牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及牛副流感病毒检测技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

牛副流感病毒(Bovine parainfluenza type-3virus，BPIV3)是能够引起牛急性呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的重要病原体之一，是单股负链RNA病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科、呼吸道病毒属的成员。1959年美国首次从牛体分离到该病毒，目前在我国各省份广泛存在，给养牛业带来巨大的经济损失。在规模化养殖厂2至6月龄犊牛感染发病率很高，死亡率低，易继发细菌感染，死亡率可达到20％以上，犊牛感染愈后再次感染症状不明显，在无临床症状的牛上也可分离到此病毒。牛副流感病是牛群的一种常发病，在牛群中较长期存在，气温骤降或长途运输等应激条件下可引起疫情暴发。

目前，主要采用ELISA、中和实验、免疫组化、血凝抑制试验检测和RT-PCR、多重PCR、LAMP等方法检测牛副流感病毒。然而，现有检测牛副流感病毒3型病毒的方法普遍存在灵敏性较低、假阳性较高的缺点，并且，现有检测方法大多数采用国外进口试剂，相比国内，国外进口试剂价格昂贵，导致检测成本增加。

纳米颗粒技术是当前研究的热点，其良好的应用前景目前被广泛应用于各个研究领域，纳米PCR技术是近年发展的一种新型PCR技术。2005年，我国学者李海阔首次报道金纳米粒子辅助的PCR方法，大大提高了PCR反应的特异性。因纳米PCR具有灵敏度高、特异性好、分析速度快、操作简便等优点，检测结果可靠，近年来在疫病临床诊断中得到了广泛运用。

技术实现要素：

为了解决现有牛副流感病毒3型病毒检测方法存在的灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本发明提供一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，

P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有422个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)配制nano-PCR反应液

所述反应液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，

P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；

(2)建立牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。

作为优选的实施方式，所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛副流感病毒3型病毒的NP基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为422bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

作为优选的实施方式，以P1和P2为引物进行PCR扩增的反应条件为：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

作为优选的实施方式，所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μL。

本发明的有益效果是：

1、本发明根据牛副流感病毒3型病毒基因组的保守基因NP序列设计一对特异性引物，通过组装得到检测牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，与现有技术相比，本发明的nano-PCR检测试剂盒可以在低核酸含量、退火温度温差范围10℃内，退火时间5秒以内检测被检测样品中是否含有牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)核酸，具有较高的特异性和敏感性，敏感性是常规RT-PCR的10倍，比常规RT-PCR技术高效灵敏特异的特点，可以对牛群中感染和发病动物进行准确检测。

2、本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒可以对细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等多种样品的牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性高。

3、本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒可在收到样品7小时内给出进行定性检测结果，省时省力，是一种检测牛副流感病毒3型病毒早期发病和预后筛查的有效工具。

4、相比采用国外进口试剂，本发明采用的试剂均为实验室自行保存的，试剂成本大大降低，从而降低整个检测的成本。

5、本发明针对牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)利用纳米金与PCR分子检测技术，建立BRSV高灵敏度、简便、快速高效的纳米PCR检测试剂盒，可以用于实现对BPIV3的快速诊断，对疫病早期发现和控制具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的特异性检测电泳图。图中：M为DL2000DNAMarker，1为BPIV3引物nano-PCR结果，2为IBRV阳性对照模板，3为BVDV阳性对照模板，4为BRSV阳性对照模板，5为阴性对照。

图2为本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的敏感性检测电泳图。图中：BPIV3阳性对照重组质粒的检测浓度为4.16×10⁸拷贝/μL～4.16×10¹拷贝/μL。

图3为本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的敏感性普通RT-PCR对比检测电泳图。图中：BPIV3阳性对照重组质粒的检测浓度为4.16×10⁸拷贝/μL～4.16×10¹拷贝/μL。

图4为本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的临床BPIV3病毒样品检测电泳图。图中：M为DL2000DNAMarker，5、7、10、11均为BPIV3病毒的阳性检测结果，2、3、4、6、8、9均为BPIV3病毒的阴性检测结果，1为阴性对照。

图5为本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的临床BPIV3病毒样品普通RT-PCR对比检测电泳图。图中：M为DL2000DNAMarker，5、7均为BPIV3病毒的阳性检测结果，2、3、4、6、8、9、10、11均为BPIV3病毒的阴性检测结果，1为阴性对照。

