解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在桃褐腐病生防中的应用。

(二)

背景技术：

桃褐腐病又名菌核病、果腐病、实腐病，引起桃褐腐病的病原菌是半知菌亚门丛梗孢科果丛梗孢(moniliniafructicola)和仁果丛梗孢(moniliniafructigena)、灰丛梗孢菌(monilinialaxa)。此病是一种世界性分布的病害，可寄生在桃、杏、李、樱桃、梅等核果类果树上，引起果腐、花腐和叶枯。桃褐腐病在春季开花展叶期如遇低温多雨，可引起严重的花腐和叶枯；在生长后期如遇多雨潮湿天气，可引起果腐，使果实丧失经济价值。目前，生产中桃褐腐病的防治仍然以化学防治为主，但防效不甚理想，而且长期使用化学杀菌剂不但会导致病菌对其产生抗药性，而且果蔬产品上残留农药也会对公众健康造成威胁和环境污染。因此，寻找防治桃褐腐病的拮抗微生物具有重要意义。

目前，已经筛选到了一些有关解淀粉芽孢杆菌的的文献报道和专利。例如，申请号为201510789366.6公开了“一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病菌生防中的作用”，利用解淀粉芽孢杆菌d3制备菌剂，喷施于玉米叶片上使其定植，可抑制玉米大斑病菌。申请号201510462700.7公开了“一种解淀粉芽孢杆菌及其应用”，报道解淀粉芽孢杆菌xk-2对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等多种病原菌具有显著的拮抗作用。但现有的能够抑制桃褐腐的微生物种类较少且拮抗作用还不够理想，包括上述专利公开的生防菌，因此需要筛选定植能力和拮抗作用更强的生防菌，以使生物防治方法能够更好的满足农业生产中防治桃褐腐病的要求。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，该解淀粉芽孢杆菌对桃褐腐病菌的抑菌率达80.65％，大田防治效果高达86.5％，生防效果高出普通生防菌10％左右。另外，对小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌等多种病原菌具有显著的拮抗作用，适用范围广。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株-解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lm-y，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.13542，保藏日期为2017年1月6日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供一种所述解淀粉芽孢杆菌lm-y在制备植物病菌抗菌剂中的应用，所述植物病菌为桃褐腐病菌、小麦赤霉病菌或草莓灰霉病菌。

进一步，所述抗菌剂含有解淀粉芽孢杆菌lm-y经发酵培养获得的发酵液。

进一步，所述抗菌剂按如下方法制备：(1)将解淀粉芽孢杆菌lm-y接种于牛肉膏蛋白胨培养基，于30℃下培养24h，获得活化菌株；牛肉膏蛋白胨培养基组成：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，nacl3g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph7.2～7.4；

(2)将步骤(1)活化菌株接入lb液体培养基中，于30℃、180r/min振荡培养24h，获得种子液；所述lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏10g/l，溶剂为水，ph值7.0；

(3)将步骤(2)所得种子液按体积浓度5％接种量接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、180r/min振荡培养48h，获得发酵液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组成：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，nacl3g/l，溶剂为水，ph7.2～7.4。

进一步，所述抗菌剂中解淀粉芽孢杆菌lm-y菌体含量为1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)解淀粉芽孢杆菌lm-y是从桃树患病植株根际土壤分离得到，与常见的生防真菌相比不产生致敏孢子，对人、畜、果蔬安全，对环境友好。(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌lm-y对桃褐腐病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌等多种病原菌具有显著的拮抗作用，其中对桃褐腐病菌的抑菌率达80％以上，抑菌率高出现有生防菌10％左右，具有较大的研发潜力。(3)本发明的解淀粉芽孢杆菌lm-y菌剂对桃褐腐病有显著的防治效果，大田实验防治效果达78.5％，且生产工艺简单，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。

(四)附图说明

图1为菌株lm-y的扫描电镜照片；

图2为菌株lm-y的菌落形态图；

图3为菌株lm-y的16srdna片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为基于16srdna序列构建的菌株lm-y系统发育树；

图5为菌株lm-y对桃褐腐病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌生长的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

解淀粉芽孢杆菌lm-y的分离与鉴定，及其对草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、桃褐腐病病菌拮抗作用的测试。本实施例所述草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(fusariumheadblight)、桃褐腐病菌(moniliafructigena)由浙江大学农业与生物技术学院植物病理学研究室提供(常规公知，为各植物病理学实验室常规保存的常见病菌)。

1、分离：从浙江宁波奉化桃园中采集土壤，称取10g土样，加入90ml无菌水振荡2h形成悬独液，取1ml液体加入装有9ml无菌水试管中振荡形成10^-2稀释，10倍系列稀释至10^-6，从每个梯度稀释液吸取0.1ml于牛肉膏蛋白胨培养基上，用无菌玻璃涂棒将菌液在牛肉膏蛋白胨平板上涂抹均匀。涂抹好的平板置于30℃恒温箱培养48h，从平板中挑取单菌落反复进行平板划线分离培养，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，保存备用。

2、筛选：将灰霉病菌接种在pda平板中心，用接种针将上述分离纯化的单菌落呈三角状接入pda平板，距离中心约2cm，置于30℃恒温培养箱观察对峙培养抑菌情况。挑选具有抑菌作用的菌株划线分离纯化，分离出的菌株暂命名为菌株lm-y。所述pda培养基的配置方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水补足至1000ml，ph值自然，高压灭菌20min。

