人EZH2突变基因及其应用的制作方法

文档序号：13327005阅读：723来源：国知局

本发明属于基因检测和应用领域，具体涉及ezh2突变基因、ezh2突变基因检测及其在胃癌化疗疗效评估中的应用。

背景技术：

胃癌是中国人最常罹患和最易致死的主要癌症，其发病率位居恶性肿瘤的第二位、死亡率位居第三位。目前临床上对于胃癌化疗疗效评估主要依靠的是影像学手段和血清学指标等。然而影像学手段往往存在一定的滞后，且有时无法准确反映癌灶的分子实质；而cea、ca72-4、ca19-9等血清标记物普遍特异性不强，其监测对于胃癌的预后判断和诊疗指导价值有限。

ezh2(enhancerofzestehomolog2)是近年揭示的一种人类基因，它是pcg(polycombgroup)基因家族的核心成员。pcg家族包括prc1和prc2两种多聚复合物，分别起着维持基因抑制和起始基因沉默的作用。prc2复合物是由包括ezh2在内的几个基因共同构成，ezh2是prc2的催化活性成分，其高度保守的set结构域可对核小体组蛋白h3的第9、27位赖氨酸进行甲基化修饰，从而抑制包括细胞生长、分化、肿瘤转移等相关的数百种基因的表达。

ezh2基因在胚胎发育过程中通过对染色体的修饰而维持同源异型基因的沉默状态。此外，该基因在人类很多类型恶性肿瘤过度表达，其在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。首先发现在血液系统恶性肿瘤中发现ezh2基因的高表达，随后又在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和胃癌中都发现有该基因高表达，而其在对应的正常组织中不表达或仅少量表达。ezh2蛋白已作为一种新的肿瘤标记物用于监测前列腺癌、乳腺癌等的恶性演变。

ezh2基因含20个外显子和19个内含子，外显子长度为41-323bp，开放读码框分布在19个外显子上；内含子长度为0.15-17.7kb，已知的转录后有两个剪接体：转录变异体1和转录变异体2；cdna全长2.7kb，编码613个氨基酸。ezh2基因的c端因有1个su(var)3-9、enhancerofzeste和trithorax三种蛋白共同结构域而命名的高度保守的set结构域；ezh2蛋白所介导转录抑制需要依赖完整的set区域，所以说该set区域如果丢失了就不能产生抑制表型，并且在一些情况下可以使基因去抑制化。而ezh2的19号内含子如果发生特定突变，引起可变剪切发生将导致set区域缺失，从而肿瘤细胞中无法依靠ezh2修饰抑癌基因。

目前，ezh2基因对于胃癌的临床指导和应用还远未得到充分揭示和开展。申请人前期选择胃癌患者的ctdna（circulatingtumordna，循环肿瘤dna）样本，对其进行包括ezh2基因在内的基因集的捕获测序（即目标基因捕获联合二代测序技术）研究；结合样本的临床病理信息分析，发现ezh2基因第19号内含子的特定突变对胃癌的预后可实现良好的评估和预测，具有作为胃癌化疗疗效评估指标的潜能，目前国内外尚无此特定突变及其应用的报道。对于预后预测，从ctdna样本入手便于建立无创的检测方法是当前临检的趋势和热门，然而由于ctdna含量很低且碎片化严重，因此传统的基于sanger测序和实时荧光定量pcr的检测方法均不适合。二代测序技术可以灵敏有效地对稀有突变进行高通量检测，并且可以发现未知突变，因此是一种理想的检测方法。

技术实现要素：

针对目前临床上缺乏特异有效的胃癌化疗疗效评估指标的不足，本发明提供了与此相关的ezh2基因的特定突变特征及其检测方法，并将其应用于胃癌的化疗疗效评估中。这些可以为胃癌化疗疗效评估、病情监测和发生发展机理的解析等提供依据和基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的1在于提供人ezh2突变基因，其突变发生于ezh2基因的19号内含子的第1234-1240位点，含第1234和第1240位点（参见图1）；所发生的突变包括缺失、插入或点突变但不限于此的一种或几种。优选地，所述ezh2基因突变是指其19号内含子第1236-1238位点的3个胸腺嘧啶核苷酸的缺失（对应的突变内含子序列如seqidno:1所示）、第1236-1239位点的4个胸腺嘧啶核苷酸的缺失（对应的突变内含子序列如seqidno:2所示）、第1235-1240位点的6个胸腺嘧啶核苷酸的缺失（对应的突变内含子序列如seqidno:3所示）和第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入（对应的突变内含子序列如seqidno:4所示）中但不限于此的一种或几种。seqidno:5为野生型ezh2参考基因19号内含子序列。