具体实施方式

实验材料：

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性质粒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性质粒、牛副流感3型病毒(BPI3)阳性质粒、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)阳性质粒和大肠杆菌DH5α感受态细胞均由中国农业科学院特产研究所保存；

M-MLv反转录酶、MightyAmp酶、rTaq DNA聚合酶、DL2000DNAMarker和dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司；

金纳米颗粒溶胶(20nm)购自Sigma公司；

RNA提取试剂盒购自invitrogen公司。

实施例1本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的组装

(1)配制nano-PCR反应液

①根据BPIV3病毒NP组的保守基因序列设计一对特异性引物，为鉴定牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)的引物P1和P2，引物的序列如下：

P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，

P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'。

②nano-PCR反应液的配制：反应液由MightyAmp酶、金纳米颗粒溶胶(20nm，浓度0.5μg/μL)，2xBufferMix缓冲液、无菌双蒸水和上述①中的一对特异性引物组成。

(2)阳性对照重组质粒的构建

①制备牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)阳性对照质粒：利用MDBK细胞增殖牛副流感病毒3型病毒，培养40h后参照病毒RNA提取试剂提取牛副流感病毒3型病毒RNA后反转录，以反转录产物即牛副流感病毒3型病毒的NP为模板，以5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'(P1)和5'-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3'(P2)为引物进行PCR扩增，得到长度为422bp的扩增产物(BPIV3422bp目的片段)，其序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。PCR反应条件为：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，利用pMD18-T载体构建BPIV3阳性对照重组质粒，最终得到牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒，送至invitrogen公司进行测序。

②阳性对照重组质粒的建立结果：上述一个阳性对照重组质粒经过测序后，进行核酸比对发现相关基因的核酸同源性达到99％以上，这表明所获得的阳性对照重组质粒均为阳性质粒，牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒的序列如序列表中的SEQ IDNO:2所示。

(3)设置阴性对照：阴性对照为蒸馏水。

实施例2本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的使用方法

(1)对待检测的样品提取样品DNA，待检测的样品包括细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等。

(2)nano-PCR反应条件的确定

经过对金纳米颗粒溶胶反应浓度和退火温度的条件的优化，确定在25μL反应体系中，引物P1为0.5μL，引物P2为0.5μL，MightyAmp酶为0.5μL，2×buffer为12.5μL，阳性模板为1μL，金纳米颗粒溶胶为0.5μL,去离子水补齐反应体系至25μL，BRSV标准阳性质粒为阳性模板。反应条件设置为：98℃2min；98℃10s，退火温度范围55℃～62℃，退火时间2s～10s，68℃1min，30个循环，68℃总延伸10min，以双蒸水为阴性对照。

(3)以提取的样品反转录cDNA为模板，将样品cDNA、阳性对照质粒、阴性对照分别加入到含有MightyAmp酶、1xBufferMix缓冲液、20nm纳米金颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物的管中，98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

(4)取5μLPCR产物，以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(5)判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了422bp片段，则该待检测的样品中含有牛副流感病毒3型病毒。

实施例3本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的特异性实验

分别以IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV阳性对照重组质粒以及阴性对照(蒸馏水)为模板，加入鉴定牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)的引物P1和P2，进行nano-PCR检测试剂盒的特异性实验。

实验结果：如图1所示，分别以BPIV3、IBRV、BVDV和BRSV阳性对照重组质粒为模板出现其对应的422bp、阴性、阴性和阴性条带，阴性对照未扩增出任何条带。

实施例4本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的敏感性实验

分别以不同浓度的BPIV3阳性对照重组质粒为模板，进行nano-PCR检测试剂盒的敏感性实验，BPIV3阳性对照重组质粒的检测浓度为4.16×10⁸拷贝/μL～4.16×10¹拷贝/μL。

实验结果：如图3所示，nano-PCRBPIV3阳性对照重组质粒的最低检测结果为4.16×10²拷贝/μL。

实施例5利用本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒检测临床采集样品

(1)制备病毒核酸模板(病毒RNA的提取)

参照病毒RNA提取试剂提取临床样品的总RNA，并利用M-MLV反转录酶进行反转录，提取其cDNA作为BPIV3病毒的PCR模板。

(2)nano-PCR反应

以BPIV3病毒提取的RNA反转录产物为模板，加入到包含引物的nano-PCR反应体系中，采用nano-PCR最佳反应条件对病毒模板进行检测。

(3)检测结果

如图4和图5所示，BPIV3病毒出现其对应的422bp。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定；对于所属技术领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动；这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。