本发明涉及医药技术领域，具体的说，是齐墩果酸衍生物及其制备方法和用途。
背景技术：
癌症严重威胁人类的生命和健康，癌症死亡率高居我国疾病死亡率的第二位。因此，研究开发新结构类型抗肿瘤化合物，具有重要的理论意义。
齐墩果酸，一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，广泛存在于自然界中。齐墩果酸具有保肝、抗癌、抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗hiv等药理作用和生物活性。近年来，发现齐墩果酸衍生物对多种肿瘤细胞具有较好的抑制作用。
四氮唑类杂环化合物是一类重要五元芳杂环化合物，在生物、医药、农药等领域的应用非常广泛，在新药研发方面有广泛的应用前景。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于，提供一种齐墩果酸四唑衍生物。
本发明的另一目的在于，还提供一种齐墩果酸四唑衍生物的制备方法，以进一步探索、丰富该类化合物抗肿瘤活性的构效关系。
本发明的目的还在于，还提供一种齐墩果酸四唑衍生物的用途，本发明提供的齐墩果酸四唑衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长，具有良好的抗肿瘤活性。
本发明所需要解决的技术问题，通过以下技术方案来实现：
作为本发明的第一方面，一种齐墩果酸四唑衍生物，所述齐墩果酸四唑衍生物的结构式如下：
其中：
r选自4-氟苄基，3-氟苄基，2-氟苄基，4-氯苄基，2-氯苄基，3-溴苄基，2-溴苄基，2-硝基苄基，2-氰基苄基，苄基，2-甲基苄基中的任意一种。
作为本发明的第二方面，一种齐墩果酸四唑衍生物的制备方法，合成步骤如下：
(1)将齐墩果酸溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入氯乙腈和碳酸钾反应，得到中间体齐墩果烷-12-烯-28酸乙腈酯(1)；
(2)将齐墩果烷-12-烯-28酸乙腈酯(1)作为反应物，溶于异丙醇水溶液中(异丙醇/水＝3:1，v/v)，搅拌下，加入叠氮化钠和氯化锌，回流反应8h，得齐墩果酸2h-四唑-5-甲酯(2)和齐墩果酸1h-四唑-5-甲酯(3)的混和物；
(3)将齐墩果酸1h-四唑-5-甲酯(3)和齐墩果酸2h-四唑-5-甲酯(2)的混和物作为反应物与取代溴苄反应，得到齐墩果酸四唑衍生物。
齐墩果酸四唑衍生物为：齐墩果酸2-取代苄酯-四唑-5-甲酯(2a～2k)和齐墩果酸1-取代苄酯-四唑-5-甲酯(3a～3k)，其中，(2a～2k)为齐墩果酸2h四唑衍生物，(3a～3k)为齐墩果酸1h四唑衍生物，结构式分别如下表所示：
2a为：
2b为：
2c为：
2d为：
2e为：
2f为：
2g为：
2h为：
2i为：
2j为：
2k为：
3a为：
3b为：
3c为：
3d为：
3e为：
3f为：
3g为：
3h为：
3i为：
3j为：
3k为：
所述的齐墩果酸四唑衍生物的制备方法，反应路线如下：
作为本发明的第三方面，在抗肿瘤方面的应用。
进一步，所述应用是在制备具有抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明制备的齐墩果酸四唑衍生物通过药理实验，表明该类化合物相比齐墩果酸具有更优的抗肿瘤活性，本发明的研究结果为该类抗肿瘤化合物的深入研究奠定较好的基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
实施例1：制备齐墩果酸四唑衍生物
(1)制备齐墩果烷-12-烯-28酸乙腈酯(1)
于100ml反应瓶中，依次加入齐墩果酸(5g,11mmol)、50mldmf、氯乙腈(1.05ml,16.5mmol)和k2co3(2.2g,16.5mmol),室温搅拌反应4h。将溶液倾入碎冰中，抽滤，干燥。柱层析分离得白色粉末5g,收率92.0％。
(2)制备中间体齐墩果酸2h-四唑-5-甲酯(2)和齐墩果酸1h-四唑-5-甲酯的混和物(3)
于250ml反应瓶中，加入齐墩果烷-12-烯-28酸乙腈酯(1)(10g,20.2mmol)、90ml异丙醇和30ml水、叠氮钠(4g,60.6mmol)和zncl2(5g,1.821mmol)，回流反应8h。将溶液倾入碎冰中，抽滤，干燥。柱层析分离，得白色粉末9.36g，收率86.1％。
(3)制备齐墩果酸-2-对氟苄基四唑-5-甲酯(2a)和齐墩果酸1-对氟苄基四唑-5-甲酯(3a)
于50ml反应瓶中，加入齐墩果酸1h-四唑-5-甲酯和齐墩果酸2h-四唑-5-甲酯的混和物(0.5g，9.3mmol)、5mldmf、对氟苄溴(0.26g,14.0mmol)、k2co3(1.92g,13.95mmol)，反应4h，将溶液倾入碎冰中，抽滤，干燥。经硅胶柱层析分离得齐墩果酸2-对氟苄基四唑-5-甲酯(2a)0.28g，齐墩果酸1-对氟苄基四唑-5-甲酯(3a)0.24g，收率分别为44.7％和38.3％。熔点分别为84.5～87.5℃和174.8～177.4℃。
本发明的实施不限于以上实施例，其余化合物制备时，采用相应r取代的化合物作为原料，方法同上。
实施例中所用试剂均为市售分析纯。
部分目标物的外观、总收率、熔点和1hnmr13cnmr和hrms数据如下。
2a:白色粉末，总收率35.4％,mp:84.5～87.5℃；1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.38～7.31(m,1h),7.16～7.13(d,j＝8.0hz,1h),7.08～7.03(m,2h),5.74(s,2h),5.35～5.18(m,3h),,2.83～2.79(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),2.00～1.92(dt,j＝16.0,4.0hz,1h),1.85～1.81(dd,j＝8.8,3.2hz,2h),1.25(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.89(s,3h),0.88(s,3h),0.87(s,3h),0.77(s,3h),0.63(s,3h)；hrms:calcdforc39h54fn4o2[m-oh]+629.42034,found629.42253.
