一种卤代对羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odcA及其应用的制作方法

本发明属于应用环境微生物领域，涉及一种卤代对羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca及其应用。

背景技术：

卤代对羟基苯甲酸作为一种重要的化工中间体，广泛应用于工业、农业化学品的合成，如医药、杀虫剂、除草剂和阻燃剂等。此外，卤代对羟基苯甲酸也是很多卤代芳烃(如多氯联苯，多溴联苯醚等)代谢的中间产物。由于卤代对羟基苯甲酸具有毒性、持久性和生物富集等特点，对人类健康和生态环境安全具有极大的威胁。因此，卤代对羟基苯甲酸在环境中的残留和污染已经引起广泛的关注。利用微生物修复有机物污染的方法是一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比传统的化学和物理修复方法具有更多的优势。微生物在有机污染物残留的生物学解决途径中有着独特的作用。微生物降解有机污染物的本质是微生物产生的酶对污染物的降解作用，从微生物中提取的降解酶来消除有机污染物残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca在卤代对羟基苯甲酸污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大酶作用的底物范围，广泛应用于环境中卤代对羟基苯甲酸的降解和脱毒，保护环境。

技术实现要素：

本发明的目的是提供从3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解菌株pigmentiphagasp.h8中克隆的氧化脱羧酶基因odca。

本发明的另一目的是提供氧化脱羧酶基因编码的氧化脱羧酶odca。

本发明的又一目的是提供该氧化脱羧酶基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种3,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca，其核苷酸序列为seqidno.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1209bp，g+c含量为68.3％，编码402个氨基酸，分子量为44.6kda。

本发明所述的卤代对羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca编码的氧化脱羧酶odca，氨基酸序列为seqidno.2。

含有本发明所述的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca的重组质粒。

作为本发明的一种优选方式，氧化脱羧酶基因片段与酶切好的pet-29a(+)进行酶连获得含氧化脱羧酶基因的pet-29a(+)重组质粒。

含本发明所述的重组质粒的重组微生物bl21(de3)。

作为本发明的一种优选方式，酶连好的含氧化脱羧酶基因的pet-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌e.colibl21(de3)获得重组微生物e.colibl21(de3)。

本发明所述的氧化脱羧酶基因odca在去除环境中卤代对羟基苯甲酸污染方面的应用。

本发明所述的氧化脱羧酶去除农作物、土壤和水体中的卤代对羟基苯甲酸污染方面的应用。

其中，所述的卤代对羟基苯甲酸优选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸。

本发明所述的重组微生物bl21(de3)在去除土壤、水体和农产品表面的卤代对羟基苯甲酸残留方面的应用。

其中，所述的卤代对羟基苯甲酸优选3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸。

有益效果

1.本发明从菌株pigmentiphagasp.h8(从卤代芳烃污染土壤中分离筛选获得的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解菌株，专利菌种保藏编号为cctccno：m2017222)中克隆出3,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca。

2.将该氧化脱羧酶基因odca克隆至高效表达载体pet29a(+)(购自novegen公司)获得重组表达质粒pet-odca，通过转化的方法将重组表达质粒pet-odca转移至高效表达菌株e.colibl21(de3)(购自invitrogen公司)，获得重组表达菌株e.colibl21(pet-odca)。

3.重组表达菌株e.colibl21(pet-odca)经过0.3mm的iptg诱导18h后，大量表达携带strepii-tag的氧化脱羧酶odca，进一步通过strep-tactinsepharosehp(购自ge公司)进行亲和层析获得纯的odca。

4.本发明对氧化脱羧酶基因odca表达的产物odca进行酶学降解试验，发现odca可快速降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸。

5.利用氧化脱羧酶基因odca构建的工程菌株能高效表达odca，生产的酶制剂可用于去除土壤、水体和农作物中残留的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸。

附图说明

图1为本发明重组菌株e.colidh5α(puc-odca)对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸的降解曲线。

图2为本发明重组高效表达菌株e.colibl21(pet-odca)的构建流程图

图3为本发明氧化脱羧酶基因odca在表达宿主菌e.colibl21(de3)中表达并纯化的蛋白sds-page电泳图。

图4为本发明氧化脱羧酶odca降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的代谢产物的气相-质谱检测图。

图5为本发明氧化脱羧酶odca转化3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的代谢机制。

图6为本发明氧化脱羧酶odca的最适反应温度及最适反应ph的研究结果图。

生物材料保藏信息

h8，分类命名为pigmentiphagasp.h8，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno：m2017222，保藏日期为2017年04月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

具体实施方式：

实施例13,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因的克隆

1.1菌株h8的基因组总dna的提取

菌株h8大量培养后，采用ctab法提取高纯度、大片段的基因组总dna，溶于te(ph8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考f·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

1.2基因组测序与目的基因获取

将检测合格的pigmentiphagasp.h8基因组dna送至上海派森诺生物科技有限公司，利用illuminamiseq测序平台进行细菌全基因组草图扫描。基因组测序结果表明，所述菌株h8基因组草图大小为5.59mb，预测共5722个开放阅读框(orf)。利用生物信息学分析方法，从基因组中获得降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸疑似的氧化脱羧酶基因odca，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

