畜禽骨胶原蛋白‑壳聚糖共混膜的制备方法与流程

本发明属于绿色包装材料领域，特别是一种畜禽骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的制备方法。

背景技术：

近年来，塑料包装材料的不可降解性和不可循环性已经引起了严重的环境问题。同时，随着消费者对营养健康的关注，研究开发生物可降解膜已经成为食品包装领域的最新趋势。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，占动物总蛋白的30％左右，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质。胶原蛋白具有良好的成膜性能，并且可以作为抗氧化剂和抗菌剂的运载体应用于食品包装中。由于其低免疫原性、高生物相容性和生物可降解性，以胶原蛋白为基础的可食性生物膜已经引起了广泛关注。然而，一般来说胶原蛋白膜表面粗糙、机械特性和热稳定性较差，一定程度上限制了它的应用。目前，已有研究通过酶法改性、化学改性或与其他大分子(如：壳聚糖、羟甲基纤维素、琼脂、纳米粘土及其他蛋白质等)共混来改善胶原蛋白的成膜特性。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰后得到的一种天然多聚物，含量丰富，具有良好的抑菌性和成膜性。壳聚糖膜具有选择性的气体透过性(co2和o2)和机械特性。然而，壳聚糖膜水蒸气透过性较高，限制了它在食品包装中应用。目前已有研究通过与蛋白质和其他多糖类物质混合成膜改善壳聚糖的成膜特性。

前人研究多集中在明胶与壳聚糖复合膜的成膜特性。公开号为cn102276858a的专利提供了一种30-60℃热水浸提鱼皮胶原蛋白，及其与壳聚糖复合膜的制备方法。公开号为cn101955670a公布了一种明胶-壳聚糖复合膜制备方法，以甘油和山梨醇作为增塑剂。公开号为cn103570958a公布了一种可食性壳聚糖-胶原蛋白抗菌膜的制备方法，并加入双醛淀粉以改善复合膜性能。但没有利用畜禽骨胶原蛋白与壳聚糖制作共混膜的实例，是否可以制作，制作的方法是否相同，都未见报道。

畜禽骨是畜禽屠宰后的主要副产物，然而其加工利用率不足30％，造成了极大的资源浪费和环境污染。蛋白质是畜禽骨主要的有机组分，其中胶原蛋白占总蛋白含量的90％。因此，开发利用畜禽骨胶原蛋白是提高畜禽骨附加值的重要途径。

技术实现要素：

针对所提到的问题，本发明提供了一种畜禽骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的制备方法，步骤包括：

1)采用胃蛋白酶-乙酸法提取畜禽骨胶原蛋白；

2)将制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖分别溶于0.5m乙酸溶液中，制得质量浓度均为1.5～2％的畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液；

3)将畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照4～9：6的比例混合，混合温度为40℃，混合时间为30min；

4)加入甘油到步骤3制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖混合溶液中形成共混液，甘油与畜禽骨胶原蛋白的重量百分比浓度25～30％；

5)将步骤4制备的共混液置于超声中脱气，制备铸膜液，超声频率为50hz，超声时间为30min；

6)将步骤5制备的铸膜液均匀倒入成膜容器中进行干燥，干燥时间为15～18h，干燥温度为45～50℃；

7)将成膜容器置于25℃～37℃环境下6～8h后揭膜。

优选方案是：所述提取畜禽骨胶原蛋白的方法，步骤包括：

1)切去新鲜畜禽骨两端海绵骨，清除骨髓；

2)粉碎畜禽骨制得骨粉，骨粉粒径为16～25目，真空冷冻干燥；

3)骨粉以1:10(w/v)的料液比浸泡于0.1mnaoh溶液中磁力搅拌2d，去除非胶原蛋白及残留的血色素等物质，每12h更换一次naoh溶液，再以1:10(w/v)料液比浸泡于10％正丁醇溶液中磁力搅拌3d去除脂质，每12h更换一次正丁醇溶液，得脱脂骨粉；

4)将步骤3)制备的脱脂骨粉以1:10(w/v)料液比浸泡于ph＝7.5，0.5medta-2na溶液中磁力搅拌5d去除钙盐等矿物质，每12h更换一次edta-2na溶液，真空冷冻干燥得脱钙骨粉；

5)将步骤4)制备的脱钙骨粉以1:10(w/v)的料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，磁力搅拌3d提取酶溶性骨胶原蛋白；

