一种海参酶解‑醇提取组分的制备方法及其制备得到的醇提取组分和应用与流程

本发明属于海洋生物技术及功能食品技术领域，更具体地，涉及一种海参酶解物醇提取组分的制备方法及其制备得到的醇提取组分和应用。

背景技术：

随着世界人口老龄化的加剧和老年痴呆（alzheimer’sdisease,ad）发病率的不断增加，寻找抗老年痴呆的新药已迫在眉睫。而海洋生物中蕴藏着丰富的活性物质，可望在此方面造福人类。

不少研究发现，需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基会对脑组织造成损害，促进脑细胞的衰老和死亡，而且自由基还能损害细胞染色体，使第21号染色体畸变，从而发生ad。而抗氧化剂不仅能够稳定细胞膜，消除活性氧，同时还能抑制和清除脑内β淀粉样蛋白沉积，从而来预防和保护神经细胞免受损伤，从而延缓ad的发展进程。同时抗氧化剂对于延缓衰老及防治其他神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病均有重要的应用价值。

基于抗氧化剂的广泛用途，因此筛选具有抗氧化功能的海洋功能食品或药物具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种海参酶解物醇提取组分的制备方法。

本发明同时提供上述制备方法制备得到的醇提取组分。

本发明还提供上述醇提取组分的应用。

本发明要解决的技术问题是克服现有抗氧化及老年痴呆功能食品与药物的不足，提供海参来源的天然抗氧化活性成分，该活性成分具有很好的抗氧化活性，在制备抗氧化及相关的抗老年痴呆等神经退行性疾病的保健品与药物方面具有很好的应用前景。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种海参酶解物醇提取组分的制备方法，包括如下步骤：

s1.采用混合酶进行海参的酶解，所述混合酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶的加入量依次为海参重量的0.15~0.25%，0.1~0.15%，0.05~0.15%；所述酶解的温度为50~55℃，酶解的时间为3.5~4.5h，酶解的料液比为1：（1~3）；

s2.将酶解后的酶解液浓缩后，干燥至固体含水量低于5%；

s3.将干燥后的酶解液进行逐级溶液除杂提取，其中，一级除杂溶剂为正己烷，二级除杂溶剂为二氯甲烷，三级除杂溶剂为乙酸乙酯，除杂完成后，醇提2~3次，合并提取液，除去溶剂，得到海参酶解物醇提取组分。

优选地，s3步骤一级除杂中每kg固体物料按照4~6l的溶剂比例加入溶剂，一级除杂为先将干燥后的酶解液用溶剂浸泡20~30h，然后超声提取1~3次，超声功率为200~400w，超声提取的温度为25~35℃，超声提取时间为0.5~1.5h。

优选地，s3步骤二级除杂和三级除杂的超声提取次数，超声功率，超声温度与一级除杂相同。

优选地，s3步骤二级除杂和三级除杂的超声提取时间为0.5h，二级除杂和三级除杂的溶剂浸泡时间为1h。

优选地，s3步骤一级除杂的超声提取时间为1h。

优选地，s3步骤采用无水甲醇醇提3次。

优选地，s1步骤中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的加入量依次为海参重量的0.2%、0.125%和0.1%；所述酶解的温度为52℃，酶解的时间为4h，酶解的料液比为1：1.5。

本发明同时保护所述的制备方法制备得到的海参酶解物醇提取组分。

进一步地，所述海参酶解物醇提取组分在制备抗氧化及抗老年痴呆类神经退行性疾病的保健品与药物中的应用。

茚三酮显色表明，醇提取组分的主要成分为在gf254薄层层析硅胶板上显紫红色、rf值分别为0.31和0.55的肽类物质，另外碘化铋钾试剂显色表明该组分还含有少量在gf254薄层层析硅胶板上显桔黄色、rf值为0.14的生物碱类成分。

本发明针对醇提取组分进行了hplc分析，综合显色和hplc结果表明，其活性组分的主要成分为小肽和生物碱。

本发明通过dpph（1,1-二苯基-2-苦肼基）自由基清除法和改良后的prieto法评价了醇提取组分的抗氧化活性。结果显示，其在1mg/ml浓度下对dpph自由基的清除率为15%（同剂量下阳性对照维生素c的清除率为25%），在1mg/ml浓度下将mo(vi)还原成mo(v)络合物达到的吸光度可达0.18（表征总抗氧化能力，优于对照bht，同剂量下bht仅为0.08）。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提取来源为天然物质海参，安全可靠，且抗氧化活性好，经过提取后的海参活性成分可以用于制备抗氧化及相关的抗老年痴呆等神经退行性疾病的保健品与药物，为天然来源的抗氧化活性产品提供了很好的制备原料，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为活性组分的hplc-dad分析谱图。（检测波长从上到下依次为254、210、260、280nm）

