一种三角褐指藻双功能酶及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及代谢工程领域，特别涉及一个三角褐指藻双功能酶(蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶)及其应用。

背景技术：

随着全球经济一体化的不断发展，世界能源形势日趋紧张，大量使用石油燃料使得能源危机和环境问题日益突出，寻找一种可持续发展的新能源，成为各国关注的问题。生物柴油作为绿色可持续发展的新能源，受到越来越多的关注。我国工业化生物柴油目前主要还是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实以及动物油脂、废餐饮油等为原料制备。原料虽然多样，但来源是非常有限的，就算把它们加起来也难以满足人类对燃油的需求，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫。而微藻因易于培养、具有单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。

微藻生物柴油生产的一大难题是藻种的选育。微藻种类繁多，不同藻种的脂质含量和组成差异巨大，要从这些微藻中筛选出藻油含量高并适合当地环境培养的藻种，是非常繁杂的工作。在众多育种方式中，利用基因工程手段进行分子定向育种，较诱变育种及生理调控方式具有高效、直接、可稳定遗传等特点。

三角褐指藻是硅藻门、羽文藻纲、褐指藻属的一种单细胞浮游藻种，脂质含量达细胞干重的20-30％，是微藻生物柴油开发的优良藻种。但是其脂质含量距离生产工艺开发尚有距离，选育油脂含量更高的藻种是首要条件。

三角褐指藻的基因组序列已经公布，目前已经发现油脂合成途径的多个关键酶基因，可用作基因工程的靶点；同时三角褐指藻的基因工程研究起步较早，已经建立了稳定高效的遗传转化体系。在此基础上，利用基因工程的技术手段，对三角褐指藻油脂合成途径的关键酶基因进行操作，选育油脂含量提高的优良藻株，是一种直接、高效且简便可行的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种三角褐指藻的双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种三角褐指藻双功能酶，三角褐指藻双功能酶为蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶，其氨基酸残基如序列表中seqidno:1所示；

或，与序列表seqidno:1所示氨基酸具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的序列。

所述编码蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因序列的碱基序列如seqidno:2所示。

三角褐指藻的双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶，命名为ptws/dgat，来源于硅藻门、褐指藻属的三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)，氨基酸序列如seqidno:1所示，是由504个氨基酸残基组成的蛋白质。

编码本发明的三角褐指藻双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶基因如序列表中seqidno:2的dna序列，由1515个碱基组成，不含内含子结构。

一种三角褐指藻双功能酶，所述三角褐指藻双功能酶在选育微藻突变株中的应用；

或，所述三角褐指藻双功能酶在生物柴油生产中的应用。

具体是将三角褐指藻双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶基因导入油脂缺陷型酵母及细菌中表达，鉴定该酶的功能：将该基因插入酵母表达载体pyes2中，利用热激法导入油脂缺陷型酵母h1246中，h1246-ptws/dgat酵母突变株恢复合成油脂的能力，其总脂含量提高3倍，油脂含量提高4.3倍；将该基因插入细菌表达载体pet28a中，导入大肠杆菌bl21(de3)中表达，大肠杆菌突变株bl21-ptws/dgat较bl21脂质含量增加2.6倍，油脂含量增加3.5倍。

一种三角褐指藻突变株，突变株于2017年5月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，编号为cgmccno.13870，分类名称为三角褐指藻，拉丁名为phaeodactylumtricornutum。

一种三角褐指藻突变株的构建方法，将克隆蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因导入三角褐指藻细胞中过表达，而后经筛选，并进行继代培养，进而获得保藏编号为cgmccno.13870的三角褐指藻突变株。

所述过表达后的三角褐指藻细胞在含有30μg/ml除草剂草丁膦和100μg/ml卡那霉素的f/2固体平板上进行连续5代以上筛选。

所述三角褐指藻突变株具体的筛选过程：

1)从三角褐指藻中提取总rna，并反转录为cdna，以此为模版，克隆蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因，并将其导入三角褐指藻中过表达；

2)将步骤1)中转化的三角褐指藻，经过除草剂草丁膦和抗生素卡那霉素共同筛选，存活下来的藻体进行继代培养；

3)将步骤2)中存活下来的藻体，进行pcr检测和southern杂交检测，以及基因表达绝对定量检测；

4)将步骤3)中检测均表现为阳性的藻株在f/2培养液中扩大培养，收集藻体并冻干后提取总脂，并用薄层层析法分离总脂的油脂成分，继而用气相色谱法检测总脂及油脂的脂肪酸组成；

