一种从肝癌组织中分离纯化出CD8+T细胞的方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种从肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法。

(二)

背景技术：

cd8+t淋巴细胞是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。cd8+t细胞可以识别由mhci类分子提呈的内源性抗原肽，可产生ifn-γ介导机体杀伤携带抗原的靶细胞。另外肿瘤组织还存在可产生il-17的cd8+t细胞，而il-17的分泌可通过促进血管而促进肿瘤的进一步发展，同时肿瘤激活的单核细胞可分泌一系列的关键细胞因子(il-1β，il-6及il-23)以引起分泌il-17的cd8+t细胞的增殖。由此可见cd8⁺t细胞与肿瘤微环境间存在较为复杂的相互作用，即可促进免疫反应实现对肿瘤细胞的杀伤，也可能对免疫反应起抑制作用无法有效杀伤靶细胞，甚至还可能通过分泌炎症因子促进肿瘤发展。因此，建立适宜的分选方法从肝癌组织中高效、简便的分选出数量多，纯度高、活力好的cd8+t淋巴细胞，对进一步深入了解肿瘤组织局部免疫肿瘤杀伤的机制以及抑制免疫效应的机制起到重要作用。

目前从组织中分选细胞的方法主要有流式细胞分选和免疫磁珠细胞分选。这两种方法在实际应用中各有优缺点：(1)流式分选虽分选纯度可以达到90％，但是其设备昂贵，操作复杂，分选时间较长，且选择高纯度模式进行分选的同时必然会有许多细胞的损耗，导致最终细胞得率低于10^5个。(2)肿瘤组织成分复杂，包含有许多不同类型的细胞，同时组织消化成单细胞的过程会产生许多细胞碎片和死细胞，免疫磁珠分选虽然简单快捷，但其会与一些杂细胞产生非特异性结合，尤其容易和细胞碎片和死细胞结合，导致最后分选纯度低于50％。将ficoll密度梯度离心与免疫磁珠分选的方法相结合虽然去除一部分杂细胞，但是该方法避免不了细胞碎片和死细胞的非特异性结合，最终的分选纯度低于70％。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从肝癌组织中分离纯化出高纯度cd8+t细胞的方法。

本发明的技术方案是：

从肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法，所述方法包括：

(1)肿瘤浸润淋巴细胞的分离：取离体的肝癌及癌旁组织，pbs洗净，剪碎，加入消化液中，37℃水浴消化30～40分钟，细胞筛过滤细胞，pbs清洗，所得细胞重悬于pbs中，得细胞悬液；所述消化液按如下组成配制：10ml1640培养液中加入终浓度为0.1％(w/w)的i型胶原酶，终浓度为0.01％(w/w)的透明质酸酶和终浓度为0.002％(w/w)的dna酶；

(2)密度梯度离心：在离心管中依次缓慢加入60％(v/v)percoll溶液，30％(v/v)percoll以及细胞悬液，调整离心机升速度为1，降速度为0，离心20min，小心吸取30％percoll和60％percoll交界层处的细胞，pbs洗涤细胞2遍，收集细胞；

(3)cd8+t细胞macs分选：

①以macsbuffer80ul/每10⁷个细胞重悬，加入cd8+t磁珠20ul/每10⁷个细胞，4℃孵育15min；

②加入macsbuffer，洗涤离心，去除残余磁珠；

③macsbuffer重悬细胞，置于4℃条件下，过ms柱子；

④待细胞悬液流尽之后，再加入macsbuffer洗涤；

⑤将柱子取下，用1mlmacsbuffer将细胞冲下，重复两次；

⑥换一根新柱子，重复步骤③～⑤，得所述cd8+t细胞。

所述macsbuffer按如下组成配制：fbs0.5％(v/v)+edta2mm，溶剂为pbs。

现有技术领域，从血液中分选细胞相对较为成熟，也能达到比较高的纯度，但是从组织中分选细胞，要达到较高的纯度非常困难。本发明结合将密度梯度离心和免疫磁珠分选的方法先结合，先对细胞进行初纯化后再进行分选，在保证细胞得率不受影响的基础上大大提高了分选的纯度和效率，能够满足后续研究的需要。