图2为保留时间为1.3min的主要色谱峰的紫外光谱图。

图3为保留时间为1.5min的主要色谱峰的紫外光谱图。

图4为保留时间为1.9min主要色谱峰的紫外光谱图。

图5为保留时间为3.3min的主要色谱峰的紫外光谱图。

图6为保留时间为5.9min的主要色谱峰的紫外光谱图。

图7为保留时间为20.6min的主要色谱峰的紫外光谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1：

（1）海参酶解：每1kg鲜海参洗净后，切碎投入酶解罐，加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶（加入量是按照海参重量依次为0.2%、0.125%和0.1%)，料液比为1:1.5，酶解温度为52℃，酶解时间为4小时。

（2）酶解液干燥：将1l酶解液经50℃以下减压浓缩至较小体积，分装入浅盘中，进行真空冷冻干燥至固体含水量低于5%；

（3）逐级溶剂除杂提取：对步骤（2）中所述固形物采用逐级溶剂除杂提取法得到活性组分，一级除杂溶剂为正己烷，溶剂与固体物料的液料比为5l/kg，先浸泡24h后，采用超声波辅助提取1次，超声功率300w，提取温度为30℃，超声提取1小时，超声完毕经抽滤得到固体用于下一次处理，第二次、第三次的浸泡时间为1小时、超声处理时间为0.5小时；经一级除杂溶剂处理得到的固体用于下一级除杂处理，二级除杂溶剂为二氯甲烷，类似超声提取操作；三级除杂溶剂为乙酸乙酯，类似超声提取操作；经过上述除杂过程后，使用无水甲醇作为目标组分的提取溶剂，类似超声提取操作，合并三次提取得到的醇提取液，即为含目标活性组分的提取液；

（4）目标组分的干燥：将步骤（3）所述醇提取液经50℃以下减压浓缩至干燥，除尽有机溶剂，即为所需目标活性组分。

茚三酮显色表明，该组分的主要成分为在gf254薄层层析硅胶板上显紫红色、rf值分别为0.31和0.55的肽类物质，另外碘化铋钾试剂显色表明该组分还含有少量在gf254薄层层析硅胶板上显桔黄色、rf值为0.14的生物碱类成分，上述层析分析所用展开剂为冰乙酸：正丁醇=1：1。

还对该组分进行了hplc分析，液相型号为agilent1260hplc-dad系统，色谱分析条件如下：色谱柱为poroshell120ec-c18，尺寸为150mm×4.6mm，粒径4µm，系统为乙腈-水，0～10min5%乙腈等度洗脱，10～20min5%~100%乙腈线性梯度洗脱，20～30min100%乙腈等度洗脱，流速1ml/min，检测波长210、254、260、280nm。图1为活性组分的hplc-dad分析谱图。结果表明：该组分含有的主要特征色谱峰保留时间为1.3、1.5、1.9、3.3、5.9和20.6min，其紫外特征光谱见图2~图7。其中保留时间为5.9min与20.6min的色谱峰在280nm附近有较强吸收峰，为典型的含芳香族氨基酸的肽类特征。

实施例2海参活性成分清除dpph自由基的活性测定

1、实验方法（dpph自由基清除法）：

原理：1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(dpph)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长接近540nm。当dpph溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在540nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

操作步骤：在96孔板中依次加入系列剂量的样品甲醇溶液，晾干后加入100µldmso，再加入100µl0.16mmol/ldpph甲醇溶液，混匀，一系列孔中样品的终浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml，对照用甲醇代替dpph溶液；空白组是在100µldpph中加入100µldmso混合，对照组用100µl甲醇溶液代替dpph。室温暗处放置30min，于540nm处测定吸光度，分别记为a1、a2、a3、a4。

清除率%=100-(a1-a2)×100/(a3-a4)

式中，a1为实验组的吸光值；a2为实验对照组的吸光值；a3为空白组的吸光值；a4为空白对照组的吸光值。

平行测定3次，计算不同样品浓度下对dpph自由基的清除率，并取相应平均值，并以vc作阳性对照(即用vc代替样品液的测量）。

2、实验结果

该组分具有抗氧化活性，其在1mg/ml浓度下对dpph自由基的清除率为15%（同剂量下阳性对照维生素c的清除率为25%）。

实施例3海参活性成分总抗氧化活性的测定

1、实验方法（改良后的prieto法）：

原理：磷钼络合物测定方法的原理是mo(vi)被抗氧化物质还原成绿色的mo(v)络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。

操作步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24、0.48、0.72、0.96、1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/l的硫酸、28mmol/l的磷酸钠、4mmol/l的钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90min、120min、150min。

放冷至室温，695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。bht做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。

2、实验结果

在1mg/ml浓度下将mo(vi)还原成mo(v)络合物达到的吸光度可达0.18（表征总抗氧化能力，优于对照bht，同剂量下bht仅为0.08）。