5)取步骤4)中总脂含量提高1.3倍以上，油脂含量提高2.1倍的突变株株，即富含油脂的突变株。

经转化处理后的三角褐指藻，在含有30μg/ml除草剂草丁膦和100μg/ml卡那霉素的f/2固体平板上进行连续5代以上筛选。

该油脂含量提高的突变株于2017年5月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，编号为cgmccno.13870。分类名称为三角褐指藻，拉丁名为phaeodactylumtricornutum.

所述的三角褐指藻突变株(phaeodactylumtricornutum)，具有典型的硅藻门，硅藻纲，褐指藻属的特征性结构，硅壳特征与野生型三角褐指藻一致。在无菌f/2培养液中能快速生长，温度20-25℃，光照4000-6000lux，营养细胞呈卵形，梭形，和三出放射形，以卵形为主，颜色呈黄褐色。

所述的三角褐指藻突变株生理生化特征如下：

1.在无菌的海水培养液f/2中能够快速生长，培养温度为20-23℃，光照强度4000-6000lux，光暗比为12h/12h。初始接种量为od730＝0.10，5天后进入对数生长期，13天后进入稳定期，od730＝0.50，细胞浓度可达5×10⁶细胞/ml。细胞以分裂生殖为主，最适ph范围：7.5-8.5，对数生长期其三出放射形占比例月50％。

2.在氮缺乏的f/2培养基中培养14天，其脂质含量提高2.1倍，油脂含量提高3.6倍，。

3.在缺氮培养过程中，其光合作用速率下降，至缺氮培养第6天，光合作用速率下降至正常培养阶段的1/3。细胞的色素组成不变，但色素总量呈下降趋势。

一种三角褐指藻突变株的应用，所述三角褐指藻突变株在生物柴油生产中的应用。

一种获得高产量油脂的方法，将序列表中seqidno:2所示的三角褐指藻蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶基因导入微藻细胞中过表达，即可获得大量的油脂。

本发明所具有的优点：

本发明从三角褐指藻中分离鉴定了一个双功能酶，具有蜡脂合成酶和二酯酰甘油酰基转移酶的保守区，属于dgat同工酶类型中的ws/dgat类型，基因结构具有原核性的特点，能够在细菌、酵母和藻类中表达并发挥功能，提高宿主细胞的油脂含量。在三角褐指藻中过表达该酶，获得了油脂含量提高的突变株，能够稳定遗传，可应用于生物柴油生产工艺。

本发明综合利用生物信息学、分子生物学和基因工程手段，筛选油脂合成的关键基因并进行验证，继而利用该基因过表达获得富含油脂、形状优良的三角褐指藻突变株。与其他的选育方法相比，本方法避免了物理、化学诱变的盲目性及对环境的影响，减少了大量的无用工作量，具有定向性和高效率的特点。

附图说明

图1为本发明实施例提供的三角褐指藻内源表达载体结构图。

图2为本发明实施例提供的酿酒酵母总脂的tlc分析图；其中，1道为油脂标准品，2道为h1246-pyes2总脂，3道为h1246-ptws/dgat，4道为野生酿酒酵母。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

实施例-1

三角褐指藻ptws/dgat基因的克隆

以假微型海链藻dgat基因序列为出发序列，通过ncbi数据库blast搜索，发现三角褐指藻中有一个酶(xp_002184474.1)具有部分重合的两个保守功能区，即蜡酯合成酶和二脂酰甘油酰基转移酶功能区。根据编码该酶的基因序列(如seqidno:2，不含内含子结构)设计引物如下：

pri-forward1:5’-atggatgtctttggcagc-3’

pri-reverse1:5’-aagtacgactgtaaatt-3’

无菌条件下以海水培养液f/2培养三角褐指藻至对数生长期，温度23℃，光照4000-6000lux，光暗比为12h/12h。取500ml藻液离心，4℃9000rpm离心5min。迅速将藻体投入液氮中冷冻，1h后转入-80℃冰箱保存