本发明的目的2在于提供人ezh2突变基因检测方法，主要步骤如下：

（1）ezh2基因的捕获

提取待测样本基因组dna，利用设计合成的液相捕获探针组或pcr捕获引物组进行ezh2基因区域的捕获；

（2）二代测序解析突变谱

将（1）中的捕获产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点。

其中，步骤（1）中所述的液相捕获探针组或pcr捕获引物组需要包含能够捕获ezh2基因的19号内含子第1234-1240位点的探针集或引物集，所述的第1234-1240位点包含第1234和第1240位点；相关探针和引物可委托商业化生物公司设计并合成。

其中，步骤（2）中所述的捕获产物进行的二代测序和信息分析，有二代测序仪和配套分析软件则按照规范操作和分析进行，或可由商业化的高通量测序公司完成；最终测序结果得到的突变位点需包含ezh2基因的19号内含子第1234-1240位点（包含第1234和1240位点）的突变信息。

其中，步骤（2）中所述的突变位点，是指ezh2基因的19号内含子的第1234-1240位点，包含第1234和第1240位点，所述的突变包含缺失、插入或点突变但不限于此的一种或几种；优选地，所述突变是指ezh2基因19号内含子第1236-1238位点的3个胸腺嘧啶核苷酸的缺失、第1236-1239位点的4个胸腺嘧啶核苷酸的缺失、第1235-1240位点的6个胸腺嘧啶核苷酸的缺失和第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入中但不限于此的一种或几种，所列这4种突变顺序对应的突变内含子序列分别如seqidno:1-4所示。seqidno:5为野生型ezh2参考基因19号内含子序列。

本发明的目的3在于提供人ezh2突变基因检测在胃癌化疗疗效评估中的应用，主要步骤如下:

（1）样本采集

采集胃癌患者化疗前后2-10次样本；

（2）ezh2基因的捕获测序

提取待测样本的基因组dna，利用设计合成的液相捕获探针组或pcr捕获引物组进行ezh2基因区域的捕获，之后将捕获产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点；

（3）化疗疗效评估

依据连续化疗前后样本ezh2基因特定突变检测结果预测患者的疾病进展：前一样本中检出ezh2基因特定突变，后一样本未检出同样的突变或检出但突变频率降低，则预测病情进展；前一样本中检出ezh2基因特定突变，后一样本检出同样突变但突变频率升高，则预测病情稳定或病情缓解；前一样本中未检出ezh2基因特定突变，后一样本检出突变，则预测病情稳定或病情缓解；前后样本均未检出ezh2基因特定突变，则不做预测。

其中，步骤（1）中所述化疗前后，其间隔不超过3个月。前面采集的为前一样本，后面采集的为后一样本。

其中，步骤（1）中所述样本包括但不限于新鲜组织、冰冻组织、甲醛浸泡组织、甲醛固定石蜡包埋组织切片，新鲜血液、血浆和血清，胸水、腹水和肿瘤脱落细胞；对于每种样本类型，必须同时采集癌灶样本和正常组织样本进行分析，此处癌灶样本包括能获取癌灶基因突变信息的样本如血液（测定其ctdna）。优选地，选择新鲜的抗凝血5-100ml。

其中，步骤（2）中所述二代测序，对于癌灶样本其测序深度为1000×-10000×之间。

其中，步骤（3）中所述ezh2基因特定突变是指，发生于其19号内含子的第1234-1240这7个位点的缺失、插入或点突变但不限于此的一种或几种突变；优选地，所述特定突变是指ezh2基因19号内含子第1236-1238位点的3个胸腺嘧啶核苷酸的缺失、第1236-1239位点的4个胸腺嘧啶核苷酸的缺失、第1235-1240位点的6个胸腺嘧啶核苷酸的缺失和第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入中但不限于此的一种或几种，所列这4种突变顺序对应的突变内含子序列分别如seqidno:1-4所示。seqidno:5为野生型ezh2参考基因19号内含子序列。

