一种含α‑葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其生产l-薄荷醇-α-糖苷的应用。

(二)

背景技术：

l-薄荷醇为无色透明针状晶体；相对分子质量为156.4，熔点44℃，沸点216.4℃；微溶于水，溶于环己烷、乙醇和苯等常规有机溶剂，其结构式如图1所示。l-薄荷醇具有新鲜、轻快、扩散性的气味和独特的香味，被大量应用于香烟、化妆品、牙膏、漱口液、口香糖、甜食等。此外，l-薄荷醇能刺激皮肤上的冷感器但不导致实际温度变化，发挥局部止痒、止痛、舒张血管、轻微局部麻醉及促进药物渗透的作用，因而亦可用于药物涂擦和局部麻醉等。所以，l-薄荷醇在医药卫生、食品工业和日用精细化工品等方面具有广泛的用途。近年来，国内市场对薄荷醇的需要持续增长，改性l-薄荷醇品质，提高其使用效果，具有重要的经济价值和社会效益。

在实际应用中，l-薄荷醇存在一些缺点，包括遇热不稳定；随着时间的推移，其香味和清凉作用会渐渐消失；水中溶解性差，需要用乙醇等有机溶剂溶解后使用。糖基化是针对许多活性小分子物质常用的改性方法，显著提高水溶性的同时增加其稳定性。对于l-薄荷醇的糖基化处理，转化成l-薄荷醇-α-糖苷，在口香糖中的应用效果显著提高。使用l-薄荷醇-α-糖苷，可显著延长口香糖清凉口感的时间，通过不断咀嚼，借助口中的α-葡萄糖苷酶的水解作用，从而不断释放清凉快感，提高口香糖品质。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其制备l-薄荷醇-α-糖苷的应用，实现生物法一步催化，高效生产l-薄荷醇-α-糖苷。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将seqidno.1所示α-葡萄糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。所述重组大肠杆菌即为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-agl538，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13991，保藏日期2017年4月7日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

进一步，所述α-葡萄糖苷酶基因编码蛋白的氨基酸序列为seqidno.2所示。

第二方面，本发明提供一种所述含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌在制备l-薄荷醇-α-糖苷中的应用。

方法1：所述的应用以含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液为催化剂，以l-薄荷醇为底物，以麦芽糖为辅助底物，在25-40℃的条件下进行反应，获得含l-薄荷醇-α-糖苷的反应液，将反应液分离纯化获得l-薄荷醇-α-糖苷。所述发酵液中湿菌体含量为5～100g/l(优选30g/l)，底物终浓度为5～100g/l发酵液(优选50g/l)，所述麦芽糖终浓度为300～500g/l发酵液(优选400g/l)。

进一步，所述辅助底物麦芽糖以补料形式加入，首次加入300-400g/l发酵液，反应开始10-12h后再补加0-100g/l(优选100g/l)发酵液的麦芽糖，继续反应14h，获得发酵液；所述的底物l-薄荷醇，则一次性投料，总浓度为5-100g/l。

方法2：所述的应用以含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液离心收集的湿菌体为催化剂，以l-薄荷醇为底物，以麦芽糖为辅助底物，以ph8.0、10mm硼酸缓冲液为反应介质，在25-40℃的条件下进行反应，获得含l-薄荷醇-α-糖苷的反应液，将反应液分离纯化获得l-薄荷醇-α-糖苷。所述缓冲液中，湿菌体用量为5～100g/l(优选30g/l)，底物终浓度为5～100g/l(优选50g/l)，麦芽糖终浓度为300～500g/l(优选400g/l)。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：(1)将含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌接种在含50mg/l卡那霉素的种子培养基中，30-37℃、100-200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l，溶剂为去离子水，ph7.0；

(2)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的发酵培养基中，在30-37℃培养4-6h；加入终浓度为5-20g/l的α-乳糖，在22-25℃继续发酵16-22h，取发酵液离心，收集湿菌体细胞；所述发酵培养基质量终浓度组成：10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取粉、15g/l甘油、9g/lna2hpo4、3.4g/lkh2po4、3g/lnh4cl、0.71g/lna2so4、5g/lmgso4，溶剂为去离子水，ph6.5-7.5。

本发明所述α-葡萄糖苷酶基因源自野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)ife008，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.13990，保藏日期2017年4月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：①采用生物酶法，一步催化生产l-薄荷醇-α-糖苷；②α-葡萄糖苷酶的活性很高，实现高效、高转化率和高产率生产l-薄荷醇-α-糖苷；③产物浓度高，有利于产品的提炼与纯化，显著降低生产成本。