取冷冻藻体0.2-0.5g，液氮研磨，利用sds法提取基因组dna。以上述引物pri-forward和pri-reverse克隆seqidno:2基因，pcr反应体系25μl，反应程序：94℃10min预变性，之后扩增反应循环35个，循环程序为94℃1min，56℃30sec，72℃45sec，而后72℃延伸10min，15℃降温保存15min。所得pcr产物用1％的琼脂糖凝胶纯化回收，克隆到测序载体pmd-18t载体中，经测序分析正确后用于后续实验。

三角褐指藻蜡酯合成酶和二脂酰甘油酰基转移酶(ptws/dgat)的氨基酸序列如seqidno:1所示，含有504个氨基酸；其编码基因序列如seqidno:2所示，不含内含子机构，共1515个碱基。

实施例2

三角褐指藻ptws/dgat在酿酒酵母中的表达

以实施例1中测序正确的、含有ptws/dgat的pmd-18t质粒为模板，以引物pri-forward2:5’-aagcttaggatggatgtctttggc-3’

和pri-reverse2:5’-ggatccttagaagtacgactgtaa-3’

克隆ptws/dgat基因，在其5’端分别加入酶切位点hindiii和bamhi。通过双酶切和连接反应，将ptws/dgat插入到载体pyes2中，命名为pyes2-ptws/dgat。

预先配置酵母培养和筛选培养基三种：a.常规培养基ypd培养基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，高压灭菌；b.筛选培养基sc-ura培养基：0.67％酵母培养基氮源(yeastnitrogenbase(ynb))，2％葡萄糖，0.074％dosupplement(-ura)，低压灭菌；c.诱导培养基：0.67％yeastnitrogenbase(ynb)，2％半乳糖，1％棉子糖，0.074％dosupplement(-ura)，低压灭菌；

将h1246酵母菌种单克隆，接种于10mlypd培养基中，30℃，250rpm，过夜；测定od600，转接于50mlypd培养基中，使初始od600＝0.4，细胞密度约为5×10⁶；继续培养2-4h，使od600＝1.3-1.5，细胞个数约为2×10⁷；用大离心管，2,500rpm，离心5min，收集菌体，悬浮于40mlte；2,500rpm，离心5min，去上清，重悬液于2ml1×liac/0.5te中；室温静置10min，鲑鱼精dna沸煮5min，快速冰置冷却；依次加入1μg质粒pyes2-ptws/dgat(pyes2载体为invitrogen公司商用质粒；ptws/dgat两端分别加上hindiii和bamhi酶切位点，将pyes2和ptws/dgat基因分别进行hindiii和bamhi双酶切反应，回收产物后再用t4连接酶进行连接，获得质粒pyes2-ptws/dgat)，100μg预变性鲑鱼精dna，100μl酵母悬液，700μl1×liac/40％pe3350/1×te，剧烈振荡约1min，随后30℃温育30min；继而加入88μldmso，42℃，7min(或更长20-25min)；2,500rpm，离心5min，去上清，重悬液于200μl1×te中，将菌体涂布于选择性平板sc-ura；将平板放30℃培养2-3天，直到长出转化子。

挑取转化子到sc-ura液体培养基中，30℃振荡过夜培养；测od600，转接于50ml诱导培养基中，初始od600＝0.4；30℃培养，当酵母的密度达到5×10⁶细胞/ml时，改为20℃继续培养3-5天，8000rpm离心5min收集菌体，并迅速冷冻于液氮中，1h后转移至-80℃保存。

一部分菌体用于rna提取，利用液氮研磨法破碎细胞，随后利用酵母rna专用试剂盒提取rna，反转录为cdna后，利用pcr法检测ptws/dgat基因是否表达。

一部分菌体用于提取总脂：冷冻干燥48h后，用分析天平称取干粉0.2g，放于50ml的离心管中，向离心管中加入1ml4mol/l的盐酸溶液，振荡混匀，室温放置1h后，沸水浴10min，-20℃迅速冷却30min。

向上述溶液中加入7ml甲醇-氯仿混合溶液(二者体积比为2∶1)，充分混匀，6000rpm，4℃，离心15min，取上清液于一支洁净干燥的离心管中；再向沉淀中加入3ml甲醇-氯仿混合溶液(体积比为2∶1)，充分混匀，6000rpm，4℃，离心15min，取上清液于同一支离心管中；再向沉淀中加入3ml甲醇-氯仿混合溶液(体积比为2∶1)，重复上述操作。