3、鉴定：对筛选的菌株lm-y进行形态学鉴定和生理生化鉴定：lm-y呈短杆状，革兰氏阳性菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上形成的菌落成圆形，边缘整齐，中间形成褶皱，淡黄色，不透明。水解淀粉，甲基红试验阳性，接触酶阳性。

菌株lm-y的16srdna序列(1423bp，seqidno.1)如下所示：

cttcggggtggctcataaggttacctcaccgacttcgggtgttaaaactctcgtggtgtgacggtcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatcttccgctcgactgcagatagcc

所述菌株lm-y的16srdna的扩增方法为：挑取少量单菌落，置于pcr管中，加入20μl去离子水，95℃处理10分钟，冷却后作为pcr模板进行扩增。

扩增所用引物为细菌16srdna序列通用引物27f和1492r。正向引物为5-agagtttgatcctggctcag-3(27f)，反向引物为5-ggttaccttgttacgactt-3(1492r)。

pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像参见附图3所示。经序列分析扩增所得的16srdna序列长度约为1423bp。将所述16srdna序列进行blast比对分析，结果显示所述16srdna与bacillusamyloliquefaciens的相似度最高，达到了99％。将所述16srdna序列在ncbi数据库进行对比后，构建系统进化树。并结合形态特征和分子生物学鉴定，确定菌株lm-y为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lm-y。

4、解解淀粉芽孢杆菌lm-y对草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、桃褐腐病菌拮抗作用的测试

将筛选出的菌株lm-y接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、180r/min下振荡培养24-36h，制成菌悬液。在pda平板中央分别接入草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、桃褐腐病菌，用移液枪将lm-y菌悬液呈三角状对称接入pda平板，距平板中心约2cm每点接入10μl(处理菌落)，以无菌水作为对照(对照菌落)，每个处理重复三次，30℃培养观察对峙培养抑菌情况，4天后测量抑菌半径，计算抑菌率。

抑菌率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％

试验结果见图5和表1，图5中植物病原菌从左至右分别为桃褐腐病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌。

表1解淀粉芽孢杆菌lm-y对几种不同病原菌的拮抗作用

实施例2解淀粉芽孢杆菌lm-y菌剂的制备

按照以下主要步骤完成菌株lm-y菌剂的制备：

(1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌lm-y接种于牛肉膏蛋白胨培养基，于30℃下培养24h活化菌株；牛肉膏蛋白胨培养基培养基配制：牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，nacl0.3g，琼脂2g，水100ml，ph7.2～7.4，121℃/20min高压灭菌。

(2)将步骤(1)活化的菌株接入lb液体培养基中，于30℃、180r/min振荡培养24h，获得种子液。lb液体培养基配制：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏10g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0，121℃/20min高压灭菌。

(3)将步骤(2)所得种子液按体积浓度5％的接种量接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、180r/min振荡培养48h，获得发酵液。所述牛肉膏蛋白胨液体培养基组成：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，nacl3g/l，溶剂为水，ph7.2～7.4。

实施例3解淀粉芽孢杆菌lm-y菌剂对桃褐腐病菌田间效果验证

3.1供试药剂

解淀粉芽孢杆菌lm-y菌剂(实施例2方法制备发酵液，用清水稀释800倍，菌体浓度在1.0×10⁷cfu/ml左右)；甲基硫菌灵，克菌戊唑醇(市售)。

3.2供试作物与防治对象

供试作物：桃子，品种为玉露

防治对象：桃褐腐病

3.3试验地概况

试验地设在浙江宁波奉化桃园，于2016年在桃园内进行褐腐病防效试验。所有试验小区的土壤类型、施肥灌溉措施均一致，符合当地农业生产规范。

3.4试验设计

试验共设4个处理：实施例2方法制备的解淀粉芽孢杆菌lm-y发酵液用清水稀释800倍液(菌体细胞含量在1.0×10⁷cfu/ml左右)，甲基硫菌灵800倍液(质量浓度800mga.i./l市售)，克菌戊唑醇1000倍液(质量浓度400mga.i./l市售)，清水为空白对照。每种药剂3个重复，每个重复不少于3棵树，随机区组排列。第一次施药在谢花初期，以后每15天施药一次，共4次。

调查方法及数据分析：褐腐病刚发生时调查一次病果率，末次施药后10天再调查一次，每棵树分东西南北4个采样点，每个采样点根据情况取20-40个桃子统计病果率，计算防治效果。

防治效果(％)＝(对照病果率-处理病果率)/对照病果率×100％

表格2各药剂对桃褐腐病的防治效果

试验结果表明：施药后，lm-y的防治效果最好，高达86.5％，高于两种市售药剂的防治效果，在生产中推荐与其他药剂交替使用从而起到延缓抗药性产生，降低化学药剂使用量的作用。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以对其作出修改，改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>浙江大学

<120>解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1423

<212>dna

<213>bacillusamyloliquefaciens

<400>1

cttcggggtggctcataaggttacctcaccgacttcgggtgttaaaactctcgtggtgtg60

acggtcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattac120

tagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagattt180

gtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgt240

gtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgt300

caccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgc360

tcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacct420

gtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacct480

ggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccc540

cgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcg600

ttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgt660

ggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtta720

cagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgct780

acacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctcc840

ccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcc900

caataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttag960

ccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttctt1020

ccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtc1080

agactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtg1140

tctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtga1200

gccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagc1260

caccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttccc1320

ggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaac1380

atcagggagcaagctcccatcttccgctcgactgcagatagcc1423