6)纱布过滤分离骨渣和粗提液，骨渣进行二次提取。将两次提取的粗提液混合；

7)使用2mnacl对粗提液进行盐析12～18h，盐析悬浊液于10,000g离心30min，弃上清，沉淀用0.5m的乙酸复溶；

8)重复盐析一次，离心后沉淀物用0.5m乙酸再进行复溶；

9)用0.1m乙酸溶液透析1d，每12h更换一次透析液，后以蒸馏水透析2d，每12h换一次蒸馏水，真空冷冻干燥得酶溶性骨胶原蛋白。

优选方案是：将制得的膜样品置于温度为25±0.5℃，相对湿度为50±5％的干燥器中保存。

优选方案是：所述畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照3：2的比例混合。

优选方案是：所述畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照1：1的比例混合。

本发明的有益效果如下：

1)本发明所述的畜禽骨胶原蛋白与壳聚糖共混膜具有很好的生物相容性、机械特性、光和水蒸汽阻隔性良好，兼具一定的抗菌性；

2)本发明所述畜禽骨胶原蛋白与壳聚糖共混膜组分均为天然高分子聚合物，生物安全性高，生物可降解性好，且充分利用骨副产物资源，绿色环保；

3)本发明所述的畜禽骨胶原蛋白与壳聚糖共混膜制备工艺简单、操作方便、原料易得、成本低。

附图说明

图1为本发明实施例中制备的不同混合比例共混膜；

图2为本发明实施例中不同混合比例共混膜的拉伸强度(ts)和断裂延伸率(eab)变化曲线；

图3为本发明实施例中不同混合比例共混膜的水蒸汽透过率(wvp)变化曲线。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

本实施例提供了一种纯骨胶原蛋白膜的制备方法，步骤包括：

1)采用胃蛋白酶-乙酸法提取畜禽骨胶原蛋白；

2)骨胶原蛋白溶于0.5m乙酸，制得质量浓度为1.5％的畜禽骨胶原蛋白溶液；

3)加热搅拌畜禽骨胶原蛋白溶液，搅拌温度为40℃，搅拌时间为30min；

4)冷却畜禽骨胶原蛋白溶液至室温，加入畜禽骨胶原蛋白质量25％的甘油，搅拌；

5)将步骤4制备的溶液置于超声中脱气，制备铸膜液，超声频率为50hz，超声时间为30min；

6)将步骤5制备的铸膜液均匀倒入成膜容器中进行干燥，干燥时间为18h，干燥温度为50℃；

7)将成膜容器置于室温环境下6～8h后揭膜。

实施例2

本实施例提供了一种畜禽骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的制备方法，步骤包括：

1)采用胃蛋白酶-乙酸法提取畜禽骨胶原蛋白

2)将制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖分别溶于0.5m乙酸溶液中，制得质量浓度均为1.5％的畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液；

3)将畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照3：2的比例混合，混合温度为40℃，混合时间为30min；

4)加入甘油到步骤3制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖混合溶液中形成共混液，甘油与畜禽骨胶原蛋白的质量百分比浓度25％；

5)将步骤4制备的共混液置于超声中脱气，制备铸膜液，超声频率为50hz，超声时间为30min；

6)将步骤5制备的铸膜液均匀倒入成膜容器中进行干燥，干燥时间为15h，干燥温度为45℃；

7)将成膜容器置于25℃～37℃环境下6h后揭膜；

8)将制得的膜样品置于温度为25±0.5℃，相对湿度为50±5％的干燥器中保存。

其中，所述提取畜禽骨胶原蛋白的方法，步骤包括：

1)切去新鲜畜禽骨两端海绵骨，清除骨髓；

2)粉碎畜禽骨制得骨粉，骨粉粒径为16目，真空冷冻干燥；

3)骨粉以1:10(w/v)的料液比浸泡于0.1mnaoh溶液中磁力搅拌2d，去除非胶原蛋白及残留的血色素等物质，每12h更换一次naoh溶液，再以1:10(w/v)料液比浸泡于10％正丁醇溶液中磁力搅拌3d去除脂质，每12h更换一次正丁醇溶液，得脱脂骨粉；

4)将步骤3)制备的脱脂骨粉以1:10(w/v)料液比浸泡于ph＝7.5，0.5medta-2na溶液中磁力搅拌5d去除钙盐等矿物质，每12h更换一次edta-2na溶液，真空冷冻干燥得脱钙骨粉；

5)将步骤4制备的脱钙骨粉以1:10(w/v)的料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，磁力搅拌3d提取酶溶性骨胶原蛋白；