本发明的有益效果主要体现在：与流式分选法相比操作简单，分选时间短，分选细胞得率较低，与免疫磁珠细胞分选相比，大大提高了分选纯度，但是细胞得率不受影响，为进一步深入了解肿瘤组织局部免疫肿瘤杀伤的机制以及抑制免疫效应的机制提供了研究基础。

(四)附图说明

图1为对percoll密度梯度离心结合磁珠分选的方法分选cd8+t细胞后进行流式细胞仪检测的结果。

a:肝癌组织中分选出的全部细胞流式图，所画的圈为p1门，p1门内为淋巴细胞群；

b:对应a图中所有的细胞cd3+cd8+所占的比例；

c：对应a图p1门内的细胞cd3+cd8+所占的比例。

图2为用磁珠分选的方法分选cd8+t细胞后进行流式细胞仪检测的结果。

a:肝癌组织中分选出的全部细胞流式图,所画的圈为p1门，p1门内为淋巴细胞群；

b:对应a图中所有的细胞cd3+cd8+所占的比例；

c：对应a图p1门内的细胞cd3+cd8+所占的比例。

图3为对ficoll密度梯度离心结合磁珠分选的方法分选cd8+t细胞后进行流式细胞仪检测的结果。

a:肝癌组织中分选出的全部细胞流式图,所画的圈为p1门，p1门内为淋巴细胞群；

b:对应a图中所有的细胞cd3+cd8+所占的比例；

c：对应a图p1门内的细胞cd3+cd8+所占的比例。

图4为beckman分选流式细胞仪对cd8+t细胞进行分选之后，直接对cd8+t细胞的纯度进行检测的结果。

a:肝癌组织中分选出的全部细胞流式图；

b:对应a图中r1框内的细胞cd3+cd8+所占的比例；

c：肝癌组织中分选出的全部细胞流式图，所划的框r1主要为淋巴细胞群；

d:对应c图中r1框内的细胞cd3+cd8+所占的比例。

(五)具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此：

实施例1：

1.材料方法以及主要试剂耗材

(1)标本：通过医院的病历系统分析福州市传染病医院将接受原发性肝细胞癌手术切除的临床资料。经医院伦理委员会批准和患者本人或家属的知情同意后，收集手术切除的肿瘤组织。计划选取4例病例，入组标准为单发、肿瘤直径5-10cm的原发性肝细胞癌患者；排除标准为合并胆管细胞癌、肝转移癌病例；或术前接受针对肿瘤病灶行介入、b超引导射频治疗或其他治疗等病例。入组病例术前检查项目包括肝脏b超、ct或mri，血肝功能，血afp，肺部ct，脑部ct，全身骨ect，血乙肝两对半等。所有入组病例均进行定期随访，观察的主要终点为肝癌患者术后转安或放弃治疗。

(2)主要材料：percoll分离液(ge)，ficoll分离液(ge)，i型胶原酶(sigma)，pbs(hyclone)，透明质酸酶(sigma)，dna酶(sigma)，40um细胞筛(bd)，cd8磁珠(美天妮)，cd3抗体(bd)，cd8抗体(bd)，ms分选柱(美天妮)，1640培养基(hyclone)，细胞计数板(countstar)。

2.percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选从人肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法，包括以下步骤：

1.肿瘤浸润淋巴细胞的分离

(1)取大概0.5cm³的癌组织，pbs洗两遍，将残留血液洗净；

(2)在培养皿中剪碎癌组织，使其体积小于1mm；

(3)配制消化液：10ml1640培养液中加入终浓度为0.1％的i型胶原酶，终浓度为0.01％的透明质酸酶和终浓度为0.002％的dna酶；

(4)37度振荡水浴锅，消化组织30-40min；

(5)40um细胞筛过滤细胞，pbs清洗细胞2遍。

2.密度梯度离心

(1)100％percoll母液配制：将percoll原液与1.5mnacl以9:1配成percoll母液；(2)用0.15mnacl稀释100％percoll至60％和30％；

