一种家蚕BmBDV的LAMP‑LFD快速试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术：

家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科浓核病毒亚科，该病毒具有高致死率，感染持续时间较长，引起慢性蚕病，是我国夏秋季节蚕茧等经济产品减产的重要原因之一。研究表明，BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20-24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号DQ017268和DQ017269）。目前该病毒的检测方法主要为常规PCR检测法，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，反应时先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增。该技术简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察、侧向流层析试纸技术(LFD)等方法。

其中，LAMP-LFD法使得反应结果可以直接用肉眼观察，具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。而且截止目前，该技术在家蚕BmBDV的检测中未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一种通过快速检测家蚕BmBDV的环介导恒温扩增方法检测家蚕家蚕二分浓核病毒的方法，并提供一种用于以上目的的LAMP-LFD检测试剂盒。所述试剂盒特异性强，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合家蚕BmBDV的筛查。

本发明所述的家蚕BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒包括：BmBDV病毒 LAMP预反应液：所述预反应液包括引物BmBDV-FIP和BmBDV-BIP、引物 BmBDV-F3和BmBDV-B3、引物BmBDV-LF和BmBDV-LB、 探针BmBDV-FITC-PROBE；

其中所述引物BmBDV-FIP如SEQ ID NO:3所示，引物BmBDV-BIP如SEQ ID NO:4所示，引物 BmBDV-F3如SEQ ID NO:1所示，引物BmBDV-B3如SEQ ID NO:2所示，引物BmBDV-LF如SEQ ID NO:5所示，引物 BmBDV-LB如SEQ ID NO:6所示， 探针BmBDV-FITC-PROBE如如SEQ ID NO:7所示。

所述LAMP预反应液中各引物和探针含量为：1.5～2.0mM 引物BmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mM引物 BmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mM 引物BmBDV-LF和BmBDV-LB，0.05～0.1μM 探针BmBDV-FITC-PROBE。

所述LAMP预反应液还包括：20～40mM Tris-HCl (pH8.0～9.0)， 10～15mM 氯化钾， 15～20mM 硫酸铵， 8～10mM 硫酸镁， 0.1～0.2% Triton X-100，1.2～1.4mM dNTP， 6-8U Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs），0.6～0.8M 甜菜碱。

其中所述的引物序列具体为：

BmBDV-F3 （SEQ ID NO:1）: 5’-TCTGACGTTGGTGGAAGT-3’ BmBDV-B3（SEQ ID NO:2）: 5’-AACTTGCTTTCCACTCGA-3’ BmBDV-FIP（SEQ ID NO:3）:

5’-biotin-TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT-3’ BmBDV-BIP（SEQ ID NO:4）:

5’-GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG-3’ BmBDV-LF（SEQ ID NO:5）: 5’-ACCGCCCCCAGACACATT-3’ BmBDV-LB（SEQ ID NO:6）: 5’-GGAGGTGCTTCAGCAGAGG-3’ 所属探针序列为：

BmBDV-FITC-PROBE（SEQ ID NO:7）: 5’-FITC-TAGAGGAGGTGCTTCAGCAGAG-3’

本发明所述的家蚕BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒，所述试剂盒中还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品、阴性对照样品以及LAMP核酸反应管中添加有稳定液，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为BmBDV病毒基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的去离子水，核酸反应稳定液为液体石蜡油。

本发明还提供一种家蚕BmBDV病毒的检测方法，所述检测方法采用上述BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒进行检测，按照下述步骤进行检测：

S1.家蚕样品中BmBDV基因组DNA的快速提取：

取20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入80～100μL组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，95℃变性5min，取2～5μL作模板。组织裂解液包含50～100mM Tris-HCl, 1～4mM EDTA,pH7.0～8.0,100～200μg/mL蛋白酶K和RNase A，0.1～0.2M NaCl。

S2.家蚕BmBDV病毒LAMP扩增：

（1）根据待检样品数，配制所需的预反应液，在预反应液中加入2～5μL DNA模板，再加入适量的去离子水，使反应体系总体积为25μL。然后在61℃～65℃下反应30～60min。

（2）标记清楚后，将检测反应管置于61-65℃，反应30～60min，80℃灭活；其中最适反应温度为62℃，最适反应时间为30min。

S3.家蚕BmBDV病毒LFD试纸检测：

（1）取家蚕BmBDV病毒LAMP扩增产物6～10μL，置于LFD试纸加样孔；

（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50～100μL缓冲液，待缓冲液移动到试纸的另一端，表明反应基本结束，根据显色条带情况判断LAMP-LFD检测的结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。

本发明所述的LFD检测试纸，是在改良胶体金技术的基础上，利用生物素（biotin）和FITC抗体等制备的侧向层析检测试纸。

与现有检测技术比较，本发明所提供的家蚕BmBDV病毒LAMP-LFD检测方法具有以下优点：

（1）本发明的快速诊断试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的10³倍左右（图2，3）；

（2）本发明的快速诊断试剂盒检测时间短，可以在45min内获得检测结果，比常规PCR节约3～4小时；

（3）本发明中的DNA提取方法简单快捷，不需要用到离心机，一步就可以进行后续LAMP反应，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质；

（4）本发明的快速诊断试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统；

（5）本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果较染料法直观易判定（图1，2，4），处于生产一线的技术员和养殖户都可以按步骤指导进行操作；

（6）本发明的检测试剂盒对人和环境较安全，整个过程不使用有毒物质。

附图说明

图1为LAMP扩增产物进行凝胶电泳（A）和LFD试纸显色结果图（B）；图中M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；左侧泳道1～9：模板分别为10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的基因组DNA；右侧1～6：为左侧实验结果的LFD试纸检测图。

