牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法与流程

文档序号:12779150阅读:来源:国知局

技术特征:

1.牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒;

所述一对特异性引物分别为:鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2:

P1:5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3',

P2:5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3';

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒,其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示;

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

2.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒,其特征在于,所述含有422个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括阴性对照,所述阴性对照为蒸馏水。

4.制备权利要求1至3中任意一项所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)配制nano-PCR反应液

所述反应液包括:MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物;

所述一对特异性引物分别为:鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2:

P1:5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3',

P2:5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3';

(2)建立牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒,其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示;

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖;

(3)阴性对照:所述阴性对照为蒸馏水。

5.根据权利要求4所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛副流感病毒3型病毒的NP基因为模板,以P1和P2为引物进行PCR扩增,得到长度为422bp的扩增产物,将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体,得到牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒,其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法,其特征在于,以P1和P2为引物进行PCR扩增的反应条件为:98℃2min;98℃10s,57℃5s,68℃1min,35个循环;68℃总延伸10min。

7.根据权利要求4所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm,浓度为0.5μg/μL。

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