(3)在15ml离心管中依次缓慢加入4ml60％percoll溶液，4ml30％percoll以及6ml的细胞悬液；

(4)调整离心机升速度为1，降速度为0，800g离心20min；

(5)小心吸取30％percoll和60％percoll交界层处的细胞，pbs洗涤细胞2遍，收集细胞。

3.cd8+t细胞macs分选

(1)macsbuffer配制：pbs+0.5％fbs+2mmedta；

(2)以macsbuffer80ul/每10^7个细胞重悬，加入cd8+t磁珠20ul/每10⁷个细胞，4度孵育15min；

(3)加入1mlmacsbuffer，洗涤离心，去除残余磁珠；

(4)1mlmacsbuffer重悬细胞，置于4度条件下，过ms柱子；

(5)待细胞悬液流尽之后，在加入3ml的macsbuffer洗涤；

(6)将柱子取下，用1mlmacsbuffer将细胞冲下，重复两次；

(7)换一根新柱子，重复步骤(4)～(6)，得cd8+t细胞细胞悬液。

4.检测细胞纯度，细胞数量

(1)取100ul细胞悬液同时加入5ul的cd8和cd3抗体，常温避光孵育25min，洗涤离心2次，200ulpbs重悬细胞；

(2)bd流式细胞仪检测细胞纯度，细胞纯度大于95％(结果见图1)；

(3)取20ul细胞悬液，细胞计数仪检测细胞数目，细胞数目大于3×10⁵。

实施例2：

美天旎免疫磁珠分选从人肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法，包括以下步骤：

1.肿瘤浸润淋巴细胞的分离(同实施例1步骤1)

2.cd8+t细胞macs分选(同实施例1步骤3)

3.检测细胞纯度，细胞数量

(1)取100ul细胞悬液同时加入5ul的cd8和cd3抗体，常温避光孵育25min，洗涤离心2次，200ulpbs重悬细胞；

(2)bd流式细胞仪检测细胞纯度低于50％(结果见图2)；

(3)取20ul细胞悬液，细胞计数仪检测细胞数目，细胞数目大于3×10⁵。

实施例3：

ficoll密度梯度离心结合磁珠分选从人肝癌组织中分选cd8+t细胞的方法，具体步骤如下：

1.肿瘤浸润淋巴细胞的分离(同实施例1步骤1)

2.密度梯度离心

(1)在15ml离心管中依次缓慢加入4mlficoll溶液，以及8ml的细胞悬液；

(2)调整离心机升速度为1，降速度为0，800g离心20min；

(3)小心吸取ficoll上层的细胞，pbs洗涤细胞2遍，收集细胞。

3.cd8+t细胞macs分选(同实施例1步骤3)

4.检测细胞纯度，细胞数量

(1)取100ul细胞悬液同时加入5ul的cd8和cd3抗体，常温避光孵育25min，洗涤离心2次，200ulpbs重悬细胞；

(2)bd流式细胞仪检测细胞纯度低于70％(结果见图3)；

(3)取20ul细胞悬液，细胞计数仪检测细胞数目大于3×10⁵。

实施例4：

使用流式细胞仪分选cd8+t细胞，步骤如下：

1.肿瘤浸润淋巴细胞的分离(同实施例1步骤1)

2.cd8+t细胞分选

(1)取200-300ulpbs重悬细胞并加入10ul的cd8和cd3抗体，常温避光孵育25min，洗涤离心2次，200ulpbs重悬细胞；

(2)调整好beckman分选流式细胞仪参数之后，上机进行分选；

(3)beckman分选细胞仪上检测分选出的cd8+t细胞不到10⁵，细胞纯度接近90％(结果见图4)。