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2d:白色粉末，总收率40.9％,mp:67.0～70.0℃；1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.36～7.30(dd,j＝12.0,8.0hz,4h),5.70(s,1h),5.34～5.22(m,3h),3.22～3.18(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),2.83～2.79(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),2.02～1.94(dt,j＝16.0,4.0hz,2h),1.85～1.81(dd,j＝8.8,3.2hz,2h),1.25(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.89(s,3h),0.88(s,3h),0.87(s,3h),0.77(s,3h),0.61(s,3h)；hrms:calcdforc39h54o2n4cl[m-oh]+645.39061,found645.39298.
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3g:白色粉末，总收率32.2％,mp:179.6～182.2℃；1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.63～7.61(d,j＝8.0hz,1h),7.33～7.22(m,2h),6.93～6.92(d,j＝8.0hz,1h),5.74(s,1h),5.35～5.24(m,3h),3.22～3.18(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),2.83～2.79(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),2.02～1.94(dt,j＝16.0,4.0hz,2h),1.85～1.81(dd,j＝8.8,3.2hz,2h),1.25(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.89(s,3h),0.87(s,3h),0.77(s,3h),0.48(s,3h)；hrms:calcdforc39h56o3n4br[m+h]+707.35062,found707.35303.
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3i:白色粉末，总收率31.4％,mp:96.6～98.0℃；hrms:calcdforc40h56o3n5[m+h]+654.43508,found654.43777.
3j:白色粉末，总收率30.7％,mp:143.4～145.2℃；1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.38～7.34(m,3h),7.24～7.18(m,2h),5.70(s,2h),5.27～5.25(t,j＝4.0hz,1h),5.17(s,2h),3.22～3.18(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),2.83～2.79(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),2.02～1.94(dt,j＝16.0,4.0hz,2h),1.85～1.81(dd,j＝8.8,3.2hz,2h),1.25(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.89(s,3h),0.87(s,3h),0.77(s,3h),0.48(s,3h)；
13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:176.55,150.08,142.60,132.80,128.81,128.58,127.03,122.40,78.44,54.66,52.61,50.80,46.96,46.54,41.15,40.84,38.65,38.22,37.89,36.46,33.14,32.46,32.10,31.72,30.10,29.18,27.58,27.05,26.64,25.32,23.07,22.82,22.47,17.76,16.11,15.06,14.79；hrms:calcdforc39h57o3n4[m+h]+629.44020,found629.44252.
3k:白色粉末，总收率31.8％,mp:156.8～159.5℃；1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.29～7.15(m,3h),6.90～6.88(d,j＝8.0hz,1h),5.68(s,1h),5.27～5.25(t,j＝4.0hz,1h),5.17(s,2h),3.22～3.18(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),2.83～2.79(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),2.02～1.94(dt,j＝16.0,4.0hz,2h),1.85～1.81(dd,j＝8.8,3.2hz,2h),1.25(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.89(s,3h),0.87(s,3h),0.77(s,3h),0.48(s,3h)；
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药理实验
本研究工作采用mtt法，以顺铂(cisplatin)为阳性对照药，测定目标化合物对人胃癌细胞mkn-45、人乳腺癌细胞mcf-7和大鼠胶质瘤c6细胞的体外抗肿瘤活性，并测定了部分化合物的ic50。结果表明该化合物具有更优的抗肿瘤活性。
齐墩果酸及其衍生物对上述肿瘤细胞的体外抑制活性分析
将对数生长期的不同肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液。根据细胞生长速度的差异，按4000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl。24h后，加入浓度为10μm的化合物和cisplatin及相应溶剂对照的完全培养基。每孔加100μl(dmso终浓度＜0.1％)，每组设3个平行孔，于37℃继续培养72h后，弃上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培养基，继续培养4h，弃上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓒沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(od)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算每种化合物作用下的，不同肿瘤细胞的存活率。
细胞抑制率(％)＝(1-给药组平均od值/对照组平均od值)×100％
齐墩果酸及2c、3k对上述肿瘤细胞的半数抑制率的研究
将对数生长期的不同肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液。根据细胞生长速度的差异，按4000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl。24h后，加入含不同浓度化合物及相应溶剂对照的完全培养基，每孔加100μl(dmso终浓度＜0.1％)，每种受试化合物设8个剂量组，每组设3个平行孔，于37℃继续培养72h后，弃上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培养基，继续培养4h，弃上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓒沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(od)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算ic50。
ic50＝(对照组平均od值-给药组平均od值)/对照组平均od值×100％
体外抗肿瘤活性测试结果
部分化合物对上述三株肿瘤细胞的抑制率见表1。
表1目标物浓度为10μm时，对上述三株肿瘤细胞的抑制率数据
目标物2c、3h和oa对上述肿瘤细胞的ic50如表2所示。
表2目标物2c、3h和oa对上述肿瘤细胞的ic50数据
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。