本发明属于医药化学中的抗病毒研究领域，涉及一类新型的核苷氨基磷酸酯化合物或立体异构体、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或结晶，及其在抗病毒感染方面，特别是作为治疗丙型肝炎的应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(hcv)每年有3-4百万新增的患者，世界卫生组织估计在全世界的感染者已超过2亿，在中国超过1000万病人，hcv属于黄病毒科肝病毒属病毒。长期丙型肝炎病毒感染轻至炎症，重至肝硬化、肝癌。且丙肝肝硬化失代偿期时，可以出现各种并发症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性脑病，肝肾综合征，肝衰竭等表现。最初治疗hcv感染的方法是干扰素以及干扰素和利巴韦林联合疗法，仅50％的治疗者对该方法有反应，且干扰素具有明显的副作用，例如流行性感冒样症状、体重减低以及疲乏无力，而干扰素和利巴韦林联合疗法则产生相当大的副作用，包括溶血、贫血症和疲乏等。
近几年美国fda批准了多个hcv药物，包括蛋白酶抑制剂、核苷类和非核苷类聚合酶抑制剂以及ns5a抑制剂等。fda批准的蛋白酶抑制剂类药物有三个：vx-950(telaprevir),sch-503034(boceprevir)和tmc435(simeprevir)，蛋白酶抑制剂的缺点是易产生突变、毒性大、生物利用度差，对个别的基因类型有效。telaprevir作为第一代的蛋白酶抑制剂已经退出市场。高活性和广谱的第二代和第三代蛋白酶抑制剂主要用作和其他丙肝药物的联合用药的组分之一。
丙肝的聚合酶抑制剂通常分为核苷类和非核苷类两种。目前，临床上仅有索菲布韦一个核苷类丙肝药物被fda批准上市，sofosbuvir与其它抗hcv在研药物联用的临床试验也表现出积极效果。但是，由于sofosbuvir在体内有近90％代谢为没有活性的代谢产物,需要用较大的给药剂量，丙肝患者需要接受长期治疗，随之带来的病毒耐药以及长期安全性问题不容忽视，因此，开发新的生物利用度高及更长的半衰期，肝脏选择性好，药效高的hcv感染治疗药物仍是临床的迫切需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种全新的核苷氨基磷酸酯化合物及其医药组合物和用途。
本发明的技术解决方案是：
一种核苷氨基磷酸酯化合物，其特征是：核苷以磷氧键连接磷酸，结构如通式a、b和c所描述的核苷氨基磷酸酯化合物、其立体异构体、其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶；
其中，
r1为c1-6烷基、c3-6环烷基、苄基、氘代的c1-6烷基、氘代的c3-6环烷基或氘代的苄基：例如，r1为甲基、乙基、异丙基或异丁基，或者为氘代的甲基、乙基、异丙基或异丁基。优选地，r1为异丙基或氘代异丙基(如(cd3)2ch-、(cd3)2cd-或者(ch3)2cd-)；
r2为任意取代的苯基、联苯基、杂芳基或萘基，或者氘代的任意取代苯基、联苯基、杂芳基或萘基，其取代基可以是卤素(氟、氯、溴、碘)、叠氮、氰基、炔基、c1-4烷基、c3-4环烷基或c1-4烷氧基。优选的，r2为苯基、联苯基、4-环丙基苯基或氘代苯基。
r3选自各种天然或非天然氨基酸酰基、羧酸酰基、多肽酰基或者氢。例如，r3为氢、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、丙氨酰基、甘氨酰基、脯氨酰基、赖氨酰基、苯丙氨酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、缬氨酰基、色氨酰基、酪胺酰基、天冬氨酰基、天冬酰胺酰基、谷氨酰基、谷氨酰胺酰基、甲硫氨酰基、苏氨酰基、组胺酰基、丝氨酰基、半胱氨酰基、精氨酰基(等d-或l-型氨基酸)或β-丙氨酰基。
r4、r5、r6、r7、r8和r9独立选自h或者氘。
采用实施例中描述的合成方法，以下的化合物均可以方便地得到:
述的核苷氨基磷酸酯化合物，与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂以及纳米制剂，以适合于经口或胃肠外给药；给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。
一种包含所述的核苷氨基磷酸酯化合物的医药组合物。
所述医药组合物，还含有独立地选自以下药物的其他治疗剂：利巴韦林(ribavirin)、干扰素、丙肝ns3蛋白酶抑制剂、hcv逆转录酶ns5b非核苷抑制剂、hcv逆转录酶ns5b核苷抑制剂、ns5a抑制剂以及ns5a抑制剂的增效剂、进入抑制剂、环孢素免疫抑制剂、ns4a拮抗剂、ns4b抑制剂、亲环素抑制剂。
一种所述的核苷氨基磷酸酯化合物及其药用组合物在制备抗黄病毒科病毒的药物中的应用，其特征是：所述黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒。
本发明提供了上述核苷氨基磷酸酯化合物的制备方法如下式所示：
在碱性条件下，苯酚或取代苯酚(1)与三氯氧磷后，加入氨基酸酯盐酸盐(2)反应，再加入五氟苯酚(3)反应得到化合物(4)和(5)；
在低温条件下，化合物(4)或(5)与化合物(6)反应，分别得到化合物(7)或(8),然后，在缩合剂作用下分别与boc保护的氨基酸反应，然后在酸性条件下脱去保护基boc，或直接与羧酸反应得到(9)或(10)
其中，化合物中的r2、r3如式a、b和c化合物中所定义，缩合剂可以为常用的n，n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、羰基二咪唑(cdi)、n，n'-二异丙基碳二亚胺(dic)、n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edchcl)、o-(7-氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、苯并三氮唑-n，n，n'，n-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，boc基团为保护氨基的叔丁基氧羰基保护基。
本发明描述的核苷氨基磷酸酯化合物，其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物或结晶与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供的核苷氨基磷酸酯化合物单独，或者与其他hcv治疗剂如ns5a抑制剂或者蛋白酶抑制剂共同构成药物组合物，用于治疗黄病毒科病毒感染的病患。包括向所述患者施用通式a、b和c的化合物、其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物或结晶或者包含通式a、b和c的化合物、其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物或结晶的药物组合物，以有效治疗丙型肝炎。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗和/或预防rna病毒例如黄病毒科病毒感染的方法，包括向需要此治疗的病患给予本发明的化合物、其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物或结晶或其药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供抑制rna病毒例如黄病毒科病毒感染的方法，包括使所述病毒与治疗有效量的本发明的化合物、其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物或结晶或其药物组合物接触。
"黄病毒科病毒"是指黄病毒科的任何病毒，包括感染人和非人动物的那些病毒，例如黄病毒、鼠疫病毒和丙型肝炎病毒，登革热病毒。本发明的化合物和组合物可特别用于治疗或预防性治疗hcv和登革热病毒。
本发明提供的核苷氨基磷酸酯化合物、其立体异构体、盐、水合物、溶剂合物、结晶或组合物在预防或治疗病毒性感染的应用，尤其是在预防或治疗黄病毒感染疾病的应用，以及在制备预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物中的应用，特别是在制备预防和/或治疗hcv病毒感染，如hcv病毒性肝炎疾病的药物中的应用。该类疾病的实例有急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎以及丙型肝炎和乙型肝炎或丁型肝炎的混合感染。
术语定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。包括顺反异构体、对映异构体和构象异构体。所有立体异构体均属于本发明的范围。本发明的化合物的单独立体异构体可基本上不含其它异构体或可以混合成例如外消旋体，或者与所有其它的立体异构体混合。
术语“盐”是指本发明所述的化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸可选自：磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、对甲苯磺酸、苹果酸、甲烷磺酸或其类似物。
术语“溶剂化物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本发明化合物的形式。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明范围内，溶剂化物优选是水合物。
术语“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。
术语“烷基”是指直链、支链或环状的饱和烃基，优选6个碳原子以下的烃基。烷基的实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、新戊基、环己基、正己基、异己基、2,2,-甲基丁基和2,3-二甲基丁基。术语“c1-6烷基”是指含有1-6个碳原子的直链、支链或环状的饱和烃基。术语“c1-4烷基”是指含有1-4个碳原子的直链、支链或环状的饱和烃基。
术语“卤素”是指氟、氯、溴、碘。
术语“杂环基”是指至少含有一个杂原子的环状基团，其中杂原子为n、o或s，包括单杂环基和稠杂环基。其中单杂环基包括但不限于呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、咪唑、1,2,3-三氮唑、1,2,4-三氮唑、1,2,3-噻二唑，噁唑、1,2,4-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、四氢呋喃、四氢吡咯、哌啶、哌嗪、吗啉、异噁唑啉等。稠杂环基包括但不限于喹啉、异喹啉、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、嘌呤、吖啶、咔唑、芴、色烯酮、芴酮、喹喔啉、3,4-二氢萘酮、二苯并呋喃、氢化二苯并呋喃、苯并噁唑基等。
氘是氢的同位素，原子质量是后者的2倍，与碳的结合更强。氘化“和”氘“表示氢在指定位置被替换为氘。一个“氘化的取代基”是取代基，其中至少一个氢被以指定的百分比富集取代氘。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。本发明实施例中使用的试剂和原料均为商购所得。
实施例1
((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(i-01b)
步骤1.[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸异丙酯(5)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸异丙酯(6)
