一类3,4‑双吲哚‑1,2,4‑三氮唑酮类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物及其制备方法和应用，其作为糖原合成酶激酶-3β（gsk-3β）抑制剂在制备gsk-3β介导疾病治疗药物中的应用。

背景技术：

糖原合成酶激酶-3(glycogensynthaskinase-3，gsk-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，在所有真核生物中都有分布。在哺乳动物中主要有2种亚型：gsk-3α和gsk-3β。其中gsk-3β通过参与胰岛素、wnt／β-连环蛋白、hedgehog以及notch等信号传导通路，在调控细胞的分化、代谢、凋亡及基因表达等方面都起着重要作用。这些信号传导途径的失调与2型糖尿病、阿尔茨海默病、癌症等疾病密切相关。例如在2型糖尿病中，过度表达的gsk-3β可以通过磷酸化糖原合成酶（gs）而抑制其活性，降低细胞外葡萄糖向糖原转化的能力；另外过度表达的gsk-3β也会使胰岛素受体底物-1（irs-1）中多个丝氨酸残基磷酸化，消弱胰岛素信号的传导，导致靶组织对胰岛素的反应性降低，主要表现为脂肪和肌肉组织对葡萄糖的摄取减少。上述原因均会导致血糖浓度的上升。在阿尔茨海默尔氏病中，过表达的gsk-3β会导致tau蛋白过度磷酸化，引起神经元纤维缠结，并会导致神经元死亡。因此，gsk-3β抑制剂可用于预防和治疗糖尿病和阿尔茨海默尔氏病等疾病。开发具有新型结构的gsk-3β抑制剂已成为当前新药开发的热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物，可作为糖原合成酶激酶-3β抑制剂，用于制备gsk-3β介导疾病治疗药物。

所述的一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物，其特征在于该类化合物结构通式如式（4）所示：

（4），

其中：

r1，r3独立的选自：氢，碳原子数为1-3的直链烷基、支链烷基或环烷基；碳原子数为1-3的直链烷氧基、支链烷氧基或环烷氧基；卤素；

r2，r4独立的选自：氢，碳原子数为1-5的直链烷基、支链烷基和环烷基；(ch2)nr5，其中n=2-5，r5为咪唑、三氮唑或吗啉。

所述的3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物的制备方法，其特征在于以如式（1）所示的吲哚甲酰肼衍生物为起始原料，与如式（2）所示的取代的吲哚异氰酯类化合物经缩合反应得到如式（3）所示的氨基脲类中间体，氨基脲类中间体在三乙胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯作用下脱水环合得到如式（4）所示的目标产物3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物，其反应方程式如下：

，

式中：r1，r3独立的选自：氢，碳原子数为1-3的直链烷基、支链烷基或环烷基；碳原子数为1-3的直链烷氧基、支链烷氧基或环烷氧基；卤素；

r2，r4独立的选自：氢，碳原子数为1-5的直链烷基、支链烷基和环烷基；(ch2)nr5，其中n=2-5，r5为咪唑、三氮唑或吗啉。

所述的一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将如式（1）所示的吲哚甲酰肼衍生物溶于无水thf中，控制温度为0~5℃，滴加如式（2）所示的取代的吲哚异氰酯类化合物的无水thf溶液，滴完后升至常温，继续反应1.5-2.5h，反应完后过滤、干燥得到如式（3）所示的氨基脲类中间体；

2）将步骤1）制得的如式（3）所示的氨基脲类中间体溶解在无水dmf中，加入无水三乙胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯，在105-115℃下进行脱水环合反应2-3h，反应结束后，反应液倒入到水中，用乙酸乙酯萃取完全，有机层依次用饱和nacl溶液洗涤，用无水na2so4干燥，然后减压浓缩，残留物用硅胶柱层析提纯，得到如式（4）所示的目标产物3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物。

所述的一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物的制备方法，其特征在于步骤1）中滴完后升至常温反应2h。

所述的一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物的制备方法，其特征在于步骤2）中脱水环合反应的反应温度为110℃，反应时间为2.5h。

所述的一类3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物及其药学上可接受的盐在制备gsk-3β介导疾病治疗药物中的应用。

通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明设计合成的3,4-双吲哚-1,2,4-三氮唑酮类衍生物是一类新型的gsk-3β抑制剂，适合于以gsk-3β为靶点的药物开发，特别用于制备gsk-3β介导疾病治疗药物，得到的药物可用于治疗糖尿病、双向精神障碍、阿尔茨海默病、癌症、炎性疾病、抑郁症、神经保护和精神分裂症等疾病。

