一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液的制作方法

本发明涉及一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，用于贴壁细胞的消化，属于生物制药、生物治疗等相关领域。
背景技术：
：胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶，由动物胰腺分泌的胰蛋白酶原激活产生，能专一性的水解精氨酸和赖氨酸竣基端的肽键，被广泛应用于生物
技术领域：
和医疗领域。目前获取胰蛋白酶的途径主要有两种，传统的方式是从动物身上进行获取，通过宰杀牛、羊、猪等，从其胰脏提取出胰蛋白酶。另外，利用微生物发酵的方式来获取胰蛋白酶，因高效和专一性强而逐渐受到人们的青睐。随着生物制药的不断发展,胰蛋白酶成为一些生物制药的主要原辅材料。因其最终产品将被用于人体疾病治疗，其质量的好坏可能会直接影响人类的生命健康。由于胰蛋白酶来源于生物体，其成分复杂，供体容易受到病原体污染，一旦这种污染没有被彻底清除而被带入到胰酶的生产中，就可能会导致严重的后果。目前，酵母和大肠杆菌是合成胰蛋白酶常用的微生物宿主。重组胰蛋白酶是利用重组dna技术在重组大肠杆菌表达出的胰蛋白酶，无任何动物源性组分，且背景清楚，纯度较高，因而适用于无血清培养，可应用于抗体和药物的生产。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明提供了一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，本发明的目的在于对贴壁细胞无血清培养或者无动物源培养过程中进行消化操作，避免传统动物源胰蛋白酶的介入，以保证整个细胞培养过程没有动物源组分的参入。同时，本产品可在2～8℃环境中长期保存，随取随用，旨在为实验操作者带来更大的方便。本发明是通过以下技术方案实现的：一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：磷酸氢二钾50～70，氯化钾350～450，碳酸氢钠300～400，氯化钠7000～9000，七水磷酸氢二钠80～100，葡萄糖1000～2000，edta-4na200～500，基因重组胰酶1～60，余量为水。所述基因重组胰酶，购自kerry，产品名称：rtrypsin，产品货号：30624799.5gr。所述基因重组胰酶，由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致，酶切特异性相同；不含任何动物来源组分，没有传统天然胰酶中不可避免的糜蛋白酶等组分。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，对细胞的消化能力优于传统胰酶，一般细胞3分钟以内即可消化完全。细胞消化过程对细胞的损伤较少，消化完成后再接种，细胞活率高、生长状态良好。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，无需-20℃保存，在2～8℃中保存12个月以内使用效果不变。本发明的制备工艺全部采用在线清洗及在线灭菌设备，保证批间差的稳定，同时生产中采用惰性体氮气保护，避免不稳定性成分被氧化，该工艺生产的免疫细胞无血清培养基质量稳定，解决了大多数厂家生产质量不易控制的问题。附图说明图1：传统胰酶液相色谱图。图2：基因重组胰酶液相色谱图。图3：a549(肺癌)消化前。图4：a549(肺癌)消化后。图5：mk2(恒河猴肾细胞)消化前。图6：mk2(恒河猴肾细胞)消化后。图7：3t3(小鼠胚胎成纤维细胞)消化前。图8：3t3(小鼠胚胎成纤维细胞)消化后。图9：hepg2(肝癌细胞)消化前。图10：hepg2(肝癌细胞)消化后。图11：mdck(犬肾细胞)消化前。图12：mdck(犬肾细胞)消化后。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。本发明所用基因重组胰酶，购自kerry，产品名称：rtrypsin，产品货号：30624799.5gr。实施例1制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：磷酸氢二钾60，氯化钾400，碳酸氢钠350，氯化钠8000，七水磷酸氢二钠90，葡萄糖1500，edta-4na350，基因重组胰酶30，余量为水。制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。实施例2制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：磷酸氢二钾50，氯化钾450，碳酸氢钠300，氯化钠9000，七水磷酸氢二钠80，葡萄糖2000，edta-4na500，基因重组胰酶10，余量为水。制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。实施例3制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：磷酸氢二钾70，氯化钾350，碳酸氢钠400，氯化钠7000，七水磷酸氢二钠100，葡萄糖2000，edta-4na200，基因重组胰酶50，余量为水。制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。实验基因重组胰蛋白酶细胞消化液消化细胞采用本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液消化细胞，同时，以传统胰酶(传统胰酶，是指直接从猪体内提取得到的胰酶)作为对照。(1)稳定性对比：对比本发明所用的基因重组胰酶与传统胰酶的稳定性，如表1所示。表1(2)纯度对比：如图1、图2所示。由图1可见，传统胰酶杂质多(峰越多，杂质越多)，传统胰酶可见四种含量较高的成分，同时由于其中一种杂质含量较高，无法分开，出现降解，稳定性差。由图2可见，重组胰酶几乎无杂质，纯度高，峰型好，稳定性好，无降解峰。(3)使用方法对比：如表2所示。表2(4)消化时间对比：对比本发明的重组胰酶、传统胰酶，以及gibco(重组胰酶)(商品化产品，市场购买)对细胞的消化时间，如表2所示。表3细胞系名称本发明重组胰酶gibco(重组胰酶)传统胰酶a549(肺癌)3min5min3minmdck(犬肾细胞)10min15min13min3t3(小鼠胚胎成纤维细胞)2min3min3minhepg2(肝癌细胞)3min5min3minmk2(恒河猴肾细胞)1min2min2minmsc(间充质干细胞)1min2min1min由表3可见，本发明所用的重组胰酶，缩短了细胞消化时间，对所列细胞消化时间均有显著提高，大大缩短了工作的繁琐性；在缩短了细胞消化时间的同时，还可保证消化后的细胞活率仍大于90％以上。对比本发明的重组胰酶(不同用量)对细胞的消化时间，如表4所示。表4细胞系名称胰酶10mg/l胰酶30mg/l胰酶60mg/la549(肺癌)6min3min过度消化mdck(犬肾细胞)20min10min过度消化3t3(小鼠胚胎成纤维细胞)5min2min过度消化hepg2(肝癌细胞)7min3min过度消化mk2(恒河猴肾细胞)3min1min过度消化msc(间充质干细胞)3min1min过度消化由表4可见，不同配比的胰酶对细胞影响较大，经筛选30mg/l的使用量最优。(5)消化效果：采用本发明的重组胰酶消化细胞，对比消化前、后，如图3～12所示，由图可知，经重组胰酶处理后，细胞均可正常消化，胰酶活性明显。上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。当前第1页12