将以上操作所得的上清液转移至分液漏斗中，加入2.5ml氯仿，3ml1％的nacl溶液，混匀，静置5min,回收下层液相；再加入2ml氯仿继续萃取，回收下层液相；重复操作一次。合并下层液相并转移至蒸馏瓶中进行旋蒸，得总脂样品。

将部分总脂样品和甘油三脂标准品分别溶于正己烷，用于薄层层析分离中性脂。将薄层板放入烘箱中30min,使其活化，冷却后放置备用。在距薄层板底部2cm处用铅笔轻轻划出一条平行于玻璃板底边的细线。在线上等距离划三个点，用毛细管蘸取三角褐指藻总脂样品、tag、标准品棕榈酸棕榈脂，在薄层板三个点上点样，每个点4-6次。每点一次用吸耳球吹干后再点下一次。

往层析缸中加入展开剂(正己烷-乙醚-乙酸(70ml:30ml:1mlv:v:v)，10min后层析缸中展开剂饱和。吹干样点，一端斜放于层析缸中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到薄层板上端2/3处时，取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。

将薄层板吹干后，放入盛有碘的试剂瓶中。几分钟后，用镊子取出薄层板，观察显色情况，将中性脂条带用铅笔标出，刮板分离。

上述总脂及中性脂，加入10ml混合比例为1:2:0.8(v/v)的氯仿、甲醇和蒸馏水溶剂，匀浆，加入c19:0内标40μg，40khz超声处理5min，5000g离心5min，收集上清。沉淀部分重复上述操作，共提取3次，合并上清，加入等体积混合比1:1的氯仿和蒸馏水溶液，使其终浓度(体积比)为氯仿:甲醇:蒸馏水＝1:1:0.9。加入1ml5％氯化钠混匀，静置。上层为水相，含盐类和水溶性物质，下层为氯仿层，氯仿层转至旋转蒸发仪，旋转干燥，获得总脂肪酸。

在上述脂肪酸测样中，加入1ml1.5％(w/v)naoh/ch3oh溶液，55℃水浴保温15min再加入2ml5％(v/v)hcl/ch3oh溶液，继续55℃水浴保温20min。取2ml正己烷，加入上述反应体系混匀，静置分层，吸出上层正己烷相，再向下层水相中加入2ml正己烷，重复上述步骤，合并3次吸出液，于旋转蒸发器内蒸干，1ml正己烷定容，待分析。

气相色谱检测：进样口温度220℃，检测器温度250℃，载气为高纯氦气(99.999％)，柱流速1.0ml/min，进样时间1min，溶剂延迟3min，柱起始温度60℃，保持2min，以15℃/min升温至120℃，然后以2.5℃/min升温至220℃，保持15min。采用分流进样模式，分流比50:1，进样量1μl。ms条件：电子轰击(ei)离子源，电子能量70ev离子源温度230℃，接口温度220℃，选取全程离子碎片扫描(scan)模式，质量扫描范围为45-450m/z。

分析结果显示，h1246突变株h1246-ptws/dgat的总脂含量较h1246提高了3倍，其中油脂含量可达总脂的40％以上(参见图2和表1)。

表1酿酒酵母h1246突变株h1246-ptws/dgat脂肪酸组成成分及含量

实施例3

三角褐指藻ptws/dgat在大肠杆菌中的表达

以实施例一中测序正确的、含有ptws/dgat的pmd-18t质粒为模板，以引物pri-forward3:5’-catatgatggatgtctttggc-3’

和pri-reverse3:5’-ctcgagttagaagtacgactgtaa-3’

克隆ptws/dgat基因，在其5’端和3’端加入酶切位点ndei和xhoi。通过双酶切和连接反应，将ptws/dgat插入到载体pet28a中，命名为pet28a-ptws/dgat。

利用42℃热激法，将pet28a-ptws/dgat导入大肠杆菌bl21(de3)中。经卡那霉素筛选，获得抗性突变株，命名为bl21-ptws/dgat。

预先准备所用抗生素及诱导剂。将260mg卡那霉素溶解于5.2ml无菌水中，过0.22μm滤膜除菌(已高压灭菌)分装于ep管(已高压灭菌)中，配成50mg/ml的母液，-20℃保存。将1giptg(分子量238.30)用无菌水定容至8.39ml，过0.22μm的滤膜除菌(已高压灭菌)分装于ep管(已高压灭菌)中，配成0.5m的工作液，-20℃保存。