附图说明

图1为目标化合物在细胞水平的gsk-3β抑制活性测试结果图。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步的说明。以下的实施例是说明本发明的，而不是以任何方式限制本发明。

部分中间体和目标化合物的制备：

实施例1：2-(1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3a的制备

在三口烧瓶中加入0.3g（1.7mmol）1h-吲哚-3-甲酰肼1a，20ml无水thf，控制t=0~5^oc,滴加由5ml无水thf稀释的0.29g（1.7mmol）3-异氰酸酯-1-甲基-1h-吲哚2a，滴完后升至常温反应2h，反应完后过滤、干燥得到0.51g类白色固体3a，收率：85.8%。熔点:218-220°c，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.67(s,1h),9.78(s,1h),8.64(s,1h),8.19-8.15(m,2h),7.95(s,1h),7.59(d,j=8.0hz,1h),7.47(d,j=8.0hz,1h),7.44(s,1h),7.39(d,j=8.0hz,1h),7.20-7.13(m,3h),7.04(t,j=7.5hz,1h),3.74(s,3h).

实施例2：2-(5-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3b的制备

合成方法同实施1，只是用5-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1b替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3b,收率：77.6%。熔点：230-232°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.85(s,1h),8.61(s,1h),8.31(s,1h),8.15(s,1h),7.96(s,1h),7.60-7.51(m,2h),7.43(s,1h),7.42-7.35(m,2h),7.16(t,j=7.7hz,1h),7.03(t,j=7.5hz,1h),3.87(s,3h),3.74(s,3h).

实施例3：2-(6-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3c的制备

合成方法同实施1，只是用6-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1c替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3c,收率：63.3%。熔点：225-226°c，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.84(s,1h),8.61(s,1h),8.17-8.11(m,2h),7.95(s,1h),7.69(d,j=1.8hz,1h),7.57(d,j=8.0hz,1h),7.43(s,1h),7.38(d,j=8.3hz,1h),7.21(dd,j=8.6,1.9hz,1h),7.18-7.11(m,1h),7.08-6.99(m,1h),3.86(s,3h),3.74(s,3h).

实施例4：2-(5-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3d的制备

合成方法同实施1，只是用5-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1d替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3d,收率：62.2%。熔点：233-235°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.86(s,1h),8.63(s,1h),8.16(s,1h),8.14(s,1h),7.97(s,1h),7.58(t,j=7.2hz,2h),7.43(s,1h),7.39(d,j=8.2hz1h),7.27(d,j=8.4hz,1h),7.15(t,j=7.5hz,1h),7.03(d,j=7.4hz,1h),3.87(s,3h),3.74(s,3h).

实施例5：2-(6-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3e的制备

合成方法同实施1，只是用6-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1e替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3e,收率：54.7%。熔点：223-224°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.83(s,1h),8.61(s,1h),8.17-8.11(m,2h),7.95(s,1h),7.69(s,1h),7.57(d,j=8.0hz,1h),7.43(s,1h),7.39(d,j=8.3hz,1h),7.24-7.12(m,2h),7.03(t,j=7.5hz,1h),3.86(s,3h),3.74(s,3h).

实施例6：2-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3f的制备

合成方法同实施1，只是用5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1f替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3f,收率：63.8%。熔点：224-226°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.84(s,1h),8.65(s,1h),8.19(s,1h),8.00-7.89(m,2h),7.72-7.28(m,4h),7.25-6.95(m,3h),3.87(s,3h),3.75(s,3h).

实施例7：2-(5-甲氧基-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3g的制备

合成方法同实施1，只是用5-甲氧基-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1g替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3g,收率：86.9%。熔点：203-205°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.78(s,1h),8.54(s,1h),8.16(d,j=7.9hz,1h),8.11(s,1h),7.88(s,1h),7.53(d,j=8.3hz,1h),7.37(s,1h),7.30(d,j=8.9hz,1h),7.28-7.21(m,1h),7.22-7.15(m,1h),7.07(d,j=2.5hz,1h),6.80(dd,j=8.9,2.4hz,1h),3.87(s,3h),3.78(s,3h),3.70(s,3h).

