缺水的条件下仍能保持良好的生长趋势。试验实施例4：含解淀粉芽孢杆菌复合生物海藻肥的平板抑菌试验该复合生物海藻肥含有以体积计60％本发明生物海藻肥与40％解淀粉芽孢杆菌cgmccno.8821发酵液，采用本
技术领域：
的技术人员熟知的平板活菌计数法检测，解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数是8.3亿/ml；其中，该试验实施例使用的复合生物海藻肥是实施例4制备的发酵液；该试验实施例使用的解淀粉芽孢杆菌发酵液是采用领先生物农业股份有限公司的、cn201510894025、发明名称《一株解淀粉芽孢杆菌lx-j1及其用途》中描述的制备方法制备得到的发酵液。平板抑菌试验如下：制备pda固体培养基：按照200g/l比例把去皮土豆置于水中煮沸30min，冷却，再用2层纱布进行过滤，接着按照20g/l蔗糖与20g/l琼脂，往得到的滤液中添加蔗糖与琼脂，灭菌，得到所述的pda固体培养基。将禾谷丝核菌、立枯丝核菌、终极腐霉菌、花生白绢病菌、马铃薯黑痔病菌的菌饼分别接种在上述制备的pda固体培养上，在温度25℃下培养4-5d，待病原真菌长满整个培养皿。拮抗效果测定：首先用打孔器从培养皿中取其直径约6mm的病原菌菌饼，置于pda平板中心，分别在其左右两侧约150mm处打孔，并加入20μl本发明含解淀粉芽孢杆菌的复合生物海藻肥；同时以不加所述复合生物海藻肥作为对照，在温度25℃下培养4-5d，待对照长满整个培养皿，记录复合生物海藻肥对各病原菌的抑菌直径，其试验结果列于表6中，并根据下述公式计算得到相应的抑菌率：菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径)/对照菌落净生长直径×100％表6：本发明复合生物海藻肥抑菌效果病原菌禾谷丝核立枯丝核终极腐霉花生白绢病马铃薯黑痣病抑菌率87.6％69.8％88.7％76.4％72.9％表6的结果清楚地表明，解淀粉芽孢杆菌lx-j1与本发明生物海藻肥复配，即本发明复合生物海藻肥，对禾谷丝核菌、立枯丝核菌、对终极腐霉、花生白绢病、马铃薯黑痔病菌仍有较强的抑制效果，也就是说复配后该款功能型海藻肥除具有生物海藻肥的基础功效外，还可以对植物病害起到有效的防治，一举多得。当前第1页12