在反应瓶中加入二氯磷酸苯酯2(11.4克(95％)，51.4毫摩尔)，及d-丙氨酸异丙酯盐酸盐1(8.64克，51.4毫摩尔)，冷却到-70℃，在1.5小时内滴加三乙胺(14.4毫升，103.4毫摩尔)的二氯甲烷(44毫升)溶液,加毕后，升至室温，搅拌过夜后将反应混合物冷却至0℃，在40分钟内将五氟苯酚4(9.46克，51.4毫摩尔)和三乙胺(7.2毫升，51.4毫摩尔)的二氯甲烷(60ml)溶液滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.9克白色固体，固体用10％用叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体5(6.7克)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得6(4.4克)和5(0.9克)，5和6纯度均大于99％。
5：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.39–7.35(m,2h),7.34–7.21(m,3h),5.18–4.97(m,1h),4.28–4.09(m,1h),3.97–3.92(m,1h),1.46(d,j＝7.0hz,3h),1.26(d,j＝5.9hz,3h),1.25(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.85.
6：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.37–7.33(m,2h),7.32–7.19(m,3h),5.20–4.95(m,1h),4.18–4.01(m,1h),3.96–3.90(m,1h),1.48(d,j＝7.0hz,3h),1.25(d,j＝5.9hz,3h),1.24(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.55.
步骤2.i-01b的合成
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂5(725mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-01b(296mg),收率56％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.74(s,1h),7.36–7.31(m,3h),7.25-7.22(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.58(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.51-4.46(m,2h),4.40–4.34(m,1h),4.27(brs,1h),4.13–4.08(m,1h),3.93–3.78(m,2h),1.37-1.28(m,6h),1.23(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.65；lcms-esi+(m/z):530.2(m+h)+.
实施例2
((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(i-01c)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂6(725mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-01c(308mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),7.38–7.30(m,3h),7.26-7.22(m,2h),7.20-7.16(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.57(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.50-4.46(m,2h),4.40–4.33(m,1h),4.28(brs,1h),4.13–4.08(m,1h),3.92–3.78(m,2h),1.37-1.28(m,6h),1.22(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.60；lcms-esi+(m/z):530.2(m+h)+.
实施例3
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-丙氨酸酯(i-02b)
步骤1.i-02’b的合成
在反应管中将boc-ala-oh,8(43mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-02’b,65.1mg，收率62％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.66(d,j＝8.2hz,1h),7.40–7.36(m,2h),7.29-7.27(m,2h),7.22-7.18(m,1h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.33–5.41(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.35–4.27(m,2h),4.22-4.17(m,1h),3.93–3.88(m,1h),1.44(s,9h),1.40-1.31(m,9h),1.21(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.60；lcms-esi+(m/z):701.3[m+1]+。
步骤2.i-02b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-02’b(65mg,93umol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-02b,49.1mg，收率88％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.52(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.37(m,2h),7.29-7.17(m,3h),6.11(d,j＝19.2hz,1h),5.63(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.39(m,1h),4.98–4.94(m,1h),4.53-4.50(m,2h),4.35–4.26(m,2h),3.93–3.88(m,1h),1.61(d,j＝4.3hz,3h),1.43-1.21(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.37；lcms-esi+(m/z):601.4[m+1]+。
实施例4
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((s)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-丙氨酸酯(i-02c)
步骤1.i-02’c的合成
在反应管中将boc-ala-oh,8(43mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-02’c，66.9mg，收率63.7％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.2hz,1h),7.42–7.33(m,2h),7.28-7.25(m,2h),7.21-7.18(m,1h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.33(m,1h),4.98–4.92(m,1h),4.54-4.50(m,1h),4.36–4.26(m,2h),4.23-4.17(m,1h),3.94–3.87(m,1h),1.44(s,9h),1.40-1.30(m,9h),1.21(d,j＝6.3hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.55；lcms-esi+(m/z):701.3[m+1]+。
步骤2.i-02c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-02’c(65mg,93umol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-02c，48mg，收率86％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.53(d,j＝8.1hz,1h),7.43–7.37(m,2h),7.29-7.16(m,3h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.60(d,j＝8.1hz,1h),5.45–5.39(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.54-4.50(m,2h),4.33–4.26(m,2h),3.93–3.87(m,1h),1.60(d,j＝4.3hz,3h),1.43-1.20(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.31；lcms-esi+(m/z):601.4[m+1]+。
实施例5
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(i-05b)
步骤1.i-05’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-05’b，70.3mg，收率64.4％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.68(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.36(m,2h),7.29-7.26(m,2h),7.20-7.17(m,1h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.1hz,1h),5.41–5.33(m,1h),4.98–4.93(m,1h),4.54-4.51(m,1h),4.37–4.25(m,2h),4.07-4.04(m,1h),3.93–3.89(m,1h),2.18–2.12(m,1h),1.44(s,9h),1.38-1.31(m,6h),1.21(d,j＝6.2hz,6h),0.99(d,j＝6.3hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.74；lcms-esi+(m/z):729.4[m+1]+。
步骤2.i-05b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-05’b(70mg,96umol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-05b，53.8mg，收率89％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.30-7.2(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.94，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.34(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):629.3(m+h)+.