其中，步骤（3）中所述突变，其检出频率必须超过5%；所述突变频率降低和升高，其降幅和升幅必须超过20%，不足20%则认为是小波动稳定。所述病情进展、稳定和缓解依据的是《nccn临床实践指南：胃癌》（2012版）。

本发明提供的ezh2基因的19号内含子的特定突变特征目前尚未见报道，这可以为胃癌发生发展机理的解析和药物开发等提供依据和基础。其次，本发明提供的基于目标基因捕获联合二代测序技术的ezh2突变基因检测方法，可以应用于ctdna和ffpe基因组等含量低微且碎片化严重的样品检测，实现灵敏特异、高效全面、快速准确的突变检测。最后ezh2突变基因及其检测方法的应用，将有助于胃癌化疗疗效评估和病情监测以期指导治疗方案的制定。

附图说明

图1是人ezh2基因第19号内含子特定突变示意图。图中黑色方框代表19号（左）和20号外显子（右），其间的横线代表19号内含子；箭头指向位点，1表示19号内含子的起始即在19号外显子最右端核苷酸往右第1个位点，粗线区表示突变发生区域即第1234-1240位点处。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

选择所在医院经病理确诊的胃癌患者1例（编号1#），在其签署了知情同意书的情况下，采集其治疗过程中的血样2份，进行ctdna样本的基因捕获和二代测序，同时收集其临床治疗和病情评估信息，最后进行综合分析（详见表1）。

（1）血样采集

取患者肘静脉的edta抗凝血5ml（采血时间见表1），在1小时内分离血浆和单核细胞，其中血浆样本含ctdna可用于反映癌灶的信息，单核细胞含正常基因组dna用于做参照。

（2）ezh2基因的捕获测序

将（1）中样品用干冰寄送至华大基因进行基因捕获和二代测序。采用qiaampcirculatingnucleicacidkit（德国qiagen公司）提取ctdna，用qiaampdnabloodminikit（德国qiagen公司）提取单核细胞基因组dna；使用can_panel_ez_hx3(1.7m)目标区域捕获芯片进行捕获，该芯片可以捕获ezh2基因的19号内含子第1234-1240位点（包含第1234和第1240位点）区域。

采用美国illumnia公司的hiseq2500平台进行测序，血细胞正常基因组dna样本的平均测序深度大于200×，血浆ctdna样本的平均测序深度大于1000×。采用hiseq2500配套分析软件对测序结果初步分析，以血细胞正常基因组dna样本测序结果为参照，再用千人基因组数据库、snp数据库和cosmic(version64)数据库等进行血浆ctdna样本突变位点解析，结果如表1所示。

（3）化疗疗效评估

该患者前一次血样（2015.5.28）未检出ezh2基因的19号内含子第1234-1240位点发生突变，而后一次血样（2015.6.25）则检出了第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入即[1234-1235instt]突变（检出2次），对应19号内含子序列如seqidno:5所示，该突变属于第1234-1240位点上的突变，且突变频率高达60%。也就是说前一次样本未检出突变，但后一次样本检出了突变，因此可以预测该患者2015.6.25之后病情发展为稳定或缓解。该患者于2015.7.10经临床评估病情为sd即稳定，2015.8.27再次评估仍为sd；由此验证了基于ezh2突变基因的预测。

表11#胃癌患者样本测序和临床评估结果

实施例2

选择所在医院经病理确诊的胃癌患者1例（编号2#），在其签署了知情同意书的情况下，采集其治疗过程中的血样3份，进行ctdna样本的基因捕获和二代测序，同时收集其临床治疗和病情评估信息，最后进行综合分析（详见表2）。具体过程参见实施例1。

该患者前一次血样（2015.6.16）检出了ezh2基因的19号内含子第1236-1238位点的3个胸腺嘧啶核苷酸的缺失即[1236-1238delttt]突变（检出9次），对应19号内含子序列如seqidno:1所示，该突变属于第1234-1240位点上的突变，且突变频率高达52.63%；此外，本次血样（2015.6.16）还检出了ezh2基因的19号内含子第1236-1239位点的4个胸腺嘧啶核苷酸的缺失即[1236-1239deltttt]突变，对应19号内含子序列如seqidno:2所示，该突变属于第1234-1240位点上的突变，且突变频率为15%。中间一次血样（2015.8.11）和后一次血样（2015.8.27）均未检出突变；也就是说前一次样本检出了突变，后两次样本又未检出突变，因此可以预测该患者2015.8.11前后病情为进展。该患者于2015.8.10经临床评估病情为pd即进展，由此验证了基于ezh2突变基因的预测。