将枪头、移液枪、培养基等物品放入超净工作台，紫外灭菌30min。点燃酒精灯，在酒精灯附近向培养基中加入相应抗生素(1ml培养基加入1μl抗生素)工作浓度50μg/ml，摇匀。在酒精灯附近将甘油种接种于试管中，5ml培养基中接种0.1ml菌液(50:1)，摇匀。37℃转速170r/min摇床培养6-8h。将活化后的菌液接种于锥型瓶中(再以5％的接种量)，37℃培养6-8h或者过夜。加入iptg(1ml培养基加入1μliptg，1:1)，在28℃下进行诱导表达24h-48h。

离心收集菌体，并迅速冷冻于液氮中，1h后转移至-80℃保存。一部分菌体用于rna提取，反转录为cdna后，利用pcr法检测ptws/dgat基因是否表达。一部分用于提取总脂及油脂，并进行脂肪酸组成测定。具体实验流程见实施例二。结果显示，大肠杆菌突变株bl21-ptws/dgat较bl21脂质含量增加2.6倍，油脂含量增加3.5倍。

实施例4：三角褐指藻中过表达ptws/dgat构建富含油脂的突变株

以实施例1中测序正确的、含有ptws/dgat的pmd-18t质粒为模板，以引物pri-forward4:5’-cccaagcttatggatgtctttggc-3’

和pri-reverse4:5’-ccggaattcttagaagtacgactgtaaatt-3’克隆ptws/dgat基因，在其5’端和3’端加入酶切位点ndei和xhoi。以hindiii和ecori双酶切pmd-18t-pt1和三角褐指藻内源表达载体，30℃温育2h。然后通过连接酶将片段连接到表达载体上，连接反应16℃，时间为12h。将连接后载体导入大肠杆菌中，37℃培养15h，提取质粒并富集至100ng/μl。

取50μl金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5μl质粒(质粒浓度≥1μgμl^-1)，50μl2.5mcacl2，20μl0.1m亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5-6sec，弃上清。然后用250μl无水乙醇洗两次，最后用60μl无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5-6次轰击。在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。轰击后,藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到f/2培养液中继续培养40h，使细胞生长状态得以恢复。

经过恢复培养后的三角褐指藻，以10⁶细胞/平板的比例涂布于筛选平板上。筛选平板为f/2固体平板，含有30μg/ml除草剂草丁膦和100μg/ml卡那霉素。培养温度为20-23℃，光照4000-6000lux，光暗比12h/12h。待长出藻斑后，挑取藻斑继续划线于新的筛选平板。经过5代筛选，获得抗性单藻株。

抗性藻株的分子鉴定：在无筛选压力的f/2培养液中扩大培养至对数生长期，提取基因组进行pcr克隆，引物为：

5’-atggatgtctttggcagc-3’和5’-aagtacgactgtaaatt-3’。pcr阳性继续进行southern杂交实验，需要基因dna>1μg，以hindiii和bamhi酶切处理30min；合成探针的引物为5’-ctcgactttgctcttctg-3’和

5’-gcgagtctgccgtcgttcta-3’，杂交探针长度为149bp。对southern杂交为阳性的单藻株，提取rna并反转录为cdna，利用标准品曲线法进行荧光定量pcr，检测野生型和突变株藻细胞中内源基因的绝对含量，引物为5’-agctcccacaacaatcatc-3’和5’-cgtgaaagcaagcataggt-3’。

阳性的藻株在f/2培养液(无抗性筛选压力)中扩大培养至对数生长期后期，9000rpm，4℃离心5min，收集藻体，冷冻干燥48h获得干藻粉。提取总脂及分离油脂并进行脂肪酸测定，具体实验流程详见实施例2。

本实施例以三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)为原始藻株(参见图1)，利用基因工程技术，在藻细胞中过表达ptws/dgat，经过抗性筛选、分子鉴定及脂质成分分析，在100余株抗性突变株中发现了总脂含量提高1.3倍，油脂含量提高2.1倍的一株优良突变株(参见表2)，该菌株以于2017年5月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，编号为cgmccno.13870。分类名称为三角褐指藻，拉丁名为phaeodactylumtricornutum。