实施例6
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(i-05c)
步骤1.i-05’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-05’c，65.5mg，收率60％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.35(m,2h),7.29-7.25(m,2h),7.22-7.17(m,1h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.35(m,1h),4.96–4.93(m,1h),4.52-4.50(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.08-4.05(m,1h),3.95–3.88(m,1h),2.19–2.12(m,1h),1.44(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.21(d,j＝6.2hz,6h),0.99(d,j＝6.2hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.90；lcms-esi+(m/z):729.5[m+1]+。
步骤2.i-05c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-05’c(65mg,89umol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-05c，50.3mg，收率90％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.0hz,1h),7.44-7.39(m,2h),7.31-7.21(m,3h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.69(d,j＝8.1hz,1h),5.45–5.36(m,1h),5.01-4.94，(m,1h)，4.53-4.47(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.86(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.41-1.34(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h),1.14(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.98；lcms-esi+(m/z):629.2(m+h)+.
实施例7
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基异丁酸酯(i-22b)
在反应管中将异丁酸10(20mg,225μmol)与0.5ml1，4-二氧六环混合，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01b(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体产物i-22b，46mg，收率51％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.41-7.36(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.47–5.35(m,1h),5.02-4.93(m,1h)，4.52-4.47(m,2h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.43(d,j＝19.0hz,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.16(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):600.3(m+h)+.
实施例8
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基异丁酸酯(i-22c)
在反应管中将异丁酸10(20mg,225μmol)与0.5ml1，4-二氧六环混合，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-01c(79.5mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24ul,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体产物i-22c，50mg，收率55.4％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.37(m,2h),7.33-7.22(m,3h),6.11(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.0hz,1h),5.48–5.36(m,1h),5.03-4.92(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.16–4.13(m,1h),3.95–3.85(m,1h),2.47–2.35(m,1h),1.45(d,j＝19.2hz,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.18(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.11；lcms-esi+(m/z):600.4(m+h)+.
实施例9
((r)-([1,1’-联苯]-4-基氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)d-丙氨酸异丙酯(i-23b)
步骤1((r)-([1,1’联苯]-4-基氧基)(五氟苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(12)和((s)-([1,1’联苯]-4-基氧基)(五氟苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(13)
在反应瓶中加入三氯氧磷(9克,58.7mmol),加二氯甲烷200ml,冷却到-70℃，缓慢滴加对苯基苯酚(l0克,58.7mmol)和三乙胺(6克,58.7mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜。将上述混合液冷却到0℃，加入d-丙氨酸异丙酯盐酸盐(9克，53.1mmol)，冷却到-70℃,滴加三乙胺(13.4克,130mmol)的二氯甲烷溶液60ml,加毕，升温到0℃,反应3小时，将五氟苯酚(l0克,53mmol)和三乙胺(8克，77.6mmol)的二氯甲烷溶液100ml液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.6克白色固体，固体用10％用叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体12(5.3克)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得13(3.7克)和12(0.8克)，12和13纯度均大于99％。
12：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.78–7.70(m,4h),7.50–7.33(m,5h),5.16–4.97(m,1h),4.26–4.08(m,1h),3.97–3.93(m,1h),1.45(d,j＝7.0hz,3h),1.27(d,j＝5.9hz,3h),1.26(d,j＝5.9hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.65.
13：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.75–7.68(m,4h),7.48–7.32(m,5h),5.20–4.98(m,1h),4.22–4.05(m,1h),3.96–3.91(m,1h),1.47(d,j＝7.0hz,3h),1.26(d,j＝6.2hz,3h),1.25(d,j＝6.2hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.
步骤2.i-23b的合成
向10ml反应管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂12(846mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(150ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-23b(176mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.76–7.69(m,4h),7.51-7.39(m,6h),6.21(d,j＝19.2hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.56-4.53(m,1h),4.40–4.34(m,1h),4.13–4.09(m,1h),3.93–3.79(m,2h),1.38-1.28(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.85；lcms-esi+(m/z):606.3(m+h)+.
实施例10
((s)-([1,1’-联苯]-4-基氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)d-丙氨酸异丙酯(i-23c)
向10ml反应管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂13(846mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(150ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-23c(158mg),收率52％)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.77–7.69(m,4h),7.53-7.40(m,6h),6.18(d,j＝19.2hz,1h),5.66(d,j＝8.0hz,1h),5.04–4.95(m,1h),4.55-4.52(m,1h),4.41–4.34(m,1h),4.15–4.08(m,1h),3.94–3.79(m,2h),1.39-1.27(m,6h),1.24(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.75；lcms-esi+(m/z):606.2(m+h)+.
实施例11
(2r,3r,4r,5r)-2-((((r)-([1,1’-联苯基]-4-基氧基)(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-3-基)l-丙氨酸酯(i-25b)
步骤1.i-25’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-23b(90.8mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-25’b，63.9mg，收率53％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.77–7.63(m,4h),7.56-7.31(m,6h),6.18(d,j＝19.4hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.38(m,1h),4.96–4.93(m,1h),4.56-4.52(m,1h),4.38–4.26(m,2h),4.09-4.04(m,1h),3.94–3.86(m,1h),2.19–2.11(m,1h),1.47(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,6h),0.98(d,j＝6.3hz,3h)0.97(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.94；lcms-esi+(m/z):805.4[m+1]+。
步骤2.i-25b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-25’b(60mg,74μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-25b，44.3mg，收率85％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.80–7.65(m,4h),7.58-7.33(m,6h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),5.51–5.36(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.39–4.36(m,1h),4.16–4.10(m,1h),3.90–3.83(m,1h),2.44–2.33(m,1h),1.42-1.35(m,6h),1.25(d,j＝6.2hz,3h),1.24(d,j＝6.0hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):705.3(m+h)+.
