检测黄曲霉毒素的核酸适配体、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素的核酸适配体、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

黄曲霉毒素，英文名称为aflatoxin，是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的二氢呋喃香豆素的衍生物，是一种常见的真菌毒素，具有致畸、致突变、致癌作用、被世界卫生组织划定为i类致癌物。黄曲霉毒素可污染玉米、谷物、花生等粮食、饲料和食品。人和动物食用黄曲霉毒素污染的食品后，黄曲霉毒素会进入生物体内，对健康造成巨大威胁。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素b2(afb2)、黄曲霉毒素g1(afg1)和黄曲霉毒素g2(afg2)，其中黄曲霉毒素b1污染广泛，毒性强。afm1和afm2分别是黄曲霉毒素b1和黄曲霉毒素b2的羟基化代谢产物，在乳及乳制品的污染中常见。快速、高灵敏度的检测在食品安全和环境健康方面具有重要的意义。常用的一些检测黄曲霉毒素的分析方法主要包括薄层色谱分析、液相色谱-荧光分析、液相色谱-质谱分析、免疫分析等方法。液相色谱法往往需要昂贵的仪器，操作步骤繁琐费时，运行维护成本高。免疫分析法则需要利用可识别黄曲霉毒素的免疫抗体作为亲和配体，选择性识别黄曲霉毒素分子，但是免疫抗体的制备成本高，制备的抗体不同批次间重现性较差，而且免疫抗体热稳定性差，货架周期短，容易失活。免疫分析法往往需要制备黄曲霉毒素与蛋白质或酶分子的偶联物等，增加了检测成本，检测实验往往需要多个步骤，操作复杂且费时。

因此，本领域亟需研究开发快速简便且具有高灵敏度的检测黄曲霉毒素分子的方法和产品，这将具有重要的理论意义和广泛的实际应用前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供一种检测黄曲霉毒素的核酸适配体、试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。

为实现上述目的，本发明提供一种检测黄曲霉毒素的核酸适配体，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的任一t碱基经tmr(tetramethylrhodamine，四甲基罗丹明)或fam(fluorescein，荧光素)标记得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的任一t碱基经tmr、fam或texasred(德克萨斯红)标记得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素的试剂盒，其包括上述的核酸适配体。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素的方法，其是将上述核酸适配体与待测样本混合后温育，测定荧光强度值、荧光各向异性值或荧光偏振值。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明利用荧光染料(四甲基罗丹明、荧光素或texasred)标记的dna核酸适配体实现荧光分析黄曲霉毒素。本发明利用核酸适配体与目标分子结合后引起构象变化，进而影响标记的荧光染料的荧光特性如荧光强度和荧光各向异性(荧光偏振)，从而实现对黄曲霉毒素的灵敏检测。本发明的产品及方法在应用时具有快速便捷、操作简单以及检测灵敏度高等优势，利用荧光染料的核酸适配体可以实现对afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2的检测。

附图说明

图1显示实施例1中采用tmr标记的核酸适配体a50-t26-tmr基于荧光各向异性检测不同浓度的黄曲霉毒素b1(afb1)的结果，其中，横坐标显示黄曲霉毒素b1的浓度，纵坐标显示荧光各向异性值r。

图2显示实施例2中采用tmr标记的核酸适配体a50-t26-tmr基于荧光强度变化检测不同浓度的黄曲霉毒素b1(afb1)的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后探针的荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图3显示实施例3中采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1(afb1)的结果。

图4显示实施例4中采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr基于荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1(afb1)的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后探针的荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图5显示实施例5中采用fam标记的核酸适配体a34-t24-fam基于荧光各向异性分析检测黄曲霉毒素b1(afb1)的结果，结果显示荧光各向异性值r与afb1浓度的关系。

图6显示实施例6中采用fam标记的核酸适配体a34-t24-fam基于荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后探针的荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图7显示实施例7中采用texasred荧光染料标记的核酸适配体a34-t29-txr基于荧光各向异性变化检测黄曲霉毒素b1的结果。

图8显示实施例8中采用tmr标记的核酸适配体a26-t20-tmr基于荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后探针的荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图9显示实施例9中采用tmr标记的核酸适配体a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1的结果。

图10显示实施例10中采用tmr标记的核酸适配体a28-t21-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1的结果。

图11显示实施例11中tmr标记的核酸适配体a28-t21-tmr基于荧光强度随afb1浓度变化的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后的探针荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图12显示实施例12中采用tmr标记的核酸适配体a30-t22-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1的结果。

