AntiAFPCAR‑T细胞及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种antiafpcar-t细胞及其制备方法和应用，属于基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域。

背景技术：

原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma，简称：hcc)居恶性肿瘤发病率的第五位,全球每年死亡人数约100万。目前，大部分原发性肝癌患者缺乏有效的治疗手段,总的生存率仅为3％-5％。肝移植虽已成为治疗原发性肝癌的重要手段，但供体短缺、手术损伤、免疫排斥以及费用高昂等问题构成了肝脏器官移植技术发展的主要障碍。因此，有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着分子生物学、基因工程技术及免疫学的飞速发展，以免疫治疗为基础的生物治疗已显示出良好的应用前景。

嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell，简称：car-tcell)是通过基因修饰的手段，使能特异性识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变区(singlechainfvdomain，简称：scfv)表达在细胞表面，同时通过跨膜区与人工设计的细胞胞内的活化增殖信号域相耦连。表达car的t细胞可通过scfv直接识别并结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，car将信号传入t细胞内，激活t细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、inf-γ、tnf-α等，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。因此，car-t细胞是主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，简称：mhc)非限制性的，其应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中无表达或者低表达。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，简称：afp)是胎儿时期肝脏内合成的一种糖蛋白,成人后血清中水平很低,发生恶变的肝细胞则又可恢复其合成的能力，其在70％-80％的原发性肝癌(hcc)中有较高的表达水平。研究证实将表达mafp基因的小鼠肝癌细胞株hepa1-6接种c57bl/6j小鼠，再用插入afp基因的质粒dna免疫小鼠，结果发现这种治疗性的免疫afp质粒dna能诱发较强的特异性ctl免疫反应。还有研究应用afp来源的免疫优势多肽疫苗治疗iv期hcc患者，6例患者中5例显示afp多肽在体内具有免疫原性,能在血清afp水平较高的患者中刺激抗原特异性t细胞。因此，afp作为肝癌细胞的特异性抗原,可作为car-t细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。

技术实现要素：

本发明提供一种antiafpcar-t细胞及其制备方法和应用，该细胞经过t细胞修饰和改造得到，并且能够特异性识别和杀伤afp高表达的肝癌细胞，适用于相应肿瘤疾病的预防和治疗。

本发明提供一种antiafpcar-t细胞，所述antiafpcar-t细胞在t细胞内表达scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述scfv用于结合所述afp蛋白，并且所述scfv的氨基酸序列为第一序列，所述第一序列为：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslaasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpakvsgspgqkitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgaksgntasltisglqaedeadyycssyttgsrsvfgggtkltvlg

该antiafpcar-t细胞以afp为靶点，具体地，所述antiafpcar-t细胞的嵌合抗原受体car包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为scfv，所述铰链区为igd，所述胞内信号传导区为cd28–ox40–cd3ζ。图1为本发明的antiafpcar的设计示意图，请参考图1。

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述igd的氨基酸序列为第二序列。

具体地，第二序列为：

tftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlprslwnagtsvtctlahpslppqrlmalrepaaqapvklstnllassdppeaa

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述cd28的氨基酸序列为第三序列。

具体地，第三序列为：

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsallhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述ox40的氨基酸序列为第四序列，所述cd3ζ的氨基酸序列为第五序列。

具体地，第四序列为：

rrdqrlppdshkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki

具体地，第五序列为：

rvkfsrsaeppayqqgqnqlynelnlgrseeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，

所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列为第六序列。

具体地，第六序列为：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslkasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpasvsgspgqsitisctgtsskvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyykssyttgsravfgggtkltvlgtftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlpralwnagtsvtctlnhpslppqrlmalrepaaqapvklslnllassdppeaafwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsaeppakqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

进一步地，所述antiafpcar-t细胞通过慢病毒感染t淋巴细胞获得，所述慢病毒通过携带有所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的慢病毒表达载体感染293t细胞得到。

本发明还提供一种上述任一所述的antiafpcar-t细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)构建慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体具有所述

scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；

2)利用慢病毒包装质粒和所述慢病毒表达载体感染293t细胞，获得慢病毒，所述慢病毒被所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包装；

3)分离t淋巴细胞，并用所述慢病毒感染所述t淋巴细胞，获得所述antiafpcar-t细胞，所述antiafpcar-t细胞的t细胞内表达所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白。

在步骤1)中，通过基因工程手段，将scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上，从而完成对慢病毒表达载体的构建。在步骤2)中，利用步骤1)所得的慢病毒表达载体对293t细胞感染，获得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包装的慢病毒。在步骤3)中，将步骤

2)中的慢病毒表达于人外周血中分离收集的t淋巴细胞以获得car-t细胞。

进一步地，在所述步骤1)之前，还包括合成和扩增所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因。具体合成和扩增方法可按照本领域常规技术手段获得。