实施例12
(2r,3r,4r,5r)-2-((((s)-([1,1’-联苯基]-4-基氧基)(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-3-基)l-丙氨酸酯(i-25c)
步骤1.i-25’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-23c(90.8mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-25’c，68.7mg，收率57％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.74–7.62(m,4h),7.55-7.30(m,6h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.36(m,1h),4.97–4.92(m,1h),4.54-4.50(m,1h),4.39–4.25(m,2h),4.08-4.02(m,1h),3.93–3.84(m,1h),2.20–2.10(m,1h),1.45(s,9h),1.38-1.30(m,6h),1.24(d,j＝6.0hz,6h),0.99(d,j＝6.0hz,3h)0.98(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.65；lcms-esi+(m/z):805.3[m+1]+。
步骤2.i-25c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-25’c(60mg,74μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-25c，41.8mg，收率80％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.78–7.62(m,4h),7.52-7.32(m,6h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.77(d,j＝8.0hz,1h),5.52–5.35(m,1h),5.05-4.94，(m,1h)，4.53-4.46(m,2h),4.37–4.32(m,1h),4.14–4.10(m,1h),3.92–3.82(m,1h),2.43–2.33(m,1h),1.41-1.34(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.0hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):705.2(m+h)+。
实施例13
((r)-(4-环丙基苯氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(i-27b)
步骤1.((r)-(4-环丙基苯氧基)(五氟苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(15)和((s)-(4-环丙基苯氧基)(五氟苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(16)
在反应瓶中加入三氯氧磷(9g,58.7mmol),加二氯甲烷200ml,冷却到-70℃，缓慢滴加对环丙基苯酚(7.88g,58.7mmol)和三乙胺(6g,58.7mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜。将上述混合液冷却到0℃，加入d-丙氨酸异丙酯盐酸盐(9g，53.1mmol)，冷却到-70℃,滴加三乙胺(13.4g,130mmol)的二氯甲烷溶液60ml,加毕，升温到0℃,反应3小时，将五氟苯酚(l0g,53mmol)和三乙胺(8g，77.6mmol)的二氯甲烷溶液100ml液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得11.2克白色固体，固体用10％用叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体15(3.8g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得16(3.1g)和15(0.6g)，15和16纯度均大于99％。
15：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.45(d,2h),7.33(d,2h),5.16–4.97(m,1h),4.16–4.08(m,1h),3.97(brs,1h),1.88–1.78(m,1h),1.61–1.43(m,2h),1.33–1.22(m,11h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.85.
16：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.44(d,2h),7.35(d,2h),5.13–4.96(m,1h),4.01–3.90(m,1h),3.87(brs,1h),1.86–1.75(m,1h),1.63–1.46(m,2h),1.35–1.23(m,11h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.15.
步骤2.i-27b的合成
向10ml反应管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂15(790mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(150ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-27b(151mg),收率53％)。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.48–7.39(m,3h),7.35(d,2h),6.28(d,j＝19.0hz,1h),5.62(d,j＝8.2hz,1h),5.01–4.92(m,1h),4.55-4.52(m,1h),4.43–4.36(m,1h),4.15–4.09(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.86–1.75(m,1h),1.63–1.46(m,2h),1.40(d,j＝19.0hz,3h),1.35–1.23(m,11h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.65；lcms-esi+(m/z):570.2(m+h)+.
实施例14
((s)-(4-环丙基苯氧基)(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(i-27c)
向10ml反应管中加入核苷7(130.1mg,0.5mmol)和3.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(1.5ml的1mthf溶液，1.5mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂16(790mg，1.6mmol)在3mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(150ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物i-27c(151mg),收率53％)。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.45–7.35(m,3h),7.33(d,2h),6.25(d,j＝19.2hz,1h),5.60(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.41–4.35(m,1h),4.13–4.07(m,1h),3.93–3.75(m,2h),1.86–1.76(m,1h),1.62–1.43(m,2h),1.41(d,j＝19.0hz,3h),1.36–1.21(m,11h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.25；lcms-esi+(m/z):570.3(m+h)+.
实施例15
(2r,3r,4r,5r)-2-((((r)-(4-环丙基苯氧基))(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-3-基-l-丙氨酸酯(i-29b)
步骤1.i-29’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-27b(85.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-29’b，63.4mg，收率55％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.46–7.36(m,3h),7.34(d,2h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.37(m,1h),4.97–4.93(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.39–4.26(m,2h),4.08-4.05(m,1h),3.95–3.87(m,1h),2.18–2.11(m,1h),1.87–1.75(m,1h),1.63–1.52(m,2h),1.48(s,9h),1.43–1.37(m,6h),1.35–0.96(m,14h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.98；lcms-esi+(m/z):769.3[m+1]+。
步骤2.i-29b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-29’b(60mg,78μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-29b，43.8mg，收率84％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.43–7.37(m,3h),7.33(d,2h),6.12(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.41–5.35(m,1h),4.95–4.93(m,1h),4.54-4.49(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.09-4.03(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.20–2.10(m,1h),1.86–1.75(m,1h),1.61–1.52(m,2h),1.45–1.36(m,6h),1.35–0.93(m,14h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):669.3(m+h)+.
实施例16
(2r,3r,4r,5r)-2-((((s)-(4-环丙基苯氧基))(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)磷酰基)氧)甲基)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-3-基-l-丙氨酸酯(i-29c)
步骤1.i-29’c的合成
在反应管中将boc-val-oh，9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入i-27c(85.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体i-29’c，61.6mg，收率53％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.47–7.36(m,3h),7.35(d,2h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.38(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.50(m,1h),4.38–4.26(m,2h),4.10-4.05(m,1h),3.96–3.87(m,1h),2.20–2.11(m,1h),1.89–1.75(m,1h),1.62–1.51(m,2h),1.46(s,9h),1.45–1.37(m,6h),1.35–0.98(m,14h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.65；lcms-esi+(m/z):769.3[m+1]+。
步骤2.i-29c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体i-29’c(60mg,78μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物i-29c，45.1mg，收率86％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.42–7.37(m,3h),7.34(d,2h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.70(d,j＝8.0hz,1h),5.43–5.33(m,1h),4.95–4.91(m,1h),4.52-4.49(m,1h),4.37–4.25(m,2h),4.09-4.01(m,1h),3.96–3.84(m,1h),2.21–2.11(m,1h),1.85–1.73(m,1h),1.62–1.51(m,2h),1.48–1.37(m,6h),1.35–0.90(m,14h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.11；lcms-esi+(m/z):669.4(m+h)+.
实施例17
d-丙氨酸氘代异丙酯盐酸盐19、20、21的制备
在0℃下，将参照文献方法(journaloflabelledcompounds&radiopharmaceuticals,41(12),1145‐1163；1998)合成的六氘代异丙醇(17，1.05g)与n‐boc保护的d‐丙氨酸(1.8g)、edc(2.74g)及4‐n,n‐二甲胺基吡啶(100mg)混溶于无水二氯甲烷(20ml)中，撤去冰浴后室温下搅拌过夜，tlc检测反应结束后加入二氯甲烷(100ml)稀释，有机相分别用5％碳酸氢钠溶液和饱和盐水洗涤，干燥，浓缩后残余物用柱层析(己烷：乙酸乙酯＝4：1)纯化，得到无色油状液体产物(18，2.3g)。
0℃下将化合物(18，2.3g)溶于4mhcl的二氧六环溶液中，室温下搅拌过夜，tlc检测反应结束后减压蒸除溶剂，残余物加入甲醇(2x3ml)并蒸除，残余物中加无水乙醇(5ml)析出白色沉淀即为d-丙氨酸六氘代异丙酯盐酸盐(19)。
用同样的方法制备d-丙氨酸单氘代异丙酯盐酸盐(20)和d-丙氨酸七氘代异丙酯盐酸盐(21)。
实施例18
氘代异丙基[(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸酯22、23、24、25、26、27的制备
参考[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸异丙酯(5)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸异丙酯(6)的制备方法，用同样的方法制备[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸六氘代异丙酯(22)和[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸六氘代异丙酯(23)
22：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.38–7.35(m,2h),7.33–7.21(m,3h),4.87(s,1h),3.92(brs,1h),3.68–3.60(m,1h),1.41(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.