6)纱布过滤分离骨渣和粗提液，骨渣进行二次提取。将两次提取的粗提液混合；

7)使用2mnacl对粗提液进行盐析12～18h，盐析悬浊液于10,000g离心30min，弃上清，沉淀用0.5m的乙酸复溶；

8)重复盐析一次，离心后沉淀物用0.5m乙酸再进行复溶；

9)用0.1m乙酸溶液透析1d，每12h更换一次透析液，后以蒸馏水透析2d，每12h换一次蒸馏水，真空冷冻干燥得酶溶性骨胶原蛋白。

实施例3

本实施例提供了一种畜禽骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的制备方法，步骤包括：

1)采用胃蛋白酶-乙酸法提取畜禽骨胶原蛋白

2)将制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖分别溶于0.5m乙酸溶液中，制得质量浓度均为2％的畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液；

3)将畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照1：1的比例混合，混合温度为40℃，混合时间为30min；

4)加入甘油到步骤3制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖混合溶液中形成共混液，甘油与畜禽骨胶原蛋白的质量百分比浓度30％；；

5)将步骤4制备的共混液置于超声中脱气，制备铸膜液，超声频率为50hz，超声时间为30min；

6)将步骤5制备的铸膜液均匀倒入成膜容器中进行干燥，干燥时间为18h，干燥温度为50℃；

7)将成膜容器置于25℃～37℃环境下8h后揭膜；

8)将制得的膜样品置于温度为25±0.5℃，相对湿度为50±5％的干燥器中保存。

其中，所述提取畜禽骨胶原蛋白的方法，步骤包括：

1)切去新鲜畜禽骨两端海绵骨，清除骨髓；

2)粉碎畜禽骨制得骨粉，骨粉粒径为16目，真空冷冻干燥；

3)骨粉以1:10(w/v)的料液比浸泡于0.1mnaoh溶液中磁力搅拌2d，去除非胶原蛋白及残留的血色素等物质，每12h更换一次naoh溶液，再以1:10(w/v)料液比浸泡于10％正丁醇溶液中磁力搅拌3d去除脂质，每12h更换一次正丁醇溶液，得脱脂骨粉；

4)将步骤3)制备的脱脂骨粉以1:10(w/v)料液比浸泡于ph＝7.5，0.5medta-2na溶液中磁力搅拌5d去除钙盐等矿物质，每12h更换一次edta-2na溶液，真空冷冻干燥得脱钙骨粉；

5)将步骤4制备的脱钙骨粉以1:10(w/v)的料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，磁力搅拌3d提取酶溶性骨胶原蛋白；

6)纱布过滤分离骨渣和粗提液，骨渣进行二次提取。将两次提取的粗提液混合；

7)使用2mnacl对粗提液进行盐析12～18h，盐析悬浊液于10,000g离心30min，弃上清，沉淀用0.5m的乙酸复溶；

8)重复盐析一次，离心后沉淀物用0.5m乙酸再进行复溶；

9)用0.1m乙酸溶液透析1d，每12h更换一次透析液，后以蒸馏水透析2d，每12h换一次蒸馏水，真空冷冻干燥得酶溶性骨胶原蛋白。

实施例4

本实施例提供了一种畜禽骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜的制备方法，步骤包括：

1)采用胃蛋白酶-乙酸法提取畜禽骨胶原蛋白；

2)将制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖分别溶于0.5m乙酸溶液中，制得浓度均为1.5％的畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液；

3)将畜禽骨胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按照2：3的比例混合，混合温度为40℃，混合时间为30min；

4)加入甘油到步骤3制备的畜禽骨胶原蛋白和壳聚糖混合溶液中形成共混液，甘油的重量百分比浓度25％；

5)将步骤4制备的共混液置于超声中脱气，制备铸膜液，超声频率为50hz，超声时间为30min；

6)将步骤5制备的铸膜液均匀倒入成膜容器中进行干燥，干燥时间为18h，干燥温度为50℃；

7)将成膜容器置于室温环境下6h后揭膜；

8)将制得的膜样品置于温度为25±0.5℃，相对湿度为50±5％的干燥器中保存。

其中，所述提取畜禽骨胶原蛋白的方法，步骤包括：

1)切去新鲜畜禽骨两端海绵骨，清除骨髓；

2)粉碎畜禽骨制得骨粉，骨粉粒径为16目，真空冷冻干燥；

3)骨粉以1:10(w/v)的料液比浸泡于0.1mnaoh溶液中磁力搅拌2d，去除非胶原蛋白及残留的血色素等物质，每12h更换一次naoh溶液，再以1:10(w/v)料液比浸泡于10％正丁醇溶液中磁力搅拌3d去除脂质，每12h更换一次正丁醇溶液，得脱脂骨粉；