进一步地，还包括对所述慢病毒进行纯化，并用所述纯化后的慢病毒感染所述t淋巴细胞。一般的，该纯化手段可以使用本领域常规手段进行，例如过滤、超滤等。

本发明还提供了上述任一所述的antiafpcar-t细胞在制备治疗肝癌药物中的应用，尤其能够用于afp分子高表达的肝癌的治疗。

本发明方案具有以下优点：

1、本发明的antiafpcar-t细胞将afp抗体用于car-t细胞的构建，能够对afp蛋白进行有效结合。

2、本发明提供的antiafpcar-t细胞制备方法能简单、有效的制备具有特异性识别和杀伤肿瘤的antiafpcar-t细胞。

3、本发明的antiafpcar-t细胞具有高效的肿瘤杀伤活性，能够用于制备治疗肝癌的药物中，尤其能够以afp分子为靶抗原，用于afp分子高表达的肝癌的治疗。

附图说明

图1为本发明的antiafpcar的设计示意图；

图2为本发明实施例的antiafpcar-t细胞以及未感染的t细胞对靶细胞hepg-2(肝癌)的杀伤效果示意图；

图3为本发明实施例的antiafpcar-t细胞以及未感染的t细胞对靶细胞hep3b(肝癌)的杀伤效果示意图；

图4为本发明实施例的antiafpcar-t细胞、对照例以及空白例对治疗肝癌(hepg-2)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明antiafpcar-t细胞的制备

1、构建慢病毒表达载体

通过常规的基因工程手段，合成scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列，将scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列克隆到慢病毒表达载体上，获得scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ慢病毒表达载体pgreenpuro-car。其中，scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的各序列如前所述。

2、慢病毒包装

1)用质量分数为10wt％胎牛血清(fetalbovineserum,简称：fbs)的1640培养基培养293t细胞；

2)将293t细胞以3x10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；

用不含血清的1640培养基换液，备用；

3)取两个ep管，分别在两个ep管中加入1ml1640，将慢病毒载体pgreenpuro-car与pmdlgprre、prsv-rev和pmd2.g质粒按照摩尔比1：1：1：1于其中一个ep管中混匀；在另一个ep管中加入150ullipo2000，混匀放置5min；将混有lipo2000的1640加入含有质粒的ep管中，混匀得混合液，室温放置20min，然后将混合液逐滴加入上述2)中制备的细胞培养皿中，继续培养4h后，用含10％fbs的1640培养基更换培养液，继续培养48h后收集细胞上清液，获得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包装的慢病毒。

3、慢病毒纯化

将2中获得的被包装的慢病毒用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，以3000g/min的速度离心45min；将剩余的上层病毒浓缩液转移至ep管，放-80℃保存备用。

4、cd8+t细胞的分离

1)全血倒入50ml离心管，室温离心20分钟，控制离心力ref为700g(普通离心)；

2)取上述离心下部细胞成分，加杜氏磷酸盐缓冲液dpbs至50ml；

3)分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液,将离心管室温离心15分钟，控制离心力ref为800g；

5)取白膜层细胞，加入dpbs，补足至50ml；

6)离心10分钟，控制离心力ref为600g，弃上清液，得外周血单个细胞(peripheralbloodmononuclearcell，简称：pbmc)；

7)采用cd8+t细胞磁珠分选试剂盒分选cd8+t细胞。

5、慢病毒载体感染t淋巴细胞

用质量分数为10wt％fbs的rpmi1640完全培养基培养cd8+t细胞，第一天加入抗cd3单克隆抗体活化；第三天加入150moi的3中纯化后的慢病毒(antiafpcar)，16h后将培养基更换为含有50iu/ml重组人il-2的rpmi1640完全培养基，继续培养10-20天，得到antiafpcar-t细胞。

实施例2

对实施例1制备的antiafpcar-t细胞体外抗肿瘤效果进行评价，包括以下步骤：

以稳定表达afp的肝癌细胞系hepg-2和hep3b作为靶细胞，分别用慢病毒载体pgreenpuro-car感染的t细胞(即，实施例1制得antiafpcar-t细胞)和未感染的t细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度1x10⁵个/ml接种96孔板，每孔100μl，按照5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5％co2,37℃培养箱培养4h，采用wst-1检测细胞活力，计算杀伤效率。

图2为本发明实施例的antiafpcar-t细胞以及未感染的t细胞对靶细胞hepg-2(肝癌)的杀伤效果示意图；图3为本发明实施例的antiafpcar-t细胞以及未感染的t细胞对靶细胞hep3b(肝癌)的杀伤效果示意图。

图2和图3结果表明，表达afpcar的t淋巴细胞对afp阳性肝癌细胞具有很强的杀伤作用。

实施例3

对实施例1制备的antiafpcar-t细胞体内抗肿瘤效果进行评价，包括以下步骤：

取6周龄雌裸鼠15只，右腋下皮下注射5x10⁶hepg-2(肝癌)细胞，待肿瘤长到60mm³大小，肿瘤模型随机分成3组：对照组、antiafpcar-t细胞组、t细胞组；对照组尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周2次；antiafpcar-t细胞组尾静脉注射antiafpcar-t细胞1×10⁷个/次，每周2次；t细胞组尾静脉注射t细胞1×10⁷个/次，每周2次；统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线。图4为本发明实施例的antiafpcar-t细胞、对照例以及空白例对治疗肝癌(hepg-2)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意图。

图4结果表明，antiafpcar-t细胞相对于未感染的t细胞以及空白例可延迟afp高表达的肝癌移植瘤小鼠模型的生存期。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。