实施例8：2-(6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-羰基)-n-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)氨基脲3h的制备

合成方法同实施1，只是用6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-甲酰肼1h替换1h-吲哚-3-甲酰肼1a，得到类白色固体3h,收率：77.8%。熔点：215-217°c,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.83(s,1h),8.64(s,1h),8.16-8.09(m,2h),7.96(s,1h),7.58(d,j=7.9hz,1h),7.46-7.42(m,2h),7.39(d,j=8.3hz,1h),7.16(t,j=7.6hz,1h),7.08-7.01(m,2h),3.84(s,3h),3.74(s,3h).

实施例9：3-(1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4a

取0.2g(0.58mmol)3a溶解在2ml无水dmf中，加入0.28ml(2.0mmol)无水三乙胺，加入0.32g三氟甲磺酸三甲基硅酯（1.44mmol），在110℃下反应2.5h。反应结束后，倒入到20ml水中，用乙酸乙酯萃取完全，得到有机层用饱和nacl溶液洗涤三次，用无水na2so4干燥，然后减压浓缩，残留物用硅胶柱层析提纯，得到白色固体4a，收率为：78.6%。熔点：＞250℃,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.90(s,1h),11.16(d,j=1.9hz,1h),8.19(d,j=7.5hz,1h),7.72(s,1h),7.60(d,j=8.4hz,1h),7.38(d,j=7.5hz,1h),7.33–7.20(m,2h),7.20–7.10(m,2h),7.07(t,j=7.3hz,1h),6.59(d,j=2.8hz,1h),3.90(s,3h).

实施例10：3-(5-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4b

合成方法同实施9，只是用3b替换3a，得到白色固体4b,收率：81.3%。熔点：＞250℃，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.95(s,1h),8.29(d,j=1.9hz,1h),7.71(s,1h),7.61(d,j=8.4hz,1h),7.43(d,j=8.7hz,1h),7.37(dd,j=8.7,1.9hz,1h),7.26(t,j=7.7hz,1h),7.20(d,j=7.9hz,1h),7.05(t,j=7.5hz,1h),6.70(s,1h),3.90(s,3h),3.53(s,3h).hrms(esi)m/z[m+h]⁺forc20h17n5obrcalcd422.0611,found422.0596.

实施例11：3-(6-溴-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4c

合成方法同实施9，只是用3c替换3a，得到白色固体4c,收率：80.2%。熔点：＞250℃,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.95(s,1h),8.07(d,j=8.6hz,1h),7.72(d,j=1.4hz,1h),7.70(s,1h),7.60(d,j=8.3hz,1h),7.30(dd,j=8.6,1.4hz,1h),7.25(t,j=7.6hz,1h),7.19(d,j=7.9hz,1h),7.05(t,j=7.4hz,1h),6.67(s,1h),3.90(s,3h),3.53(s,3h).

实施例12：3-(5-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4d

合成方法同实施9，只是用3d替换3a，得到白色固体4d,收率：63.2%。熔点：＞250℃，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.94(s,1h),8.13(d,j=1.4hz,1h),7.70(s,1h),7.60(d,j=8.3hz,1h),7.48(d,j=8.7hz,1h),7.29-7.22(m,2h),7.20(d,j=7.9hz,1h),7.05(t,j=7.4hz,1h),6.71(s,1h),3.90(s,3h),3.54(s,3h).hrms(esi)m/z[m+h]⁺forc20h17n5oclcalcd378.1116,found378.1104.

实施例13：3-(6-氯-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4e

合成方法同实施9，只是用3e替换3a，得到白色固体4e,收率：70.4%。熔点：＞250℃，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.95(s,1h),8.12(d,j=8.6hz,1h),7.70(s,1h),7.62-7.58(m,2h),7.25(t,j=7.7hz,1h),7.22-7.16(m,2h),7.05(t,j=7.5hz,1h),6.69(s,1h),3.90(s,3h),3.53(s,3h).

实施例14：3-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4f

合成方法同实施1，只是用3f替换3a，得到白色固体4f,收率：60.4%。熔点：＞250℃，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.92(s,1h),7.81(dd,j=10.1,2.6hz,1h),7.70(s,1h),7.60(d,j=8.3hz,1h),7.48-7.43(m,1h),7.25(t,j=7.7hz,1h),7.20(d,j=7.9hz,1h),7.11(td,j=9.1,2.4hz,1h),7.05(t,j=7.5hz,1h),6.71(s,1h),3.90(s,3h),3.54(s,3h).hrms(esi)m/z[m+h]⁺forc20h17n5ofcalcd362.1412,found362.1410.