图13显示实施例13中采用tmr标记的核酸适配体a32-t23-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1的结果。

图14显示实施例14中采用tmr标记的核酸适配体a32-t23-tmr基于荧光强度检测afb1的结果，其中，i0为样品中无afb1时的荧光强度值，i为afb1加入后探针的荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图15显示实施例15中采用a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b2(afb2)的结果。

图16显示实施例16中采用a34-t24-tmr根据荧光强度变化检测黄曲霉毒素b2(afb2)的结果，其中，i0为样品中无afb2时的荧光强度值，i为afb2加入后的探针荧光强度，i/i0为荧光强度的比值。

图17显示实施例17中采用a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测afm1或afm2的结果。

图18显示实施例18中采用a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测afg1或afg2的结果。

图19显示实施例19中采用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afb2的结果。

图20显示实施例20中采用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afm1或afm2的结果。

图21显示实施例21中采用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afg1或afg1的结果。

图22显示对比例1中采用a50-t26-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1方法的选择性考察结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

核酸适配体是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的可高亲和力高选择性识别目标分子的单链核酸分子。核酸适配体的出现为检测黄曲霉毒素提供了新的研究手段。作为核酸类的亲和配体，核酸适配体在分析检测领域的应用具有很多优点，如合成制备方便，热稳定性高，易于引入功能团如荧光染料标记等。核酸适配体在亲和力和选择性方面都可以和免疫抗体相媲美，核酸适配体的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗体的在稳定性和制备等方面的一些局限，显示出潜力，核酸适配体的应用也受到广泛的关注，在分析传感领域显示出很大的潜力和应用前景。

本申请的发明人基于本领域的现状，经过大量的实验探究和反复的实践验证，终于得到了可与黄曲霉毒素结合同时可产生荧光信号变化的荧光染料标记的核酸适配体，所述核酸适配体可以与黄曲霉毒素选择性作用，具有很强的亲和力，利用所述核酸适配体可以发展检测黄曲霉毒素的检测方法。

本发明的原理是：利用荧光染料(四甲基罗丹明、荧光素或texasred)标记核酸适配体对黄曲霉毒素进行荧光分析检测，通过荧光染料标记的核酸适配体与目标分子结合后引起荧光强度或荧光各向异性(荧光偏振)的变化来实现对目标分子的检测分析。

本发明提供的检测黄曲霉毒素的核酸适配体，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的任一t碱基经tmr(tetramethylrhodamine，四甲基罗丹明)或fam(fluorescein，荧光素)标记得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的任一t碱基经tmr、fam或texasred(德克萨斯红)标记得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的任一t碱基经tmr标记得到的分子。

优选地，本发明提供的检测黄曲霉毒素的核酸适配体，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的第26位上的t碱基经tmr或fam标记得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的第24位上的t碱基经tmr或fam标记得到的分子，或者序列如seqidno.2所示核酸分子的第29位上的t碱基经texasred标记得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的第23位上的t碱基经tmr标记得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的第22位上的t碱基经tmr标记得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的第21位上的t碱基经tmr标记得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的第20位上的t碱基经tmr标记得到的分子。

其中，以上序列中其他的t碱基上标记相应荧光染料的核酸适配体也会对目标分子产生信号响应，上述优选的标记位点是能产生较大和更为灵敏的荧光信号变化的标记位点。

本发明提供的检测黄曲霉毒素的试剂盒，其包括上述的核酸适配体。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括afb1、afb2、afg1、afg2、afm1和afm2中的一种或多种。

优选地，所述试剂盒还包括ph为ph为6～10的缓冲液，更优选地，所述缓冲液是ph为7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes缓冲液；或者是ph为7.5，包括20mmmgcl2和0.1％tween20的pbs磷酸盐缓冲溶液；或者是ph为7.5，包括10mmtris-hcl、20mmmgcl2和0.1％tween20的tris-hcl缓冲液。本发明最优选ph为7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes缓冲液。

本发明提供的检测黄曲霉毒素的方法，其是将上述核酸适配体与待测样本混合后温育，测定荧光强度值、荧光各向异性值或荧光偏振值。

其中，优选地，所述核酸适配体的使用浓度为25nm。

优选地，所述待测样本进行预处理，即将待测样本采用ph为6～10的缓冲液进行稀释。

优选地，所述温育的温度为20～30℃，更优选地，所述温育的温度为25℃。

优选地，所述温育在ph为6～10的缓冲液中进行，更优选地，所述缓冲液是ph为7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes缓冲液；或者是ph为7.5，包括20mmmgcl2和0.1％tween20的pbs磷酸盐缓冲溶液；或者是ph为7.5，包括10mmtris-hcl、20mmmgcl2和0.1％tween20的tris-hcl缓冲液。本发明最优选ph为7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes缓冲液。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

