一种含α‑糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其生产α-熊果苷的应用。

(二)

背景技术：

熊果苷属于氢醌葡糖苷类化合物，结构式如图1所示，其通过糖苷键将一个d-吡喃葡萄糖与对苯二酚一侧的酚羟基偶联，其化学名为4-羟基苯基-d-吡喃葡萄糖苷，是一种高效、安全、绿色、普遍的酪氨酸酶抑制剂，能起到抑制黑色素的形成，是一种广受国内外女性喜爱的化妆品原料，广泛的被化妆品行业使用为皮肤美白添加剂。它同时还具有抗菌、止血、消炎、祛斑、治疗肾脏疾病等作用。

熊果苷分为α-熊果苷和β-熊果苷，它们具有相同的分子组成，二者为差向异构体，都是一种白色的针状晶体，易溶于水、水醇混合物中，微溶于乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂，不溶于石油醚、乙醚等有机溶剂里。相对于其它化学合成的美白化妆品，α-熊果苷主要以生物法合成为主，减少了化学合成引起的污染和分离纯化的成本。同时α-熊果苷作为酪氨酸酶的竞争性抑制剂，其美白活性相对于同类美白化妆品具有更好的疗效。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其制备α-熊果苷的应用，实现了生物法高效生产α-熊果苷。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将seqidno.1所示α-糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。所述重组大肠杆菌即为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-amy637，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13992，保藏日期2017年4月7日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

进一步，所述α-糖苷酶基因编码蛋白的氨基酸序列为seqidno.2所示。

第二方面，本发明提供一种所述含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌在制备α-熊果苷中的应用。

方法1：所述的应用以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷。所述发酵液中湿菌体含量为5-100g/l(优选20-30g/l)，底物终浓度为5-60g/l发酵液(优选40-60g/l)，所述蔗糖终浓度为300～500g/l发酵液(优选400g/l)。

进一步，所述底物以连续补料形式加入，首次加入300-400g/l发酵液，反应开始后进行底物连续补料，前3h内，以2-3g/l发酵液/30min的速度加入，反应6-9h后，以1.5-2.5g/l发酵液/h的速度加入。

进一步，所述底物补料量为40-60g/l。

方法2：所述的应用以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液离心收集的湿菌体为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，以ph7.0、50mm磷酸缓冲液为反应介质，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷。所述缓冲液中，湿菌体用量为5-100g/l(优选20-30g/l)，底物终浓度为5-60g/l(优选40-60g/l)，蔗糖终浓度为300～500g/l(优选400g/l)。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：(1)将含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌接种在含50mg/l卡那霉素的种子培养基中，30-37℃、100-200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l，溶剂为去离子水，ph7.0；

(2)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的发酵培养基中，在30-37℃培养4-6h；加入终浓度为5-20g/l的α-乳糖，在22-25℃继续发酵12-18h，取发酵液离心，收集湿菌体细胞；所述发酵培养基质量终浓度组成：10g/l的蛋白胨、5g/l的酵母提取粉、15g/l甘油、9g/lna2hpo4、3.4g/lkh2po4、3g/lnh4cl、0.71g/lna2so4、5g/lmgso4，溶剂为去离子水，ph6.5-7.5。

本发明所述α-糖苷酶基因源自野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)ife008，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.13990，保藏日期2017年4月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：①采用生物法一步转化法生产α-熊果苷；②α-糖苷酶的催化活性高，10-14h内催化40-60g/l对苯二酚底物转化为100-150g/l的α-熊果苷；③底物利用率高，即底物利用率均在90％以上。

本发明所述生产α-熊果苷的含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌，即重组大肠杆菌(escherichiacoli)ife-amy637能够在胞内高效合成α-糖苷酶，以对苯二酚和蔗糖为底物，高效催化对苯二酚的糖基化反应，反应12-14小时，可得到大于10％的α-熊果苷溶液，平均生产强度大于8.3g/l·h，且底物对苯二酚的转化率大于90％，α-熊果苷的产物浓度高，转化率高，有利于α-熊果苷回收纯化。

(四)附图说明

图1为熊果苷结构式。

图2为pet28a-amy637载体的结构示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

lb培养基：酵母粉5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl10.0g/l，溶剂为去离子水，ph值6.5-7.0。

种子培养基：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

发酵培养基质量终浓度组成：10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取粉、15g/l甘油、9g/lna2hpo4、3.4g/lkh2po4、3g/lnh4cl、0.71g/lna2so4、5g/lmgso4，溶剂为去离子水，ph6.5-7.5。

实施例1野油菜黄单胞菌的筛选及验证

取染病的和腐烂的野油菜菜叶10g，直接加入到50ml生理盐水中，摇床放置30min，将悬浊液用生理盐水梯度稀释，涂布于半选择性的nsca培养基(淀粉15g/l，营养琼脂粉23g/l，放线菌酮100mg/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)平板，28℃好氧培养48h。挑取浅黄色凸粘液单菌落反复进行nsca平板划线分离，重复三次得到纯化的菌株ife008，供下一步鉴定用。

