一种新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及从裸花紫珠的干燥叶中分离得到一种环烯醚萜苷化合物，含其制备方法和用途。
背景技术：
：裸花紫珠(callicarpanudiflorahook.)为马鞭草科(verbenaceae)紫珠属(callicarpal.)植物，又名：赶风柴、节节红、饭汤叶、白花茶，茎叶或全株入药，主产于我国海南、广东、广西、江西等地，分布在平地至海拔1200米的山坡、谷地、溪旁林中或灌丛中。裸花紫珠是一种海南大宗性地道药材，同时也是海南黎族医生常用药材之一，具有抗菌止血，消炎解毒，散瘀消肿，驱风祛湿，增强免疫的功效，常用于治疗脓性炎症、急性传染性肝炎、肺结核咳血、胃肠出血、呼吸道及消化道出血、创伤出血等症，外用治烧、烫伤及外伤出血等疾病。裸花紫珠中化学成分主要为黄酮类、萜类、苯丙素类、挥发油类等，萜类化合物是裸花紫珠中主要类型成分之一，从结构类型上主要有环烯醚萜类、二萜类、三萜类。从裸花紫珠中分得的环烯醚萜类有nudifloside、linearoside、7-o-e-p-coumaroyl-8-epi-loganicacid、7-o-e-p-coumaroyl-gardoside。裸花紫珠始载《本草拾遗》，历史悠久、用途广泛、疗效显著，素有海南黑药之称，且该药材在我国分布较广、来源丰富，具有很好的开发利用价值，为方便患者使用该药材现已被加工制成片剂、分散片、胶囊、合剂、颗粒剂及栓剂等多种单味制剂。技术实现要素：发明目的：本发明的一个目的在于提供从裸花紫珠中提取得到一个新的环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1。本发明的另一个目的是提供上述环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1的制备方法。本发明的又一个目的是提供上述环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1在制备癌症和/或抗肿瘤药物中的应用。2、技术方案：本发明从裸花紫珠(callicarpanudiflorahook.)中首次提取分离得到一种环烯醚萜苷，名称为裸花紫珠苷a1，其分子式为c24h30o12，其化学结构式如下：一种环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1的制备方法，其步骤依次是：(1)乙醇加热回流提取：干燥的裸花紫珠叶，经粉碎后用乙醇加热回流提取，过滤，得乙醇提取液；(2)浓缩乙醇提取液：将乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏；(3)萃取与浓缩：乙醇浸膏用蒸馏水溶解，依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，保留水饱和正丁醇萃取相，得水饱和正丁醇萃取液，将水饱和正丁醇萃取液减压浓缩，得正丁醇浸膏；(4)浸膏粗分：将正丁醇浸膏与硅胶拌样，装入索氏提取器中，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-丙酮(1:1)、丙酮、丙酮-甲醇(1:1)、甲醇加热回流提取，将丙酮提取液减压浓缩，得丙酮浸膏；(5)柱层析分离：将丙酮浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用二氯甲烷-甲醇洗脱液洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得15个馏分，第4个馏分与c18拌样，转入中压反相柱层析，用乙腈-水洗脱液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得裸花紫珠苷a1粗品；(6)单体化合物的纯化：裸花紫珠苷a1粗品经重结晶纯化，获得本发明的裸花紫珠苷a1。上述工艺步骤(1)中乙醇体积浓度为80％。上述工艺步骤(5)中洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，氯仿与甲醇体积配比为：15:1或10:1或6:1或4:1或2:1；乙腈-水洗脱剂中，乙腈体积浓度为20％～40％。上述工艺步骤(6)中重结晶溶剂为乙酸乙酯、丙酮或甲醇。本发明产品经超导核磁共振波谱、质谱等多种手段检测，确定了裸花紫珠苷a1的分子式c24h30o12，化学结构式：产品裸花紫珠苷a1为淡黄色粉末，溶于乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、吡啶、甲醇等有机试剂，熔点为196～197℃，光学活性[α]20d-46(c0.1，meoh)，uv(ch3oh)λmax228nm和312nm。试验证明裸花紫珠苷a1在1×10-8mol/l～1×10-5mol/l时对人肺腺癌细胞和人卵巢癌细胞有明显的抑制作用，ic50分别为0.27μm和0.14μm。附图说明图1为裸花紫珠苷a1的制备工艺流程示意图，附图说明了裸花紫珠苷a1的制备步骤为：(1)乙醇回流提取；(2)浓缩乙醇提取液；(3)乙酸乙酯、正丁醇萃取与浓缩；(4)浸膏粗分；(5)柱层析分离；(6)纯化。图2为超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(uplc-q-tof-ms)图，说明了裸花紫珠苷a1的分子量；图3为核磁共振1hnmr谱图，说明了裸花紫珠苷a1结构中氢(h-c＝c-h，-c＝c-h，-ch3，-ch2oh-，glc-h等)的归属；图4为核磁共振13cnmr谱图，说明了裸花紫珠苷a1结构中碳(-c＝c-，-ch2-o-，-o-ch-o-，-ch-oh等)的归属；图5为核磁共振hsqc谱图，说明了裸花紫珠苷a1结构中相关的碳与氢的归属；图6为核磁共振hmbc谱图，说明了裸花紫珠苷a1结构中葡萄糖与苷元以及咖啡酰基与葡萄糖的连接位置；图7为核磁共振noesy谱图，说明了裸花紫珠苷a1结构中1位和6位羟基的相对构型。