本发明所述生产l-薄荷醇-α-糖苷的含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌，即重组大肠杆菌(escherichiacoli)ife-amy637能够在胞内高效合成α-葡萄糖苷酶，以l-薄荷醇为底物，麦芽糖为辅助底物，高效催化l-薄荷醇的糖基化反应，反应10-24小时，可得到大于10％的l-薄荷醇-α-糖苷转化醪液，平均生产强度大于5g·l^-1·h^-1，且底物转化率大于95％，l-薄荷醇-α-糖苷的产物浓度高，转化率高，有利于l-薄荷醇-α-糖苷回收纯化。

(四)附图说明

图1为l-薄荷醇-α-糖苷的分子结构示意图。

图2为pet28a-agl538载体的结构示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

lb培养基：酵母粉5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl10.0g/l，溶剂为去离子水，ph值6.5～7.0。

种子培养基：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

发酵培养基质量终浓度组成：10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取粉、15g/l甘油、10g/l乳糖、9g/lna2hpo4、3.4g/lkh2po4、3g/lnh4cl、0.71g/lna2so4、5g/lmgso4，溶剂为去离子水，ph6.5-7.5。

实施例1野油菜黄单胞菌的筛选及验证

取染病的和腐烂的野油菜菜叶10g，直接加入到50ml生理盐水中，摇床放置30min，将悬浊液用生理盐水梯度稀释，涂布于半选择性的nsca培养基(淀粉15g/l，营养琼脂粉23g/l，放线菌酮100mg/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)平板，28℃好氧培养48h。挑取浅黄色凸粘液单菌落反复进行nsca平板划线分离，重复三次得到纯化的菌株ife008，供下一步鉴定用。

形态观察：

1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在2～4mm之间，表面光滑，浅黄色凸粘液等符合野油菜黄单胞菌菌落形态特征。2)划线到ydc培养基平板(酵母粉10.0g/l，葡萄糖20.0g/l，碳酸钙粉20.0g/l，琼脂15.0g/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)，菌落呈深黄色，光滑凸起，粘液状。3)细胞形态观察：用光学显微镜观察，革兰氏阴性菌，细胞直杆状。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

16srdna测序鉴定：以体积浓度1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于nga培养基(牛肉膏3.0g/l，蛋白胨5.0g/l，葡萄糖2.5g/l，琼脂粉15.0g/l，溶剂为蒸馏水，ph值自然)中，28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna。用细菌通用引物27f/1541r(27f：agagtttgatcctggctcag，1541r：aaggaggtgatccagccgca)扩增16srdna，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将pcr扩增产物直接寄送上海生工基因测序，分别用27f和1541r测序，拼接序列如seqidno.3所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，确定菌株ife008为野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)ife008，已于2017年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13990，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2、制备l-薄荷醇-α-糖苷

一、构建高效合成α-葡萄糖苷酶的大肠杆菌

采用细菌基因组dna提取试剂盒提取对数生长中期的野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)cgmccno.13990的基因组dna，以此为模板，用以下引物进行pcr扩增：

agl-f:5’-ggaattcatgtcgcagacaccatggtg-3’(化线部分为ecori识别位点)；

agl-r:5’-cccaagctttcagccacgaccgacagcagc-3’(划线部分为hindiii识别位点)。

采用takara公司的高效保真酶primerstart进行pcr扩增，其pcr扩增程序为：95℃3min；98℃10s、55℃15s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

将所得的pcr产物采用pcr产物回收试剂盒纯化，连接到pgem-teasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌dh5α，对重组质粒进行测序，测序结果表明pcr产物的核苷酸序列如seqidno.1所示(编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示)。随后用takara公司的ecori和hindiii对纯化的pcr产物进行双酶切，37℃静置4h后，用dna回收试剂盒纯化酶切后的pcr产物，与用同样酶双酶切的pet28a载体在t4dna连接酶作用下连接，连接产物，转化e.colibl21(de3)的高效感受态细胞，在含终浓度50mg/l卡那霉素的lb平板上筛选。菌落pcr验证阳性克隆子。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pet28a-agl538(图2)。

含重组质粒pet28a-agl538的阳性克隆子e.colibl21(de3)(pet28a-agl538)命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-agl538，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13991，保藏日期2017年4月7日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

二、制备生产l-薄荷醇-α-糖苷的催化剂

大肠杆菌(escherichiacoli)ife-agl538在含有50mg/l卡那霉素的种子培养基中，37℃、200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的发酵培养基中，30℃培养5h；加入终浓度为10g/l的α-乳糖，控制发酵温度25℃，继续发酵18h，取发酵液5000×g离心，收集湿菌体细胞，得到生产l-薄荷醇-α-糖苷的催化剂。