下面列举一些具体实施例，以对本发明的实施和技术效果作更进一步的说明。

下述具体实施例中，当采用tmr标记的核酸适配体时，检测所用的激发波长为555nm，发射波长为580nm，狭峰宽度均为5nm。当采用fam标记的核酸适配体时，检测所用的激发波长为493nm，发射波长为520nm，狭峰宽度均为5nm。当采用texasred标记的核酸适配体时，检测所用的激发波长为594nm，发射波长为609nm，狭峰宽度均为5nm。核酸适配体探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化。

实施例1：采用tmr标记的核酸适配体a50-t26-tmr根据荧光各向异性值的变化检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.1所示核酸分子(简称为a50)的第26位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccaca-3’，其中第26位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a50-t26-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a50-t26-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a50-t26-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)浓度的增加，a50-t26-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图1所示。

实施例2：采用tmr标记的核酸适配体a50-t26-tmr根据荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a50-t26-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a50-t26-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)浓度的增加，a50-t26-tmr的荧光强度逐渐升高，检测限为2nm，结果请参见图2所示。

实施例3：采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr根据荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.2所示核酸分子(简称为a34)的第24位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第24位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a34-t24-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为1nm，结果请参见图3所示。

实施例4：采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr基于荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光强度逐渐升高，检测限为1nm，结果请参见图4所示。

实施例5：采用fam标记的核酸适配体a34-t24-fam荧光各向异性分析检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.2所示核酸分子的第24位上的t碱基经fam标记得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第24位碱基t上标记fam荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a34-t24-fam。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-fam(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-fam的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a34-t24-fam的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图5所示。

实施例6：采用fam标记的核酸适配体a34-t24-fam根据荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-fam(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-fam的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a34-t24-fam的荧光强度逐渐升高，检测限为2nm，结果请参见图6所示。

实施例7：采用txr标记的核酸适配体a34-t29-txr根据荧光各向异性变化检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.2所示核酸分子的第29位上的t碱基经txr标记得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第29位碱基t上标记txr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a34-t29-txr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t29-txr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a34-t29-txr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a34-t29-txr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为4nm，结果请参见图7所示。

实施例8：采用tmr标记的核酸适配体a26-t20-tmr根据荧光强度变化检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.6所示核酸分子(简称为a26)的第20位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-cacgtgttgtctctctgtgtctcgtg-3’，其中第20位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a26-t20-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a26-t20-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a26-t20-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a26-t20-tmr的荧光强度逐渐升高，检测限为2nm，结果请参见图8所示。

实施例9：采用tmr标记的核酸适配体a26-t20-tmr根据荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a26-t20-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a26-t20-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a26-t20-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图9所示。

实施例10：采用tmr标记的核酸适配体a28-t21-tmr根据荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.5所示核酸分子(简称为a28)的第21位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-gcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgc-3’，其中第21位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a28-t21-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a28-t21-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a28-t21-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a28-t21-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为1nm，结果请参见图10所示。

实施例11：采用tmr标记的核酸适配体a28-t21-tmr基于荧光强度变化检测afb1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a28-t21-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a28-t21-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a28-t21-tmr的荧光强度逐渐升高，检测限为1nm，结果请参见图11所示。

实施例12：采用tmr标记的核酸适配体a30-t22-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.4所示核酸分子(简称为a30)的第22位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-ggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3’，其中第22位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a30-t22-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a30-t22-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a30-t22-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a30-t22-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图12所示。

实施例13：采用tmr标记的核酸适配体a32-t23-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1

本实施例的核酸适配体为序列如seqidno.3所示核酸分子(简称为a32)的第23位上的t碱基经tmr标记得到的分子，即5'-gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc-3’，其中第23位碱基t上标记tmr荧光染料，用下划线标出，荧光染料标记的核酸适配体简称为a32-t23-tmr。

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a32-t23-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a32-t23-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a32-t23-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图13所示。

实施例14：采用tmr标记的核酸适配体a32-t23-tmr基于荧光强度检测afb1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a32-t23-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b1混合，在25℃下温育，然后测定a32-t23-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b1(afb1)的浓度的增加，a32-t23-tmr的荧光强度逐渐增加，检测限为2nm，结果请参见图14所示。

实施例15：采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测黄曲霉毒素b2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b2混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光各向异性。随着黄曲霉毒素b2(afb2)的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图15所示。