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)，buchi中压液相制备色谱仪(瑞士步琪公司)，waters系列高效液相色谱仪(包括waters600control，paa2996型二极管阵列检测器，waters717plus自动进样器，empower化学工作站)(美国waters公司)，安捷伦1200型半制备高效液相色谱仪，sartorisbp211a型电子天平(德国赛托利斯集团)，eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司)，电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)，uv-260分光光度计(日本岛津公司)，varianunityinova600超导核磁共振仪(美国varian公司)，xevog2q-tof飞行时间质谱仪(美国waters公司)，autopoliv-t/v旋光仪(美国aksh公司)，ry-1g熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)，c18反相填料为ymc生产，柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。实施例1：裸花紫珠中环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1的提取分离方法：裸花紫珠于2014年9月采自海南省五指山市，经江西省药品检测研究院袁桂平主任药师鉴定为马鞭草科植物裸花紫珠callicarpanudiflorahook.的叶，标本保留在江西省药品检测研究院标本室(标本号：lhzz20140926)。裸花紫珠苷a1的制备步骤依次如下：(1)乙醇加热回流提取：裸花紫珠的干燥叶(15.0kg)粉碎，用80％乙醇加热回流提取3次，过滤，得80％乙醇提取液；(2)浓缩80％乙醇提取液：将80％乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏2200g，在减压浓缩过程中回收乙醇；(3)萃取与浓缩：把80％乙醇浸膏溶解于蒸馏水中，再用乙酸乙酯萃取3次、水饱和正丁醇萃取3次，得水饱和正丁醇萃取液，将水饱和正丁醇萃取液减压浓缩得正丁醇浸膏486g，在减压浓缩过程中回收正丁醇；(4)浸膏粗分：将正丁醇浸膏与硅胶拌样，装入索氏提取器中，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-丙酮(1:1)、丙酮、丙酮-甲醇(1:1)、甲醇加热回流提取，将丙酮提取液减压浓缩，得丙酮浸膏87g，在减压浓缩过程中回收丙酮；(5)柱层析分离：将丙酮浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用二氯甲烷-甲醇洗脱液梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇体积比为3:1，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得15个馏分，第4个馏分与c18拌样，转入中压反相柱层析，用乙腈-水洗脱液梯度洗脱，乙腈体积浓度为20％～40％，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得裸花紫珠苷a1粗品；(6)单体化合物的纯化：裸花紫珠苷a1粗品用乙酸乙酯重结晶，得本发明的裸花紫珠苷a1(58mg)。实施例2：环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1结构鉴定裸花紫珠苷a1的理化性质如下：淡黄色粉末，溶于乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、吡啶、甲醇等有机试剂，熔点为196～197℃，光学活性[α]20d-46(c0.1，meoh)，uv(ch3oh)λmax228nm和312nm。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱给出准分子离子峰m/z533.1635[m+na]+(calcdforc24h30o12na，533.1635)，结合1h-nmr和13c-nmr谱确定其分子式为c24h30o12。1h与13cnmr数据见表1，同时，通过测定二维h-c相关谱(hsqc)、h-c远程相关谱(hmbc)以及旋转坐标系noe(roesy)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。化学结构式如下：表1裸花紫珠苷a1的氢谱和碳谱数据表(δinppm,jinhz)注：inova600mhz；δ化学位移单位ppm，1h-nmr和13c-nmr测试溶剂为dmso；核磁共振信号的归属是在hsqc、hmbc等二维谱基础上完成的。实施例3：环烯醚萜苷化合物裸花紫珠苷a1的体外抗肿瘤活性测试肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔测定值/对照孔测定值)×100％测试原理：mtt法：活细胞的线粒体中存在着与naap(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶ⅱ)相关的脱氢酶，可将黄色的噻唑蓝mtt(3-(4，5-aimethylthiazo-2-yl)-2，5-aiphenyltetrazoliumbromiae)还原为不溶性的蓝紫色甲臜(formanzan)，死细胞中此酶消失，mtt不被还原。用dmso(二甲基亚砜)溶解后可用酶标仪在570nm处检测光密度(oa)，光密度值与活细胞数成正比。所用细胞株为：a549(人肺腺癌细胞)和a2780(人卵巢癌细胞)。试验方法：mtt法：取对数生长期细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×104cell/ml，接种于96孔培养板中，100μl/孔。每一样品设计4-5个浓度级别，然后在实验孔中加入100μl不同浓度级别样品的培养基，每一浓度级别平行3孔。对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养96小时后，弃去培养液，每孔加入新鲜配置的含0.20mg/mlmtt的无血清培养基，37℃下继续培养4小时后，离心，除去上清液。每孔加入150μldmso溶解formazan沉淀，置微量震荡器上震荡5分钟使其充分溶解。在bioraa550型酶标仪上测定570nm处制率作图得到计量曲线，从曲线上读取药物的半数抑制浓度(ic50)值。表2裸花紫珠苷a1对a549(人肺腺癌细胞)的抑制作用样品浓度(mol/l)抑制率(％)ic50(μm)紫杉醇(阳性)1×10-595.30.0731×10-691.81×10-777.31×10-823.6裸花紫珠苷a11×10-590.40.271×10-674.01×10-723.31×10-810.5表3裸花紫珠苷a1对a2780(人卵巢癌细胞)的抑制作用总结：裸花紫珠苷a1对人肺腺癌细胞和人卵巢癌细胞均有抑制作用，可用于研制治疗癌症或肿瘤的药物。当前第1页12