一种苏云金芽孢杆菌的发酵培养方法与流程

本发明属于微生物发酵培养技术领域，具体涉及一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌菌株的产芽孢和杀虫晶体蛋白的液体深层发酵培养方法。

背景技术：

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis，简称bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，它在形成芽孢的同时，能产生对多种昆虫、螨类和原生动物等具有特异活性的蛋白性质的伴孢晶体，由于其杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins，简称icps)对目标害虫高效专一，对非靶标生物安全和对环境无污染。因此，bt已广泛用于防治农林、仓贮和卫生等方面的害虫，是目前国内外产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，其杀虫晶体蛋白也是目前应用最为广泛和最有潜力的一类抗虫蛋白。20世纪80年代以前，有关bt的研究和应用大多集中在对鳞翅目害虫的防治上。

蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的统称，是地下害虫中分布最广和为害最重的一大类群，全国每年发生面积约1亿亩，化学农药在蛴螬防治方面占有重要地位，但长期使用化学农药带来的环境污染、生态失衡、农残超标、人畜中毒、害虫抗药性增强等问题突显，因此蛴螬的生物防治备受关注。基于苏云金芽孢杆菌在防治鳞翅目害虫方面取得的巨大成功，人们开始关注防治蛴螬的苏云金芽孢杆菌研究，筛选出了一些对蛴螬有较好生防潜能的菌株，如hbf-1(冯书亮等，2000)、bt185(yu等，2006)等等。研究表明，苏云金芽孢杆菌b-y7-1菌株可产生芽孢和伴孢晶体，芽孢呈卵圆形，伴孢晶体蛋白分子量为133.3kda，等电点为4.68；该菌株对多种蛴螬有特异杀虫活性，活菌和晶体蛋白均为杀虫的有效活性成分，具有重要的开发价值和良好的应用前景。生防菌开发应用的前提是高效的生防菌发酵培养，因生防菌株和培养目的不同，发酵培养基组成、培养条件、发酵培养方式亦不同。目前有关b-y7-1菌株培养过程中芽孢形成和晶体蛋白变化规律尚不清楚，发酵生产效率不高、芽孢和晶体蛋白产量较低，制约了b-y7-1菌株的规模化生产和开发利用。因此，开发b-y7-1菌株的发酵培养技术，获得大量的芽孢或伴孢晶体蛋白，是b-y7-1菌株开发利用的基础，也是制剂生产和应用的前提，对于蛴螬类地下害虫的防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株的培养基和发酵方法，从而使苏云金芽孢杆菌新菌株bacillusthuringiensisb-y7-1具有更好的发酵效果。

本发明首先提供一种适用于苏云金芽孢杆菌b-y7-1菌株的发酵培养基，其配方如下：

黄豆饼粉21-31g/l，玉米淀粉16-24g/l，碳酸钙0.4-0.8g/l,酵母粉3-7g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锌0.2g/l，葡萄糖1g/l，氯化钠2g/l，硫酸锰0.02g/l。

作为优选，所述的培养基，其配方为黄豆饼粉25g/l，玉米淀粉24g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锌0.2g/l，碳酸钙0.6g/l，酵母粉5.0g/l，葡萄糖1g/l，氯化钠2g/l，硫酸锰0.02g/l。

本发明涉及的苏云金芽孢杆菌新菌株bacillusthuringiensisb-y7-1，已于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.m2011267。

所述的培养基，其ph为7.0。

本发明再一个方面提供一种培养苏云金芽孢杆菌b-y7-1菌株的小规模方法，所述的方法包括如下的步骤：

步骤1)培养基制备：

配制发酵培养基，调节初始ph为6.5-8.0；

步骤2)分装：

将制备的培养基装入三角瓶，装液量为三角瓶有效容积的1/5～1/2；

步骤3)灭菌：

121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

步骤4)液体菌种制备：

挑取活化的苏云金芽孢杆菌单菌落，接种于lb液体培养基中，28℃振荡培养18h、菌体数量达到10⁸cfu/ml，作为种子液；

步骤5)接种：

按照1％～7％接种量，无菌操作接种于步骤3)灭菌后的培养基中；

步骤6)发酵：

置于全温摇床中，27℃、150r/min振荡培养8～72h。

本发明再一个方面提供一种培养苏云金芽孢杆菌b-y7-1菌株的发酵罐发酵方法：

步骤1)培养基制备：

配制℃发酵培养基，调节初始ph为7.2；

步骤2)灭菌：

将发酵培养基加入机械搅拌通风发酵罐中，装料系数75％，121℃、实消30min；

步骤3)接种：

将菌体数量10⁸cfu/ml种子培养液，按3％的接种量，接种到发酵罐中；

步骤4)发酵：

通气比1:0.8～1:1.2，250r/min，27℃发酵，以豆油为消泡剂自动控制消泡，发酵过程中ph自然或控制ph为7.0，发酵时间8-72小时。

优选的摇瓶发酵方法，发酵培养基，调节初始ph为7.0，装液量为三角瓶有效容积的1/5，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。采用lb培养18h、菌体数量10⁸cfu/ml培养液作为种子，其接种接种量为3％；27℃、150r/min振荡培养，发酵40h蛋白晶体含量最高，达到3.931mg/ml，芽孢数量大于1×10¹⁰cfu/ml。