23：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.36(m,2h),7.32–7.20(m,3h),4.91(m,1h),3.86(brs,1h),3.66–3.61(m,1h),1.43(d,j＝7.2hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.65.
[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸单氘代异丙酯(24)和
[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸单氘代异丙酯(25)
24：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.35(m,2h),7.33–7.20(m,3h),3.95(brs,1h),3.65–3.60(m,1h),1.43(s,6h),1.41(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.99.
25：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.42–7.34(m,2h),7.32–7.19(m,3h),3.89(brs,1h),3.66–3.61(m,1h),1.45(s,6h),1.42(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.63.
[(r)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸七氘代异丙酯(26)和
[(s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸七氘代异丙酯(27)
26：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.40–7.36(m,2h),7.33–7.21(m,3h),3.98(brs,1h),3.65–3.59(m,1h),1.37(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.97.
27：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.42–7.34(m,2h),7.32–7.19(m,3h),3.89(brs,1h),3.66–3.60(m,1h),1.35(d,j＝7.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.60.
实施例19
异丙基[(五氟苯氧基)(五氘代苯氧基)磷酰基]—d—丙氨酸酯30、31的制备
在反应瓶中加入二氯磷酸五氘代苯酯28(11.1克，51.4毫摩尔)，及d-丙氨酸异丙酯盐酸盐1(8.64克，51.425.7毫摩尔)，冷却到-70℃，在1.5小时内滴加三乙胺(14.4毫升，103.4毫摩尔)的二氯甲烷(44毫升)溶液,加毕后，升至室温，搅拌过夜后将反应混合物冷却至0℃，在40分钟内将五氟苯酚4(9.46克，51.4毫摩尔)和三乙胺(7.2毫升，51.4毫摩尔)的二氯甲烷(60ml)溶液滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入150毫升二氯甲烷及120毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得13.9克白色固体，固体用10％用叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体30(6.5克)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得31(4.5克)和30(1.0克)，30和31纯度均大于99％。
30：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):5.22–4.96(m,1h),4.25–4.09(m,1h),3.97–3.91(m,1h),1.47(d,j＝7.0hz,3h),1.25(d,j＝6.0hz,3h),1.24(d,j＝6.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-2.05.
31：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):5.24–4.97(m,1h),4.16–4.03(m,1h),3.95–3.90(m,1h),1.48(d,j＝7.0hz,3h),1.23(d,j＝6.0hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h).31pnmr(162mhz,cdcl3)δ-1.75.
实施例20
((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸七氘代异丙酯(ii-01b)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂26(736mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物ii-01b(322mg),收率60％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.78(s,1h),7.40–7.33(m,3h),7.25-7.20(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.95(m,1h),4.50-4.46(m,2h),4.42–4.33(m,1h),4.29(brs,1h),3.93–3.78(m,2h),1.38-1.29(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.68；lcms-esi+(m/z):537.2(m+h)+.
实施例21
((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸七氘代异丙酯(ii-01c)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂27(736mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物ii-01c(305mg),收率57％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.70(s,1h),7.41–7.34(m,3h),7.25-7.21(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.53(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.93(m,1h),4.50-4.45(m,2h),4.42–4.31(m,1h),4.26(brs,1h),3.94–3.77(m,2h),1.38-1.30(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.59；lcms-esi+(m/z):537.2(m+h)+.
实施例22
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-七氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(ii-03b)
步骤1.ii-03’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入ii-01b(80.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体ii-03’b，72.2mg，收率65.4％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.67(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.36(m,2h),7.28-7.23(m,2h),7.20-7.16(m,1h),6.17(d,j＝19.0hz,1h),5.77(d,j＝8.1hz,1h),5.40–5.32(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.38–4.24(m,2h),3.97–3.88(m,1h),2.16–2.11(m,1h),1.48(s,9h),1.39-1.30(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.78；lcms-esi+(m/z):736.4[m+1]+。
步骤2.ii-03b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体ii-03’b(70.6mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物ii-03b，54.7mg，收率89.6％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.1hz,1h),7.45-7.38(m,2h),7.32-7.22(m,3h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.49–5.35(m,1h),5.02-4.93，(m,1h)，4.53-4.48(m,2h),4.39–4.35(m,1h),3.96–3.88(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.44-1.36(m,6h),1.16(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.33；lcms-esi+(m/z):636.3(m+h)+.
实施例23
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-七氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(ii-03c)
步骤1.ii-03’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入ii-01c(80.4mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体ii-03’c，68.5mg，收率62％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.63(d,j＝8.1hz,1h),7.42–7.33(m,2h),7.27-7.26(m,2h),7.23-7.18(m,1h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.75(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.36(m,1h),4.95–4.92(m,1h),4.53-4.50(m,1h),4.39–4.26(m,2h),3.98–3.88(m,1h),2.19–2.13(m,1h),1.46(s,9h),1.39-1.31(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.91；lcms-esi+(m/z):736.4[m+1]+。
步骤2.ii-03c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体ii-03’c(65.5mg,89μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物ii-03c，48.2mg，收率85％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.43-7.38(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.43–5.38(m,1h),5.00-4.94，(m,1h)，4.53-4.46(m,2h),4.39–4.35(m,1h),3.95–3.88(m,1h),2.46–2.37(m,1h),1.40-1.33(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.95；lcms-esi+(m/z):636.2(m+h)+.
实施例24
((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸l六氘代异丙酯(iii-01b)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂22(735mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物iii-01b(311mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),7.42–7.32(m,3h),7.26-7.20(m,2h),7.17-7.13(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.58(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.96(m,1h),4.52-4.46(m,2h),4.41–4.32(m,1h),4.25(brs,1h),4.18–4.09(m,1h),3.93–3.79(m,2h),1.38-1.27(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):536.2(m+h)+.
实施例25
((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸六氘代异丙酯(iii-01c)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂23(735mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物iii-01c(303mg),收率56.6％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.68(s,1h),7.41–7.33(m,3h),7.25-7.20(m,2h),7.18-7.13(m,1h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.55(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.95(m,1h),4.52-4.45(m,2h),4.41–4.31(m,1h),4.29(brs,1h),4.16–4.06(m,1h),3.96–3.79(m,2h),1.39-1.31(m,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.52；lcms-esi+(m/z):536.3(m+h)+.
实施例26
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-六氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(iii-03b)
步骤1.iii-03’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入iii-01b(80.3mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体iii-03’b，73.6mg，收率66.8％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.61(d,j＝8.1hz,1h),7.43–7.37(m,2h),7.25-7.22(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.75(d,j＝8.1hz,1h),5.42–5.32(m,1h),4.99–4.92(m,1h),4.58-4.51(m,1h),4.39–4.23(m,2h),4.19–4.09(m,1h),3.98–3.89(m,1h),2.17–2.10(m,1h),1.46(s,9h),1.38-1.30(m,6h),1.25(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.75；lcms-esi+(m/z):735.4[m+1]+。
步骤2.iii-03b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体iii-03’b(70.5mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物iii-03b，51.6mg，收率84.6％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.53(d,j＝8.1hz,1h),7.46-7.38(m,2h),7.34-7.20(m,3h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.75(d,j＝8.1hz,1h),5.47–5.34(m,1h),5.01-4.92，(m,1h)，4.54-4.49(m,2h),4.37–4.33(m,1h),4.11–4.06(m,1h),3.97–3.86(m,1h),2.42–2.31(m,1h),1.45-1.38(m,6h),1.20(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.28；lcms-esi+(m/z):635.3(m+h)+.