1.3氧化脱羧酶基因odca功能验证

将疑似的氧化脱羧酶基因定向克隆到表达载体puc18上，构建成puc-odca，并转化至表达宿主e.colidh5α中，获得重组菌株e.colidh5α(puc-odca)。进一步通过全细胞转化实验，发现该重组菌株e.colidh5α(puc-odca)可降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸(图1)，说明odca基因负责参与3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸的降解。

实施例23,5-二溴-4-羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca的高效表达与酶纯化

具体实验方案如图2所示。

2.1氧化脱羧酶基因odca的pcr扩增

引物序列：

odca-f：

cgacatatgtggagccacccgcagttcgaaaagacatcagaaactcaggta(ndei)(seqidno.3)；

odca-r：cataagctttcagcggatcgcggcggcc(hindiii)(seqidno.4)。

使用引物odca-f和odca-r扩增氧化脱羧酶基因odca(5’端携带编码strepii标签的核苷酸序列tggagccacccgcagttcgaaaag)，pcr扩增体系如下：

pcr扩增程序：

a.98℃变性2min

b.98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸80s，进行30个循环

c.68℃延伸10min，

d.10℃5min。

2.2酶切与酶连

将pcr扩增获得的odca基因以及载体pet29a(+)分别用ndei和hindiii进行分步酶切，酶切产物用dna纯化试剂盒进行回收。

按照如下反应体系，将经过ndei/hindiii双酶切后的odca基因片段酶连至同样酶切好的pet29a(+)载体，分别构建成重组质粒pet-odca。

16℃温育12小时。

2.3转化

将构建好的pet-odca转化至100μl表达宿主菌株e.colibl21(de3)的感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p23。涂布至含有50mg/l卡那霉素的lb平板，培养18h后挑取阳性克隆子。

2.4odca的表达与纯化

将重组表达菌株e.colibl21(pet-odca)接至100mllb培养基中，37℃培养至od6000.6左右，添加0.3mm的iptg于16℃诱导培养18h后，离心收集菌体。用磷酸盐(以下简称pbs)缓冲液离心洗涤菌体两次，超声波破碎，15000g离心20min取上清。将上清液进一步通过strep-tactinsepharosehp(购自ge公司)进行亲和层析获得纯的携带strepii标签的odca，并用sds-page电泳检测其纯度(图3)。

2.5odca对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解

odca转化3,5-二溴-4-羟基苯甲酸采用如下酶促反应体系：1ml20mm的tris-hcl缓冲液(ph7.5)中含有0.2mm的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸，0.3mmnadph，0.02mmfad，6μgodca。35℃条件下反应30min。在该酶促反应液中添加5m的hcl调ph至1，然后加等体积的二氯甲烷振荡萃取，将有机相层经无水硫酸钠脱水后转移至新的离心管中，使用n2吹干有机相。在吹干的离心管中加入吡啶和乙酸酐(1:3，[vol/vol])，45℃水浴20min，进行代谢产物的乙酰化反应，最后直接上样进行gc-ms检测。

gc-ms结果表明，产物的保留时间为17.419min，其质谱结果表明该产物为2,6-二溴对苯二酚(图4)，并与nistms数据库的检索结果高度吻合。因此，odca转化3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的机制为：以nad(p)h为电子供体和h供体，odca将氧气中的一个氧原子引入至3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的c1位，并脱去羧基，最终生成2,6-二溴对苯二酚，释放1分子co2和h2o(图5)。

2.6odca的酶学特性

将odca催化3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的反应设置在不同的温度下(4-45℃)进行，考察odca的最适反应温度。反应时间20min，反应结束后沸水中放置3min来终止反应，12000rpm，离心10min，上清液经0.22μm的水相滤膜过滤后进行hplc检测，测定不同温度下odca对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解率，以最适温度下的降解效率为100％，计算相对酶活。实验结果表明，在4～45℃范围内odca对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸都有一定的活性，且最适反应温度为35℃；当温度在25～40℃时，相对酶活在60％以上；当温度低于10℃时，相对酶活低于20％；当温度高于45℃时，相对酶活低于50％(图6)。

设置不同ph值范围的四种缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph3.5-6.0)、磷酸盐缓冲液(ph5.5-8.0)、tris-hcl缓冲液(ph7.5-9.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph8.5-10.5)，每0.5ph一个梯度。35℃条件下，将odca在上述不同ph值的缓冲液中对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸进行酶促反应20min，然后沸水中放置3min来终止反应。12000rpm离心10min，上清液经0.22μm的水相滤膜过滤后进行hplc检测，测定不同ph条件下odca对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解率，以最适ph的降解率设为100％，计算相对酶活力。实验结果表明，odca的最适反应ph是7；当ph在6-8之间，odca的相对活力保持在60％以上；当ph>9或<5时，odca的相对酶活低于40％(图6)。

图1表明odca可降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸，进一步通过酶促反应实验，计算出odca对不同底物的催化效率：1mgodca对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的催化效率为1321.4±38.4μmol/min，对3-溴-4-羟基苯甲酸的催化效率为92.2±4.5μmol/min，对3,5-二氯-4-羟基苯甲酸的催化效率为944.2±38.2μmol/min，对3-氯-4-羟基苯甲酸的催化效率为81.8±14.8μmol/min。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种卤代对羟基苯甲酸氧化脱羧酶基因odca及其应用

<141>2017-08-25

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>3

<211>1209

<212>dna

<213>pigmentiphagasp.h8

<400>3

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