实施例15：3-(5-甲氧基-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4g

合成方法同实施9，只是用3g替换3a，得到白色固体4g,收率：58.9%。熔点：＞250℃，¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.86(s,1h),7.66(s,1h),7.59(d,j=8.3hz,1h),7.54(d,j=2.5hz,1h),7.31(d,j=8.9hz,1h),7.26-7.19(m,2h),7.05(t,j=7.5hz,1h),6.84(dd,j=8.9,2.5hz,1h),6.67(s,1h),3.88(s,3h),3.70(s,3h),3.50(s,3h).hrms(esi)m/z[m+h]⁺forc21h20n5o2calcd374.1612,found374.1602.

实施例16：3-(6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-1,2,4-三唑-5(4h)-酮4h

合成方法同实施9，只是用3h替换3a，得到白色固体4h,收率：67.3%。熔点：＞250℃,¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.93(s,1h),8.15-8.12(m,1h),7.70(s,1h),7.60(d,j=8.3hz,1h),7.33(dd,j=10.0,2.1hz,1h),7.25(t,j=7.6hz,1h),7.20(d,j=7.9hz,1h),7.08-7.00(m,2h),6.65(s,1h),3.90(s,3h),3.50(s,3h).

目标化合物在酶水平的gsk-3β抑制活性评价:

通过大肠杆菌表达系统表达c端6×his融合gsk-3β蛋白，并经过ni²⁺亲和纯化方法纯化，激酶活性检测采用10l反应体系的invitrogen的z-lyte激酶试剂盒，每个样品3复孔。利用酶标仪envision多标记微孔板检测仪（perkinelmer公司产品）检测400nm激发下445nm以及520nm处的荧光强度，利用试剂盒提供的公式计算得到样品孔的底物磷酸化率，以此反应激酶活性高低。抑制率大于50%的用graphpadprism软件拟合得出ic50值,实验中采用的阳性化合物为staurosporine，部分测试结果见下表1：

表1部分目标化合物对gsk-3β的抑制活性表

从表1中数据可以看出，该类化合物在酶水平上显示了良好的gsk-3β抑制活性。

目标化合物在细胞水平的gsk-3β抑制活性评价:

gsk-3β是磷酸化tau蛋白的主要激酶，该激酶对tau蛋白396位丝氨酸等一系列残基进行磷酸化。本发明针对原代培养的大鼠小脑颗粒神经细胞cgcs，检测gsk-3β抑制剂对tau蛋白396位丝氨酸磷酸化的影响，从而评价这些抑制剂在细胞水平的活性,我们选择了部分化合物进行了细胞水平的gsk-3β抑制活性的测定，具体方法为:小脑颗粒神经细胞经5μm的化合物处理24小时后，用冰冷的pbs洗两次后，用1×sdsbuffer收样。样品在10%sds聚丙烯酰胺凝胶跑电泳，将蛋白转于pvdf膜上。膜用5%牛奶封闭1h，一抗（epitmics公司的tauphospho(ser396)）孵育过夜，二抗为兔抗，孵育1h，用ecl曝光显影，部分测试结果见图1，从图1的结果表明，该类化合物在5μm的浓度下对神经细胞内gsk-3β底物tau蛋白396位丝氨酸磷酸化具有明显的抑制作用，表明这些化合物在细胞内可以有效的抑制gsk-3β的活性。

目标化合物的体外脑缺血神经保护作用评价：

本发明对目标化合物在脑缺血病理条件下的经典体外神经细胞损伤模型（谷氨酸诱导的神经细胞损伤模型）中的神经保护作用进行了评价。采用原代培养的大鼠小脑颗粒神经细胞经不同浓度的化合物（0.1，1，5µm）预处理24小时后，然后再加入200μm的谷氨酸孵育细胞。24小时后，采用mtt方法检测神经细胞存活率。测试结果见表2:

表2部分化合物对由谷氨酸引起的小脑颗粒神经细胞毒性的保护

注:在谷氨酸存在下,细胞的平均存活能力为49.5%,正常细胞的存活率为100%。

从表2可以得出，化合物4b，4d，4f和4g在0.1μm、1μm和5μm浓度下均能有效抑制谷氨酸引起的神经细胞损伤，显示了良好的神经保护应用前景。