优选的发酵罐发酵方法：发酵培养基，调节初始ph为7.2，加入机械搅拌通风发酵罐中，装料系数75％，实消30min。采用lb培养18h、菌体数量10⁸cfu/ml培养液作为种子，其接种接种量为3％；通气比1:1.2，250r/min，27℃发酵，以豆油为消泡剂自动控制消泡，发酵过程中控制ph为7.0，发酵时间为32小时，蛋白产量为2.57mg/ml，芽孢量大于4×10⁹cfu/ml。

附图说明

图1：不同基础培养基苏云金芽孢杆菌芽孢产量分析图

图2：不同初始ph芽孢产量分析图；

图3：不同装液量芽孢产量分析图；

图4：不同接种量芽孢产量分析图；

图5：不同发酵时间芽孢数量图；

图6：不同发酵时间晶体蛋白含量图；

上述图中，其中大写字母(a、b、c、d)表示差异显著水平(p<0.01)，当每个处理后面的字母相同时为不显著，只有字母完全不一样时才极显著；小写字母(a、b、c、d)表示差异显著水平(p<0.05)，每个处理后面字母相同时为不显著，只有字母完全不一样时才显著。

具体实施方式

实施例1苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1基础培养基的筛选

申请人在前期研究过程中发现，长效碳源玉米淀粉5g～25g/l、长效氮源黄豆饼粉10g～35g/l、速效氮源酵母粉3g～6g/l、磷酸氢二钾0.3g～2g/l、硫酸镁0.2g～0.5g/l、碳酸钙0.2g～2g/l、硫酸锌0g～0.4g/l、速效碳源葡萄糖1g～10g/l、氯化钠2g～10g/l、硫酸锰0.0～0.6/l均可影响菌体的生长、芽孢的形成和伴孢晶体蛋白的产量，并初步筛选了几个比较有利于菌体生长的培养基组合，因此本试验对已初步筛选出的培养基进行比较，为培养基进一步优化提供依据。供试4种基础培养基如下：

1号：玉米淀粉20g/l，黄豆饼粉27g/l，酵母粉5.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.2g/l，碳酸钙0.4g/l，硫酸锌0.2g/l，葡萄糖1g/l，氯化钠2g/l，硫酸锰0.02g/l，ph7.0-7.2。

2号：蛋白胨1.2g/l，玉米淀粉8.7g/l黄豆饼粉32g/l，酵母粉3g/l，磷酸二氢钾0.7g/l，硫酸镁0.3g/l，碳酸钙0.4g/l，硫酸锌0.2g/l，ph7.0-7.2。

3号：蛋白胨2g/l，玉米淀粉20g/l黄豆饼粉25g/l，酵母粉5g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，硫酸镁0.3g/l，碳酸钙1g/l，硫酸锌0.2g/l，葡萄糖1g/l，ph7.0-7.2。

lb培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，ph7.0-7.2。

将上述4种培养基按比例溶解在蒸馏水中，调ph后，装入150ml锥形瓶中，每个瓶30ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。采用lb培养18h、菌体数量10⁸cfu/ml培养液作为种子，其接种接种量为1％；25℃、150r/min振荡培养。试验3次重复。分别培养24、48小时取样，样品采用直接10倍系列梯度稀释涂布法测活细胞总数，加热杀死营养细胞后采用10倍系列梯度稀释涂布法测芽孢数量。

图1试验结果表明，1号培养基在48h与72h，芽孢产量最高。后续的培养基优化在1号培养基基础上进行。

注：大写字母表示差异显著水平(p<0.01)，当每个处理后面的字母相同时为不显著，只有字母完全不一样时才极显著；下同。

实施例2苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1培养基的优化

以1号培养基为基础培养基，采用l9(3⁴)正交实验设计考察玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、caco3用量对芽孢产量的影响，试验设计见表1，配制9种发酵培养基，除考察指标外，培养基其他成分同基础培养基，培养基灭菌、接种、发酵、检测方法同实施例1。