图2为检测BmBDV LAMP病毒特异性实验结果；图中A为LAMP扩增凝胶电泳结果；B为LAMP-LFD检测结果；图A中，M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)泳道1：家蚕二分浓核病毒（BmBDV）；泳道2：家蚕浓核病毒（BmDNV）；泳道3：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；泳道4：家蚕微孢子虫（N. b.）；泳道5：阴性对照。

图3为LAMP荧光显色法和普通PCR方法；图中M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；左侧泳道（图A）1～5：模板分别为10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的基因组DNA；中间（图B）为图A泳道对应的LAMP普通显色方法；右侧（图C）1～5：为同样模板的PCR检测图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

所需材料：

感染家蚕BmBDV病毒的样本来源于本实验室（江苏大学生命科学研究院）；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；dNTP、购自promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。

S1. 家蚕BmBDV样品DNA的快速提取：

取20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入100μL组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，95℃变性5min，取5μL作模板。

S2. 家蚕BmBDV病毒LAMP恒温扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应数量的预反应液（1.6mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP,0.2mM BmBDV-F3，BmBDV-B3，BmBDV-LP和BmBDV-LB，0.05μM BmBDV-FITC-PROBE,20mM Tris-HCl, 10mM 氯化钾, 15 mM 硫酸铵, 8mM 硫酸镁, 0.1% Triton X-100,0.6M 甜菜碱，1.4mM dNTP, 8U Bst DNA 聚合酶大片段），每管检测预反应液体积为20μL；

（2）分别吸取5μL待检样品加入核酸检测反应管中，混合均匀；

（3）标记清楚后，将检测反应管置于62℃水浴锅中，反应30min；

S3. 家蚕BmBDV病毒LAMP扩增产物进行凝胶电泳：

（1）配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入6μL的反应产物；

（2）电泳30分钟后凝胶成像，结果见图1的A图。

S4. LAMP扩增产物的LFD试纸检测：

（1）取BmBDV病毒LAMP扩增产物6μL，置于LFD试纸加样孔；

（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50μL缓冲液（上文提到的缓冲液为1×TAE缓冲液），待缓冲液移动基本结束，判断LAMP-LFD检测结果，见图1的B图。

图1 A侧图可见阶梯状的扩增条带，再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图1 B图可见与电泳结果吻合，本发明的试剂盒和检测方法，可以灵敏有效的检测整蚕、蚕沙或家蚕血淋巴中的BmBDV病毒，并且，重复试验验证，检测结果稳定可靠。

实施例2：

所需材料：

感染家蚕BmBDV病毒，家蚕浓核病毒BmDNV，家蚕核型多角体病毒BmNPV，家蚕微孢子虫N. b.的样本均采集自江苏大学生命科学研究院；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；dNTP、购自promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。

家蚕二分浓核病毒（BmBDV）、家蚕浓核病毒（BmDNV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和家蚕微孢子虫（N. b.）来源于江苏大学生命科学研究院。

S1.样品DNA的快速提取：

分别取家蚕感染不同病原体的20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入100μL组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，95℃变性5min，取5μL作模板。

S2. LAMP恒温扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应数量的预反应液（1.6mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP,0.2mM BmBDV-F3，BmBDV-B3，BmBDV-LP和BmBDV-LB，0.05μM BmBDV-FITC-PROBE,20mM Tris-HCl, 10mM 氯化钾, 15 mM 硫酸铵, 8mM 硫酸镁, 0.1% Triton X-100,0.6M 甜菜碱，1.4mM dNTP, 8U Bst DNA 聚合酶大片段），每管检测预反应液体积为20μL；

（2）分别吸取5μL待检样品加入核酸检测反应管中，混合均匀；

（3）标记清楚后，将检测反应管置于62℃水浴锅中，反应30min；

S3. LAMP扩增产物进行凝胶电泳：

（1）配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入6μL的反应产物；

（2）电泳30分钟后凝胶成像，结果见图2 A图。

S4. LAMP扩增产物的LFD试纸检测：

（1）取BmBDV病毒LAMP扩增产物6μL，置于LFD试纸加样孔；

（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50μL缓冲液（上文提到的缓冲液为1×TAE缓冲液），待缓冲液移动基本结束，判断LAMP-LFD检测结果，见图2B图。

图2为BmBDV LAMP特异性实验结果图；图中A为LAMP扩增凝胶电泳结果；B为LAMP-LFD检测结果；分别将家蚕二分浓核病毒（BmBDV）、家蚕浓核病毒（BmDNV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和家蚕微孢子虫（N. b.）作为反应模板，结果显示，本发明的方法检测结果与电泳结果吻合，具有非常好的特异性，对家蚕二分浓核病毒的检测精准，结果的观察更直观明了。

图3为LAMP荧光显色法和普通PCR方法比较的结果；M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；左侧泳道（A）1～5：模板分别为10-5，10-6，10-7，10-8，10-9倍稀释的基因组DNA；中间（B）泳道为A图对应的LAMP普通显色方法；右侧（C）1～5：为同样模板的PCR检测图。

从图3可以看出LAMP方法比普通PCR方法灵敏1000倍，LAMP-LFD比LAMP普通显色方法更加易于观察。

根据以上实验结果表明，BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒和检测方法可以快速、简便、灵敏的进行该病毒的现场检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法

<130> 一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctgacgttg gtggaagt 18

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<212> DNA

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<400> 2

aacttgcttt ccactcga 18

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaggcgtcc ataggacctt ttttggaagt ggaaaacgca gt 42

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<211> 44

<212> DNA

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<400> 4

gaggatctgg aggtggtggt ttttttggct tgtaaatagg ttgg 44

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

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<400> 5

accgccccca gacacatt 18

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<212> DNA

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<400> 6

ggaggtgctt cagcagagg 19

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagaggaggt gcttcagcag ag 22