实施例3催化剂在生产l-薄荷醇-α-糖苷中的应用

一、催化剂的活性检测

将实施例2方法制备的湿菌体细胞0.5g重新悬浮于10ml的ph8.0硼酸缓冲液(10mmol/lh3bo3-kcl缓冲液)中；加入终浓度5g/l的l-薄荷醇和40g/l的麦芽糖，在40℃、150rpm条件下水浴摇床催化30min和2h，反应液用于hplc分析。

30min的底物转化率分析：l-薄荷醇添加5g/l，经过30min的转化反应，hplc分析测得残留的底物为l-薄荷醇浓度为1.0g/l，形成的产物l-薄荷醇-α-糖苷浓度为8.2g/l，底物转化率在80％以上。

2h的底物转化率分析：l-薄荷醇添加5g/l，经过2h的转化反应，hplc分析测得残留的底物为l-薄荷醇浓度为0.01g/l，形成的产物l-薄荷醇-α-糖苷浓度为10.0g/l，底物转化率在99.9％以上。

液相色谱检测条件。

1)样品前处理：将10ml反应液全部转移至50ml离心管，加23ml甲醇至原先的锥形瓶，充分振荡后倒入之前的离心管；8000rpm离心5min；取2ml上清12000rpm离心5min；用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中。

2)色谱柱：cl8柱，250×4.6mm；柱温：30℃；流动相：ch3oh(甲醇)：h2o：c2hf3o2(三氟乙酸)＝70:30:0.01(体积比)；流速：1.0ml·min^-1；检测器：视差折光检测器；进样量：10μl。底物l-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min，产物l-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。

二、2l发酵罐中的催化剂制备及其在1l体系底物添加量50g/l的催化转化应用

(1)菌种活化

大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-agl538在含有50mg/l卡那霉素的种子培养基中，37℃、200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

(2)2l发酵罐中的菌剂制备

将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到1.5l的含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/l卡那霉素的发酵培养基中，37℃培养4h；加入终浓度为10g/l的α-乳糖，控制发酵温度25℃，继续发酵18h，得到用于生产l-薄荷醇-α-糖苷的大肠杆菌(escherichiacoli)ife-agl538发酵液，湿菌体含量为30g/l。

(3)发酵转化

取步骤(2)制备的1l发酵液，用2mol/lnaoh调节ph8.0，直接用于催化反应。加入400g麦芽糖和终浓度50g/l的l-薄荷醇，放在40℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，进行催化反应，连续反应10h。

(4)l-薄荷醇-α-糖苷产物浓度检测

向1l的转化反应液中加入2.3l甲醇，充分搅拌后，过滤，收集滤液；将滤渣重新导入烧杯中，加入0.7l的甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3)，充分搅拌后过滤，收集滤液；混合两次过滤的滤液，取2ml滤液，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中。

色谱柱：cl8柱，250×4.6mm；柱温：30℃；流动相：ch3oh(甲醇)：h2o：c2hf3o2(三氟乙酸)＝70:30:0.01(体积比)；流速：1.0ml·min^-1；检测器：视差折光检测器；进样量：10μl。底物l-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min，产物l-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。

底物转化率和产物生产量的hplc分析结果：一次投料50g/l的l-薄荷醇底物，经过10h的转化，测得残留的底物l-薄荷醇浓度为0.5g/l，形成的产物l-薄荷醇-α-糖苷浓度约为100g/l，底物转化率为99％。

三、l-薄荷醇添加量100g/l的1l体系的催化转化应用

1l发酵液中的底物l-薄荷醇添加量为100g/l的催化转化。取1l大肠埃希氏菌(escherichiacoli)ife-agl538发酵液(同步骤二(2))，用2mol/lnaoh调节ph8.0。加入400g麦芽糖和100g的l-薄荷醇，放在40℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，进行催化反应，连续反应10h；补加100g麦芽糖，继续反应14h。

l-薄荷醇-α-糖苷产物浓度检测。

样品前处理：向1l的转化反应液中加入2.3l甲醇，充分搅拌后，过滤，收集滤液；将滤渣重新导入烧杯中，加入2.7l的甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3)，充分搅拌后过滤，收集滤液；混合两次过滤的滤液，取2ml滤液，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中。

色谱柱：cl8柱，250×4.6mm；柱温：30℃；流动相：ch3oh(甲醇)：h2o：c2hf3o2(三氟乙酸)＝70:30:0.01(体积比)；流速：1.0ml·min^-1；检测器：视差折光检测器；进样量：10μl。底物l-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min，产物l-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。

底物转化率和产物生产量的hplc分析结果：一次投料100g/l的l-薄荷醇底物，补加一次麦芽糖，经过24h的转化，测得残留的底物l-薄荷醇浓度为5.0g/l，形成的产物l-薄荷醇-α-糖苷浓度为196g/l，底物转化率为95％。

sequencelisting

<110>浙江工业大学

<120>一种含α-葡萄糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用

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