实施例27
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-六氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(iii-03c)
步骤1.iii-03’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入iii-01c(80.3mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体iii-03’c，66.3mg，收率60％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.65(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.32(m,2h),7.26-7.24(m,2h),7.23-7.17(m,1h),6.15(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.36(m,1h),4.95–4.91(m,1h),4.54-4.48(m,1h),4.39–4.28(m,2h),4.15–4.08(m,1h),3.98–3.86(m,1h),2.18–2.12(m,1h),1.45(s,9h),1.38-1.31(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.88；lcms-esi+(m/z):735.4[m+1]+。
步骤2.iii-03c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体iii-03’c(65.4mg,89μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物iii-03c，46.2mg，收率82％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.32-7.20(m,3h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.65(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.37(m,1h),5.02-4.95，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.17–4.09(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.47–2.35(m,1h),1.41-1.33(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.1hz,3h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.92；lcms-esi+(m/z):635.2(m+h)+.
实施例28
((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸单氘代异丙酯(iv-01b)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂24(727mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物iv-01b(350mg),收率66％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.98(s,1h),7.43–7.35(m,3h),7.28-7.22(m,2h),7.19-7.15(m,1h),6.21(d,j＝19.0hz,1h),5.55(d,j＝8.1hz,1h),5.06–4.96(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.43–4.36(m,1h),4.30(brs,1h),3.98–3.78(m,2h),1.42-1.28(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.
实施例29
((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸单氘代异丙酯(iv-01c)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂25(727mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物iv-01c(308mg),收率58％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.71(s,1h),7.40–7.34(m,3h),7.25-7.22(m,2h),7.20-7.14(m,1h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.52(d,j＝8.1hz,1h),5.03–4.93(m,1h),4.50-4.42(m,2h),4.40–4.31(m,1h),4.29(brs,1h),3.94–3.78(m,2h),1.41-1.27(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.55；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.
实施例30
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-单氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(iv-03b)
步骤1.iv-03’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入iv-01b(79.6mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体iv-03’b，74mg，收率67.6％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.89(d,j＝8.1hz,1h),7.41–7.34(m,2h),7.28-7.22(m,2h),7.20-7.15(m,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.78(d,j＝8.1hz,1h),5.40–5.31(m,1h),4.97–4.91(m,1h),4.58-4.51(m,1h),4.37–4.24(m,2h),3.95–3.87(m,1h),2.15–2.10(m,1h),1.49(s,9h),1.40-1.23(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.77；lcms-esi+(m/z):730.4[m+1]+。
步骤2.iv-03b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体iv-03’b(70mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物iv-03b，51.7mg，收率85％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.44-7.37(m,2h),7.31-7.22(m,3h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.75(d,j＝8.0hz,1h),5.47–5.34(m,1h),5.02-4.92，(m,1h)，4.55-4.48(m,2h),4.37–4.35(m,1h),3.96–3.89(m,1h),2.46–2.34(m,1h),1.44-1.20(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.
实施例31
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-单氘代异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(iv-03c)
步骤1.iv-03’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入iv-01c(79.6mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体iv-03’c，71.8mg，收率65.7％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.1hz,1h),7.40–7.32(m,2h),7.26-7.23(m,2h),7.21-7.16(m,1h),6.10(d,j＝19.2hz,1h),5.74(d,j＝8.0hz,1h),5.44–5.36(m,1h),4.94–4.90(m,1h),4.55-4.51(m,1h),4.39–4.24(m,2h),3.98–3.86(m,1h),2.19–2.12(m,1h),1.47(s,9h),1.39-1.19(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.97；lcms-esi+(m/z):730.4[m+1]+。
步骤2.iv-03c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体iv-03’c(70mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物iv-03c，49.5mg，收率82％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.61(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.35(m,2h),7.30-7.22(m,3h),6.14(d,j＝19.2hz,1h),5.66(d,j＝8.0hz,1h),5.41–5.35(m,1h),5.00-4.95，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.39–4.34(m,1h),3.96–3.88(m,1h),2.48–2.37(m,1h),1.40-1.20(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.93；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.
实施例32
((r)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(五氘代苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(x-01b)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂30(733mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物x-01b(302mg),收率56％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.79(s,1h),7.42(d,j＝8.0hz,1h),6.19(d,j＝19.2hz,1h),5.57(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.95(m,1h),4.52-4.46(m,2h),4.40–4.33(m,1h),4.29(brs,1h),4.15–4.07(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.39-1.21(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.69；lcms-esi+(m/z):535.2(m+h)+.
实施例33
((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(五氘代苯氧基)磷酰基)-d-丙氨酸异丙酯(x-01c)
向10ml反应管中加入核苷7(260.2mg,1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁格氏试剂(3.0ml的1mthf溶液，3.0mmol)，反应混合物在o℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂31(733mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升温,搅拌1天。加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释。分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x3oml)、盐水(3oml)洗涤，并经na2so4干燥。减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物x-01c(301mg),收率55％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),7.38(d,j＝8.1hz,1h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.1hz,1h),5.02–4.93(m,1h),4.50-4.45(m,2h),4.40–4.31(m,1h),4.25(brs,1h),4.19–4.09(m,1h),3.90–3.78(m,2h),1.37-1.19(m,12h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.58；lcms-esi+(m/z):535.2(m+h)+.
实施例34
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((r)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(五氘代苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(x-03b)
步骤1.x-03’b的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入x-01b(80.2mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体x-03’b，72mg，收率65.4％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.69(d,j＝8.2hz,1h),6.19(d,j＝19.0hz,1h),5.76(d,j＝8.2hz,1h),5.40–5.33(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.55-4.50(m,1h),4.38–4.25(m,2h),4.13-4.06(m,1h),3.93–3.87(m,1h),2.17–2.11(m,1h),1.47(s,9h),1.40–0.99(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.76；lcms-esi+(m/z):734.4[m+1]+。
步骤2.x-03b的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体x-03’b(70.4mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物x-03b，55.3mg，收率91％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.1hz,1h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.54(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.94，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.93–3.85(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.43-1.11(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.32；lcms-esi+(m/z):634.3(m+h)+.