这株三角褐指藻脂质含量高，其生长速度和生理状态与出发藻株一致，是一个性状优良的突变株系，可应用生物柴油生产工艺。

表2三角褐指藻突变株的脂质含量和脂肪酸组成

seqno:1

mdvfgsklvealsvyhaswllglsvtvavaiaikmssnqksrsplhrkfsftsvgmaigifpesvkapttiinaaiyfstcpaekdlielavkpmlaftrlstipvpetancrpstrsfapselirkveisgkcikstndvifkhlqeslsterddlpwweflvvenvgegesavvlrmhhaladgislvhvfekfityedgspvlsiilsnmaqkskvekthktnpfrlawmlvrdatkvltlglsrsddptiftepnqtyvhsqhrecvvfptfslafvkrlktaanvtvndilmtavsqavheycraescsvlmgkgaslqsrallpialprsasdlehpstalrnkwclvsanmsigcvdlvdrlnsihqttvhlkgspiamvqlslqnklasrlpkivarqtmldifrrhslvfsnvpgpdrpcqlagqtatgvqmfysnlipqvgllsyagniygnivldtgavpnaeslaghyakalvdmatllnvdkiptnlqsyf

seqno:1：5’-3’

atggatgtctttggcagcaaattggttgaagcgctctccgtctatcatgcttcctggctgcttggtttaagcgtcacagtagcggtagcgatcgcaatcaaaatgtcctccaatcaaaaaagtcgctcgcctctgcaccgaaagttttctttcacatccgtcggaatggccatcggaatcttccccgaatcggtcaaagctcccacaacaatcatcaacgcggcaatctacttttcaacatgtcccgcggagaaggatctcattgaactggcggtaaaacctatgcttgctttcacgcgactgtcaacgattcctgtcccggaaacggccaactgccgaccttccacgcggtcttttgcgccatcggaactcattcggaaggttgaaatatcaggtaaatgcatcaagtcgacaaatgatgtcatatttaagcacctgcaagagtcgctctcgacagagcgagacgatttgccgtggtgggagtttctagtggtcgaaaacgttggcgagggcgagtctgccgtcgttctacggatgcaccacgccctagcggatggtatttcgctagtacacgtttttgaaaagttcataacctacgaagatggttcgccggttttgtccattattctgtccaacatggcgcagaagagcaaagtcgagaaaacgcacaaaacaaatcccttccgccttgcttggatgcttgtccgagatgctaccaaggtcctcacgttgggtctttcgcgttcggacgatcccactatctttaccgaaccgaatcagacgtatgtgcattcgcagcatcgagaatgtgtggttttcccaacgttttcattggccttcgttaagcggctgaaaacagcagccaacgtgaccgttaacgatattctcatgaccgcggtcagccaagcggtacacgagtactgccgagctgaatcctgctcggtcttgatgggaaaaggagcatcgcttcagtcacgtgcattattgccgatagcgttgccgcgatccgcgtcagacttggaacatccttccacggctttgcgcaacaagtggtgtcttgtttcggcaaatatgagcattggctgtgtcgacctagtggatcgtcttaattcgatccaccagactactgttcacttaaaaggaagcccaattgccatggtccaactcagtctgcaaaacaaattggcaagtcgattgcctaaaatagtcgctcgacaaaccatgctggacatttttcgaaggcattcgcttgtcttttccaacgttcccggcccagatcgtccgtgtcaattggccgggcaaacagccactggagtacaaatgttctatagcaacctgattcctcaagttggattgctgtcgtacgccgggaacatttacggtaatatagtcctagacactggtgccgtgcccaacgctgaatctttggctggccattacgcaaaggcgcttgtcgacatggcgaccctgctcaacgtcgacaaaattccaacgaatttacagtcgtacttctaa

sequencelisting

<110>中国科学院烟台海岸带研究所

<120>一种三角褐指藻双功能酶及其应用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>504

<212>prt

<213>三角褐指藻phaeodactylumtricornutum

<220>

<221>propep

<222>(1)..(504)

<223>

<400>1

metaspvalpheglyserlysleuvalglualaleuservaltyrhis

151015

alasertrpleuleuglyleuservalthrvalalavalalaileala

202530

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354045

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<213>三角褐指藻phaeodactylumtricornutum

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