4)将步骤3)制备的脱脂骨粉以1:10(w/v)料液比浸泡于ph＝7.5，0.5medta-2na溶液中磁力搅拌5d去除钙盐等矿物质，每12h更换一次edta-2na溶液，真空冷冻干燥得脱钙骨粉；

5)将步骤4制备的脱钙骨粉以1:10(w/v)的料液比置于胃蛋白酶-乙酸溶液中，磁力搅拌3d提取酶溶性骨胶原蛋白；

6)纱布过滤分离骨渣和粗提液，骨渣进行二次提取。将两次提取的粗提液混合；

7)使用2mnacl对粗提液进行盐析12～18h，盐析悬浊液于10,000g离心30min，弃上清，沉淀用0.5m的乙酸复溶；

8)重复盐析一次，离心后沉淀物用0.5m乙酸再进行复溶；

9)用0.1m乙酸溶液透析1d，每12h更换一次透析液，后以蒸馏水透析2d，每12h换一次蒸馏水，真空冷冻干燥得酶溶性骨胶原蛋白。

实施例5

本实施例提供了一种壳聚糖膜的制备方法，步骤包括：

1)成膜组分：壳聚糖溶于0.5m乙酸，质量浓度为1.5％。

2)加热搅拌：40℃恒温水浴搅拌30min。

3)加塑化剂：冷却后，加入畜禽骨胶原蛋白重量百分比浓度25％的甘油，搅拌均匀。

4)超声脱气：50hz超声中脱气30min得铸膜液。

5)干燥成膜：将铸膜液均匀倒在成膜容器内，50℃干燥18h，再于室温放置6～8h后揭膜。膜样品置于25±0.5℃、50±5％相对湿度的干燥器中保存。

针对上述各实施例中所得的生物膜进行机械特性和水蒸汽透过性测定，具体测定方法如下：

膜机械性能测定方法：

(1)利用螺旋测微器随机测量每个膜试样6个不同的位置的厚度，取平均值作为该膜的厚度；

(2)将膜剪成宽10mm、长60mm的长条状，采用质构仪测定膜的机械性能，初始距离为50mm，拉伸速度为0.5mm/s。根据公式计算ts和eab：

ts(mpa)＝f/a

式中，f为拉伸过程中膜承受最大的拉力，n；a为膜样品的横切面积，mm²。

eab(％)＝l/l0×100％

式中，l为膜断裂时的增加的长度，mm；l0为膜的初始长度，mm。

膜水蒸气透过性

将膜密封在装满硅胶的玻璃瓶瓶口，然后将玻璃瓶置于底部有蒸馏水的干燥器中，干燥器密封。20℃放置6d，每天称重，根据下式计算水蒸汽透过性：

式中，δw为铝盒的增重，g；d为膜厚，mm；t为称重时的时间间隔，h；a为膜面积，m²；δp为膜两端水蒸汽压力差，kpa，20℃下为，2.346kpa，25℃下为3.167kpa。

如图1所示，纯骨胶原蛋白膜揭膜难，表面粘度大，质地较软，硬度较小，延展性较大，但是膜表面略粗糙。纯壳聚糖膜揭膜容易，质地较硬，延展性差，表面光滑，具有轻微黄色。与单一组分膜相比，共混膜质地得到较大改善，膜硬度适中，具有一定的延展性，表面均一，较为光滑平整，可以弥补单一组分膜的不足，具备良好的成膜特性。

如图2所示，纯骨胶原蛋白膜的拉伸强度最小，添加壳聚糖能够显著提高骨胶原蛋白膜的拉伸强度。当骨胶原蛋白与壳聚糖添加比例为3:2时，骨胶原蛋白-壳聚糖膜的拉伸强度最大。当壳聚糖含量进一步增加时，少量存在的胶原蛋白损害了壳聚糖膜的完整结构，导致共混膜的拉伸强度降低。同时，随着壳聚糖含量增加，骨胶原蛋白-壳聚糖膜的断裂延伸率先升高后降低，当骨胶原蛋白与壳聚糖添加比例为1:1时，骨胶原蛋白-壳聚糖膜的断裂延伸率最大。

如图3所示，纯胶原蛋白膜的水蒸气透过性最小，水蒸汽阻隔性较好。随壳聚糖含量增加，共混膜的水蒸汽透过性逐渐增大，水蒸汽阻隔性变差，纯壳聚糖膜的水蒸汽透过性最大。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。