实施例35
(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((((s)-(((r)-1-异丙基-1-氧丙-2-基)氨基)(五氘代苯氧基)磷酰基)氧)甲基)-4-甲基四氢呋喃-3-基l-缬氨酸酯(x-03c)
步骤1.x-03’c的合成
在反应管中将boc-val-oh,9(49mg,225μmol)用0.5ml1，4-二氧六环溶解，降温至-5℃，搅拌下加入dcc(46.5mg,225μmol)，室温下反应30min，继续降温至-5℃，然后依次加入x-01c(80.2mg,0.15mmol)的0.5ml1，4-二氧六环溶液，三乙胺(24μl,0.18mmol)，催化量4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温反应过夜，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到固体中间体x-03’c，72.7mg，收率66％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.66(d,j＝8.1hz,1h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.0hz,1h),5.45–5.36(m,1h),4.99–4.93(m,1h),4.52-4.49(m,1h),4.39–4.25(m,2h),4.09-4.03(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.19–2.11(m,1h),1.43(s,9h),1.39-0.98(m,18h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ2.91；lcms-esi+(m/z):734.5[m+1]+。
步骤2.x-03c的合成
在反应管中加入4mhcl的1，4-二氧六环(2ml)，降温至0℃，搅拌下加入中间体x-03’c(70.4mg,96μmol)，室温下反应1小时，反应结束倒入10ml水中，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并的有机层用水、饱和nahco3、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用硅胶柱层析分离得到产物x-03c，51.7mg，收率85％。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(d,j＝8.0hz,1h),6.10(d,j＝19.0hz,1h),5.68(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.36(m,1h),5.00-4.92，(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.39–4.33(m,1h),4.18–4.12(m,1h),3.95–3.86(m,1h),2.45–2.35(m,1h),1.41-1.14(m,18h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ2.95；lcms-esi+(m/z):634.2(m+h)+.
实施例36
类似的方法合成了化合物i-31b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.57(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.38(m,2h),7.30-7.21(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.54-4.45(m,2h),4.38–4.34(m,1h),4.15–4.11(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):629.3(m+h)+.
实施例37
类似的方法合成了化合物ii-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.42-7.36(m,2h),7.30-7.20(m,3h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.46–5.34(m,1h),4.53-4.45(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.92–3.84(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.29；lcms-esi+(m/z):636.3(m+h)+.
实施例38
类似的方法合成了化合物iii-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.40-7.35(m,2h),7.31-7.22(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.1hz,1h),5.44–5.35(m,1h),4.93(s,1h),4.53-4.44(m,2h),4.37–4.33(m,1h),4.15–4.12(m,1h),3.95–3.84(m,1h),2.44–2.36(m,1h),1.42-1.35(m,6h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.25；lcms-esi+(m/z):635.2(m+h)+.
实施例39
类似的方法合成了化合物iv-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝8.0hz,1h),7.42-7.38(m,2h),7.32-7.21(m,3h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.38(m,1h),4.54-4.43(m,2h),4.39–4.34(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.90–3.84(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.26(s,6h),1.09(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.18；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.
实施例40
类似的方法合成了化合物v-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.60(s,1h),7.44-7.38(m,2h),7.32-7.21(m,3h),6.15(d,j＝19.0hz,1h),5.45–5.34(m,1h),5.05-4.96，(m,1h)，4.56-4.43(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.13–4.10(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.43-1.34(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.29；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.
实施例41
类似的方法合成了化合物vi-13b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.45-7.39(m,2h),7.32-7.22(m,3h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.47–5.36(m,1h),5.03-4.97，(m,1h)，4.57-4.46(m,2h),4.39–4.34(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.44-1.35(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):631.4(m+h)+.
实施例42
类似的方法合成了化合物x-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.54(d,j＝8.1hz,1h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),5.50–5.39(m,1h),5.04-4.95，(m,1h)，4.55-4.47(m,2h),4.38–4.35(m,1h),4.16–4.12(m,1h),3.93–3.82(m,1h),2.44–2.35(m,1h),1.45-1.34(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.31；lcms-esi+(m/z):634.2(m+h)+.
实施例43
类似的方法合成了化合物xi-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.79(s,1h),7.38–7.30(m,3h),7.25-7.18(m,2h),6.18(d,j＝19.0hz,1h),5.56(d,j＝8.0hz,1h),5.06–4.95(m,1h),4.51-4.45(m,2h),4.42–4.36(m,1h),4.25(brs,1h),4.13–4.09(m,1h),3.94–3.78(m,2h),1.36-1.28(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.63；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.
实施例44
类似的方法合成了化合物xi-03b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.57(d,j＝8.1hz,1h),7.43-7.37(m,2h),7.29-7.22(m,2h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.70(d,j＝8.1hz,1h),5.48–5.36(m,1h),5.05-4.95，(m,1h)，4.54-4.47(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.93–3.84(m,1h),2.46–2.37(m,1h),1.43-1.33(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.20；lcms-esi+(m/z):630.4(m+h)+.
实施例45
类似的方法合成了化合物xi-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.1hz,1h),7.44-7.38(m,2h),7.31-7.20(m,2h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.0hz,1h),5.48–5.37(m,1h),5.02-4.95，(m,1h)，4.53-4.45(m,2h),4.38–4.33(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.85(m,1h),2.43–2.36(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.2hz,3h),1.08(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.27；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.
实施例46
类似的方法合成了化合物xii-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),7.34–7.30(m,2h),7.25-7.18(m,2h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.94(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.41–4.35(m,1h),4.25(brs,1h),4.15–4.09(m,1h),3.93–3.83(m,2h),1.37-1.26(m,6h),1.20(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.59；lcms-esi+(m/z):531.3(m+h)+.
实施例47
类似的方法合成了化合物xii-03b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.45-7.22(m,4h),6.13(d,j＝19.0hz,1h),5.71(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.58-4.49(m,2h),4.39–4.35(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.42–2.35(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.33；lcms-esi+(m/z):630.4(m+h)+.
实施例48
类似的方法合成了化合物xii-04b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.43-7.22(m,4h),6.17(d,j＝19.2hz,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.47–5.39(m,1h),5.02-4.95(m,1h)，4.52-4.45(m,2h),4.15–4.11(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.43–2.35(m,1h),1.42(d,j＝19.0hz,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.10(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.32；lcms-esi+(m/z):601.3(m+h)+.
实施例49
类似的方法合成了化合物xii-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.45-7.23(m,4h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.73(d,j＝8.2hz,1h),5.51–5.42(m,1h),5.09-4.98，(m,1h)，4.55-4.45(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.17–4.12(m,1h),3.92–3.83(m,1h),2.44–2.37(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.21(d,j＝6.0hz,3h),1.11(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.19；lcms-esi+(m/z):630.3(m+h)+.
实施例50
类似的方法合成了化合物xii-06c：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.75(s,1h),7.34–7.30(m,2h),7.24-7.17(m,2h),6.12(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.0hz,1h),5.03–4.94(m,1h),4.52-4.47(m,2h),4.40–4.35(m,1h),4.27(brs,1h),4.15–4.09(m,1h),3.93–3.83(m,2h),1.34-1.26(m,6h),1.20(d,j＝6.0hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.53；lcms-esi+(m/z):531.2(m+h)+.
实施例51
类似的方法合成了化合物xii-07c：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.58(d,j＝8.0hz,1h),7.48-7.21(m,4h),6.14(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.95，(m,1h)，4.58-4.49(m,2h),4.39–4.35(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.92–3.86(m,1h),2.42–2.35(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.2hz,3h),1.12(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.38；lcms-esi+(m/z):630.1(m+h)+.