表22#胃癌患者样本测序和临床评估结

实施例3

选择所在医院经病理确诊的胃癌患者1例（编号3#），在其签署了知情同意书的情况下，采集其治疗过程中的血样3份，进行ctdna样本的基因捕获和二代测序，同时收集其临床治疗和病情评估信息，最后进行综合分析（详见表3）。具体过程参见实施例1。

该患者前一次血样（2015.3.31）未检出突变，而中间一次血样（2015.5.15）检出了ezh2基因的19号内含子第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入即[1234-1235instt]突变（检出2次），对应19号内含子序列如seqidno:5所示，该突变属于第1234-1240位点上的突变，且突变频率高达50%；后一次血样（2015.7.21）未检出突变。也就是说前一次样本未检出突变，但中间一次样本检出了突变，到后一次样本又未检出突变；因此可以预测该患者2015.5.15之后病情发展为稳定或缓解，而2015.7.21之后病情发展为进展。该患者于2015.6.28经临床评估病情均为sd即稳定，2015.8.15再次评估则为pd，由此验证了基于ezh2突变基因的预测。

表33#胃癌患者样本测序和临床评估结果

实施例4

选择所在医院经病理确诊的胃癌患者1例（编号4#），在其签署了知情同意书的情况下，采集其治疗过程中的血样3份，进行ctdna样本的基因捕获和二代测序，同时收集其临床治疗和病情评估信息，最后进行综合分析（详见表4）。具体过程参见实施例1。

该患者前一次血样（2015.4.2）和中间一次血样（2015.4.24）均未检出突变，而后一次血样（2015.7.4）则检出了ezh2基因的19号内含子第1235-1240位点的6个胸腺嘧啶核苷酸的缺失即[1234-1240deltttttt]突变（检出2次），该突变属于第1234-1240位点上的突变，且突变频率高达50%；也就是说前两次样本未检出突变，而后一次样本检出了突变，因此可以预测该患者后一次即2015.7.4前后病情发展为稳定或缓解。该患者虽无2015.7.4之后的临床病情评估结果，然而其于2015.6.17经临床评估病情为pr即缓解，而2015.7.4血样检出突变，预示7.4前后为稳定或缓解，又6.17和7.4在时间上非常接近，因此此例患者结果也验证了基于ezh2突变基因的预测。

表4胃癌患者样本测序和临床评估结果

实施例5

选择所在医院经病理确诊的胃癌患者1例（编号5#），在其签署了知情同意书的情况下，采集其治疗过程中的血样3份，进行ctdna样本的基因捕获和二代测序，同时收集其临床治疗和病情评估信息，最后进行综合分析（详见表5）。具体过程参见实施例1。

该患者前一次血样（2015.6.2）检出了ezh2基因19号内含子第1234-1235位点2个胸腺嘧啶核苷酸的插入即[1236-1237instt]突变（检出2次），该突变属于第125-131位点上的突变，且突变频率高达50%；中间一次血样（2015.7.3）和后一次血样（2015.8.4）均未检出突变；也就是说前一次样本检出了突变，后两次样本又未检出突变，因此可以预测该患者2015.8.4之后病情发展为进展。该患者于2015.12.23经临床评估病情为pd即进展，由此验证了基于ezh2突变基因的预测。

表55#胃癌患者样本测序和临床评估结果

综上可知，本发明提供的ezh2突变基因及其检测方法以及其在胃癌化疗疗效评估中的应用是准确和可靠的，并且由于分子特征改变早于细胞组织和影像学形态，因此其具有良好的时效性和前瞻性。进一步扩大胃癌患者数量验证，发现样本中含ezh2突变基因的患者数占总患者数的50%，可知ezh2突变基因可作为一个较为广泛和普遍的指标。

由于基于本发明提供的ezh2基因第19号内含子特定突变信息序列的公布，为了开展胃癌相关机理机制研究和检测评估方法开发等科研和临床工作需要，可将此类突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，置于-80℃冰箱中保存；此外，还可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。

虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建医科大学

福建省创欣生物科技有限公司

<120>人ezh2突变基因及其应用

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1361

<212>dna

<213>人工序列

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