表1试验因素与水平

表2：培养基培养优化正交试验结果

在发酵生产中，希望在短时间内获得足够量的芽孢，表2培养基优化正交试验研究结果表明，7号处理组合(a3b1c3d2)芽孢产量最高，其中黄豆饼粉用量对芽孢产量影响最大，其次caco3的用量；可能的最优组合是a3b1c1d2。

进一步考察黄豆饼粉用量，试验结果表3表明，黄豆饼粉最适用量为25g/l。经试验验证(表4)，确定最优的培养基组成为黄豆饼粉25g/l，玉米淀粉24g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锌0.2g/l，碳酸钙0.6g/l,酵母粉5.0g/l，葡萄糖1g/l，氯化钠2g/l，硫酸锰0.02g/l；48h芽孢产量为1.86×10¹⁰cfu/ml。

表3：不同浓度黄豆饼粉发酵48h时芽孢产量

表4：最优培养基配方验证

实施例3苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1发酵条件的优化

利用优化培养基，采用摇瓶培养，研究不同初始ph、装液量、接种量、发酵周期对芽孢产量、伴孢晶体蛋白的影响。在装液量1/5、接种量3﹪条件下，测定初始ph6.5、7、7.5、8共4个梯度下的芽孢产量；在最适初始ph、接种量3﹪条件下、测定装液量为1/5、1/3、1/2时的芽孢产量；在最适初始ph、装液量条件下，测定接种量分别为1﹪、3﹪、5﹪、7﹪时的芽孢产量；在最适初始、装液量、接种量条件，每隔8h测定一次芽孢和伴孢晶体蛋白产量。

蛋白含量检测：取2ml发酵液10000rpm离心10min，沉淀用无菌水洗涤2次，用0.5mol·l^-1nacl洗涤沉淀2次；沉淀加入1ml裂解液(50mmna2co3，10mmedta二钠，使用前加终浓度为3％的巯基乙醇，ph调至9.5)，4℃下裂解5～6h；10000rpm离心10min，取上清液加入2ml4mnaac-hac(ph＝4.5)，4℃沉淀4h。4℃(10000rpm/20min)离心，沉淀用无菌水洗涤后溶于2mlph9.5的50mmna2co3溶液，利用超微量核酸蛋白检测仪直接测蛋白含量。

试验结果表明：摇瓶发酵最适初始为ph7.0(图2)，装液量为1/5(图3)，接种量为3％(图4)。

在最适条件下，不同发酵时间芽孢和伴孢晶体蛋白产量结果见图5和图6。不同发酵时间芽孢产量差异显著，72h芽孢量最高，达到5.6×10¹⁰cfu/ml；不同发酵时间蛋白晶体含量有极显著差异，发酵40h蛋白晶体含量最高，达到3.931mg/ml。综合考虑芽孢产量、蛋白晶体产量和生产成本，发酵周期以40h为宜。

实施例4苏云金芽孢杆菌菌株b-y7-1发酵罐发酵方法

配制发酵培养基:黄豆饼粉25g/l、玉米淀粉24g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、七水合硫酸镁0.2g/l、硫酸锌0.2g/l、碳酸钙0.6g/l、酵母粉5.0g/l、葡萄糖1g/l、氯化钠2g/l，硫酸锰0.02g/l，调节初始ph为7.2。加入机械搅拌通风发酵罐中，装料系数75％，实消30min；采用lb培养18h、菌体数量10⁸cfu/ml培养液作为种子，其接种接种量为3％；250r/min，27℃发酵，以豆油为消泡剂自动控制消泡；发酵过程中通气比分别设为1:0.8和1:1.2，ph分别设为控制ph为7.0和自然发酵(不控制ph)，调控发酵过程。发酵过程中定时取样，测定芽孢数量和蛋白含量。

试验结果表明：通气比1:1.2条件下发酵32小时蛋白产量最大，在控制ph7.0条件下蛋白产量为2.57mg/ml，明显高于不控制ph自然发酵过程的蛋白产量；通气搅拌发酵32小时芽孢量大于4×10⁹cfu/ml(表5)。通气比1:0.8条件下通气搅拌发酵，在控制ph7.0条件下28小时时蛋白产量为2.24mg/ml，高于不控制ph自然发酵过程的蛋白产量，芽孢量为2.4×10⁹cfu/ml；不控制ph自然发酵过程32小时的芽孢量达到1×10⁹cfu/ml(表6)。综合考虑芽孢产量和蛋白产量两个指标，利用通气搅拌液体深层发酵，发酵温度27℃，适宜通气比为1:1.2，发酵过程中控制ph值为7.0，发酵时间为32小时。

表5通气比为1:1.2发酵过程中蛋白和芽孢量的变化

表6通气比为1:0.8发酵过程中蛋白和芽孢量的变化