实施例52
类似的方法合成了化合物xii-08c：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.51(d,j＝8.0hz,1h),7.45-7.20(m,4h),6.13(d,j＝19.2hz,1h),5.71(d,j＝8.2hz,1h),5.51–5.41(m,1h),5.09-4.98，(m,1h)，4.55-4.43(m,2h),4.38–4.32(m,1h),4.17–4.13(m,1h),3.92–3.82(m,1h),2.41–2.36(m,1h),1.43-1.35(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h),1.13(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.22；lcms-esi+(m/z):630.2(m+h)+.
实施例53
类似的方法合成了化合物xiii-01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.77(s,1h),7.39(d,j＝8.0hz,1h),7.30(s,2h),6.16(d,j＝19.0hz,1h),5.59(d,j＝8.1hz,1h),5.05–4.97(m,1h),4.50-4.44(m,2h),4.41–4.36(m,1h),4.23(brs,1h),4.12–4.08(m,1h),3.95–3.78(m,2h),1.37-1.29(m,6h),1.22(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cdcl3)δ3.61；lcms-esi+(m/z):533.3(m+h)+.
实施例54
类似的方法合成了化合物xiii-05b：1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.59(d,j＝8.1hz,1h),7.29(s,2h),6.11(d,j＝19.0hz,1h),5.74(d,j＝8.2hz,1h),5.48–5.35(m,1h),5.03-4.97，(m,1h)，4.52-4.43(m,2h),4.36–4.32(m,1h),4.15–4.10(m,1h),3.91–3.85(m,1h),2.45–2.37(m,1h),1.43-1.36(m,6h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.22(d,j＝6.0hz,3h),1.08(d,j＝6.2hz,6h)；31pnmr(162mhz,cd3od)δ3.35；lcms-esi+(m/z):632.4(m+h)+.
实施例55化合物盐酸盐的制备
索菲布韦在碱性或酸性条件下都无法成盐，在中性的水中溶解度很差。而本发明中，3’-位用氨基酸酯保护的化合物可以与酸成盐，能增加其在水中的溶解度，在制剂上提供便利。
化合物盐酸盐的制备：将3’-位用氨基酸酯保护的化合物(i-02b、i-02c、i-05b、i-05c、i25b、i-25c、i-29b、i-29c、i-31b、ii-03b、ii-03c、ii-13b、iii-03b、iii-03c、iii-13b、iv-03b、iv-03c、iv-13b、v-13b、vi-13b、x-03b、x-03c、xi-03b、xi-05b、xii-03b、xii-05b、xii-07c、xii-08c、xiii-05b)用乙酸乙酯溶解，在0℃下滴加1mhcl的乙酸乙酯溶液，搅拌10min，加入环己烷，析出沉淀，沉淀用环己烷洗涤三遍，减压除去溶剂，干燥得盐酸盐产品。
生物学评价
1.本发明的化合物在hcv复制子(hcvpp)系统中的抗病毒活性检测
hcv复制子测定程序
一般程序:使带有hcv基因型1b复制子和萤光素酶报道基因的huh-7来源的细胞系(zluc)在补充10％胎牛血清、2mmglutamax、1％mem非必需氨基酸、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.5mg/ml
对于细胞毒性评价，将zluc细胞用上述化合物处理，采用celltiter-blue细胞存活力测定法(promega)，将20μl测定溶液加入各孔中，来监测细胞存活力。然后将板在37℃/5％co2下孵育至少3小时。分别用560和590nm的激发和发射波长，在victor3v1420多标记记数器(perkinelmer)中检测板的荧光,应用microsoftexcel和xlfit4.1软件求出cc50值。
根据上述复制子测定法测定下表提供的化合物。
*索菲布韦是依照参考文献j.org.chem.2011,76,8311制备
2.实施例化合物体内pk试验数据
hcvns5b是一种rna聚合酶，负责hcv病毒复制，复制所用底物为三磷酸核苷。本发明的实施例化合物为磷酰胺酯核苷酸类似物前药，在肝细胞内代谢生成活性成分三磷酸核苷类似物，从而抑制ns5b的活性和hcv病毒的复制。作为一个前药，体内生成三磷酸尿苷类似物的能力与对ns5b的抑制活性直接相关联，因此发明人做了体内pk试验以检测本发明化合物生成活性药三磷酸尿苷类似物的能力,体内pk试验模型为cd-1小鼠体内肝脏pk分析。
实施例化合物在小鼠肝脏内代谢生成活性成分2’-甲基-2’-氟代尿苷三磷酸的药物代谢动力学试验是用cd-1小鼠进行的。给药为单次灌胃给药，给药剂量为10毫克/5毫升/千克。索菲布韦的制剂处方为20％peg200和0.5％羧甲基纤维素钠；实施例化合物的制剂处方为30％peg200和0.5％羧甲基纤维素钠。肝脏样品的取样点为给药后1、2、4、6、12、24小时。取样时，小鼠先用co2处死，通过肝门静脉用冰冷的生理盐水冲洗肝脏，切成大约0.2克的小块肝脏样品，在液氮中速冻，并在-80℃中保存。
通过lc-ms/ms分析肝脏样品中的活性物种核苷三磷酸。内标准(is)采用美国trilinkbiotechnologies公司(2’r)-2’-脱氧-2’-甲基-2’-氟尿苷三磷酸，以正离子模式的串联质谱法在美国ab公司的api5500型液质联用仪上对待测样品进行检测及定量,测得小鼠肝脏活性药(2’r)-2’-脱氧-2’-甲基-2’-氟尿苷三磷酸的暴露量(2’-deoxy-2’-me-2’-f-utpauc)。
由实施例中制备的差向异构体的测试结果表可得知，实施例化合物中rp构型的化合物在肝细胞中的生成2’-deoxy-2’-me-2’-f-utp的浓度远远优于sp构型的异构体，也远远超过同样剂量的索菲布韦在肝脏中的浓度。所有实施例中制备的化合物(d-丙氨酸磷酸酯前药)其体外活性高于索菲布韦(l-丙氨酸磷酸酯前药)，其体内活性更显著的优越于索菲布韦，显示出极高的临床应用价值。
对照两对化合物xii-06c和xii-04b以及x-06c和x-04b，可以看到d-氨基酸酯构成的核苷氨基磷酸酯相较于对应的l-氨基酸酯构成的核苷氨基磷酸酯具有5倍以上的三核苷酸输送能力，说明本发明的d-氨基酸酯构成的核苷氨基磷酸酯比天然氨基酸酯的前药更佳的肝靶向成药性。
以上实验结果表明，本发明的化合物具有高效的抑制hcv病毒的能力，与阳性对照药索菲布韦相比，体外和体内的活性评价都下显示出显著的优越性，本发明的化合物在测试的浓度范围内没有表现出细胞毒性，安全性好，对于治疗hcv感染具有极好的前景。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下对本发明进行各种修改和改变均在本发明的保护范围。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。