形态观察：

1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在2～4mm之间，表面光滑，浅黄色凸粘液等符合野油菜黄单胞菌菌落形态特征。2)划线到ydc培养基平板(酵母粉10.0g/l，葡萄糖20.0g/l，碳酸钙粉20.0g/l，琼脂15.0g/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)，菌落呈深黄色，光滑凸起，粘液状。3)细胞形态观察：用光学显微镜观察，革兰氏阴性菌，细胞直杆状。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

16srdna测序鉴定：以体积浓度1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于nga培养基(牛肉膏3.0g/l，蛋白胨5.0g/l，葡萄糖2.5g/l，琼脂粉15.0g/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)中，28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna。用细菌通用引物27f/1541r(27f：agagtttgatcctggctcag，1541r：aaggaggtgatccagccgca)扩增16srdna，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将pcr扩增产物直接寄送上海生工基因测序，分别用27f和1541r测序，拼接序列如seqidno.3所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，确定菌株ife008为野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)ife008，已于2017年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13990，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2、制备生产α-熊果苷的催化剂

一、构建高效合成α-糖苷酶的大肠杆菌

采用细菌基因组dna提取试剂盒提取对数生长中期的野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)cgmccno.13990的基因组dna，以此为模板，用以下引物进行pcr扩增：

amy-f:5’-ggaattcatgatcgcttcctcc-3’(化线部分为ecori识别位点)；

amy-r:5’-cccaagctttcaacgacgctgcaaccag-3’(划线部分为hindiii识别位点)。

采用takara公司的高效保真酶primerstart进行pcr扩增，其pcr扩增程序为：95℃3min；98℃10s、55℃15s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

将所得的pcr产物采用pcr产物回收试剂盒纯化，连接到pgem-teasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌dh5α，对重组质粒进行测序，测序结果表明pcr产物的核苷酸序列如seqidno.1所示(编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示)。随后用takara公司的ecori和hindiii对纯化的pcr产物进行双酶切，37℃静置4h后，用dna回收试剂盒纯化酶切后的pcr产物，与用同样酶双酶切的pet28a载体在t4dna连接酶作用下连接，连接产物，转化e.colibl21(de3)的高效感受态细胞，在含终浓度50mg/l卡那霉素的lb平板上筛选。菌落pcr验证阳性克隆子。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pet28a-amy637(图2)。

含重组质粒pet28a-amy637的阳性克隆子e.colibl21(de3)(pet28a-amy637)命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-amy637，将其保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年4月7日，保藏号为cgmccno.13992，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

二、制备生产α-熊果苷的催化剂

将大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-amy637接种在含有50mg/l卡那霉素的种子培养基中，37℃、200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的发酵培养基中，30℃培养4h后；加入终浓度为10g/l的α-乳糖，控制发酵温度25℃，继续发酵15h，取发酵液5000×g离心，收集湿菌体细胞，得到生产α-熊果苷的催化剂。

实施例3催化剂在生产α-熊果苷中的应用

一、催化剂的活性检测

将实施例2方法制备的湿菌体细胞0.5g重新悬浮于10ml的ph7.0、50mm磷酸缓冲液中；加入终浓度50mmol/l的对苯二酚和1.2mol/l的蔗糖，在30℃、150rpm条件下水浴摇床催化30min，反应液用于hplc分析，测得残留的底物为对苯二酚浓度为25mmol/l，形成的产物α-熊果苷浓度为25mmol/l，转化率为50％。

液相色谱检测条件。样品前处理：100μl反应液，加入到900μl的0.01mol/l稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：cl8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：ch3oh(甲醇)：h2o：c2hf3o2(三氟乙酸)＝90:10:0.01(体积比)；流速：0.8ml·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：287nm；进样量：10μl。底物对苯二酚的出峰时间一般为5-5.5min，产物α-熊果苷的出峰时间为6.5-7.5min。

二、2l发酵罐中的催化剂制备及其在1l反应体系中连续补料转化的应用

(1)菌种活化

将大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-amy637接种在含有50mg/l卡那霉素的种子培养基中，37℃、200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

(2)2l发酵罐中的催化剂制备

将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到1.5l的含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/l卡那霉素的发酵培养基中，30℃培养4h；加入终浓度为10g/l的α-乳糖，控制发酵温度25℃，继续发酵15h，得到发酵液，湿菌体含量为20g/l。

(3)1l发酵液中的连续补料转化

取步骤(2)制备的1l发酵液，用2mol/lnaoh调节ph7.0。加入400g蔗糖和5.5g对苯二酚，放在30℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，进行催化反应。反应前3h内，每隔30min，添加3.0g对苯二酚；反应后9h内，每隔1h添加3.0g对苯二酚。在12h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物45g。

(4)α-熊果苷产物浓度检测

样品前处理：取20μl反应液，加入到980μl的0.01mol/l稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：cl8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：ch3oh(甲醇)：h2o：c2hf3o2(三氟乙酸)＝90:10:0.01(体积比)；流速：0.8ml·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：287nm；进样量：10μl。底物对苯二酚的出峰时间一般为5.5min，产物α-熊果苷的出峰时间为7.2min。经过45g对苯二酚底物的分批次补加和12-14h的转化反应，测得残留的底物为对苯二酚浓度为2.5g/l，形成的产物α-熊果苷浓度为105g/l，转化率为94％。

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