实施例16：采用tmr标记的核酸适配体a34-t24-tmr基于荧光强度检测afb2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b2混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光强度。随着黄曲霉毒素b2(afb2)的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光强度逐渐增加，结果请参见图16所示。

实施例17：利用a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测afm1或afm2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素m1(afm1)或黄曲霉毒素m2(afm2)混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光各向异性。随afm1或afm2的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为4nm，结果请参见图17所示。

实施例18：利用a34-t24-tmr基于荧光各向异性检测afg1或afg2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a34-t24-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素g1(afg1)或黄曲霉毒素g2(afg2)混合，在25℃下温育，然后测定a34-t24-tmr的荧光各向异性。随afg1或afg2的浓度的增加，a34-t24-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为16nm，结果请参见图18所示。

实施例19：利用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afb2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a26-t20-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素b2(afb2)混合，在25℃下温育，然后测定a26-t20-tmr的荧光各向异性。随afb2的浓度的增加，a26-t20-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为2nm，结果请参见图19所示。

实施例20：利用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afm1或afm2

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a26-t20-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素m1(afm1)或黄曲霉毒素m2(afm2)混合，在25℃下温育，然后测定a26-t20-tmr的荧光各向异性。随着afm1或afm2的浓度的增加，a26-t20-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为4nm，结果请参见图20所示。

实施例21：利用a26-t20-tmr基于荧光各向异性检测afg1或afg1

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a26-t20-tmr(浓度为25nm)与不同浓度的黄曲霉毒素g1(afg1)或黄曲霉毒素g2(afg2)混合，在25℃下温育，然后测定a26-t20-tmr的荧光各向异性。随着afg1或afg2的浓度的增加，a26-t20-tmr的荧光各向异性值r逐渐降低，检测限为16nm，结果请参见图21所示。

对比例1利用a50-t26-tmr根据荧光各向异性检测黄曲霉毒素b1方法的选择性考察

在缓冲溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中将a50-t26-tmr(浓度为25nm)与待测样品混合，在25℃下温育，然后测定a50-t26-tmr的荧光各向异性，结果如图22所示，其中，荧光各向异性值变化δr由测得的荧光各向异性值减去空白样品对应的荧光各向异性值得到。

其中，a为空白样品组，b是赭曲霉毒素a组，c是赭曲霉毒素b组，d是伏马毒素b1组，e是伏马毒素b2组，e是玉米赤霉烯酮(f)组，从图22中可见a～e组中a50-t26-tmr的荧光各向异性无明显变化，而黄曲霉毒素b1组(g组)中，荧光各向异性明显下降。

上述实施例和对比例的结果说明，本发明检测所用的核酸适配体和检测方法对目标分子的响应特异性强，检测精度高，检测限低。

综上所述，本发明提供的荧光染料标记的核酸适配体用于荧光强度变化或荧光各向异性变化检测afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2，包括四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，简称tmr)标记的核酸适配体、荧光素(fluorescein,简称fam)标记的核酸适配体、texasred标记的核酸适配体，荧光染料tmr、fam或texasred被标记到核酸适配体的特定的t碱基位置上。本发明利用荧光染料标记的核酸适配体可以实现对黄曲霉毒素(afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2)的直接检测。本发明充分利用了核酸适配体在筛选、制备、稳定性和易引入荧光染料标记等优点，同时结合荧光各向异性(荧光偏振)和荧光强度分析技术具有的操作简单、灵敏、无需分离等优点，使得本发明整个操作步骤简单，检测快速，只需要将待测物与荧光标记的探针混合温育，利用荧光分析检测就可以实现对黄曲霉毒素的检测。本发明的检测方法具有高灵敏度，可以实现对nm水平黄曲霉毒素b1或黄曲霉毒素b2的检测，采用最灵敏的荧光染料标记的核酸适配体探针，最低检测限可以达到1nm；检测afm1或afm2的检测限达到4nm；而检测afg1或afg2的检测限可达到16nm。本发明的检测方法样品用量少，荧光标记的适配体具有很好的稳定性，货架稳定性高。

需要指出的是，荧光偏振和荧光各向异性的基本原理是相同的，只是计算公式会略有不同。本发明相应实施例中的荧光各向异性值数据都有对应的荧光偏振值，因此也均能够通过计算其荧光偏振值来实现对目标待测物浓度的检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国科学院生态环境研究中心

<120>检测黄曲霉毒素的核酸适配体、试剂盒及其检测方法

<130>ib177055

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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