一种牛支原体环介导等温扩增检测方法及其应用与流程

本发明涉及动物病原分子检测技术领域，具体涉及一种牛支原体环介导等温扩增检测方法及其应用。

背景技术：

牛支原体(mycoplasmabovis)是一种重要的引起牛呼吸道炎症、乳腺炎和关节炎等多系统炎症的致病性病原体。牛支原体属于柔膜体纲，支原体目，支原体属，1961年hale等在美国首次从患有乳腺炎的病牛中分离得到。世界多个国家都证实该病原及其相关疾病广泛流传，极大地威胁了养牛业的健康发展。我国自2008年首次在病牛肺脏分离得到m.bovis病原，随后证实该病在全国不同地方广泛流行，导致严重的经济损失。虽然，病毒分离可确诊牛支原体，但是，由于支原体培养周期长、难度大，不能作为快速诊断牛支原体感染的方法。pcr方法虽然快速精确，但是需要在实验室才能完成，不适合临床和基层使用。因此，建立一种高效、快速、特异的检测方法具有重要意义。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationmethod，lamp)具有高特异性、高灵敏性、简单、快捷及成本低的特点，很好的解决了上述难题，广泛用于疾病的诊断、检测等领域。

发明专利cn101736085b公开了一种牛支原体环介导等温扩增检测方法，其步骤包括：(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因uvrc的序列设计两对特异引物；(2)培养牛支原体；(3)提取牛支原体总dna；(4)环介导等温扩增反应和(5)环介导等温扩增反应产物分析。本发明可以100％扩增到临床分离到的牛支原体，且特异性强，对呼吸道常见菌可以作鉴别检测。但是，牛支原体和牛无乳支原体在16srna的同源性为99％，且两者的其他基因序列也有很大相似性，因此，能否准确区分这两种菌株体现引物特异性高低，该专利选用的牛支原体uvrc基因与牛无乳支原体的uvrc基因的同源性为82％-83％，用uvrc基因分辨牛支原体和牛无乳支原体有一定的难度，而且，特异性实验中样本也没有包含牛无乳支原体，所以该套引物能否区分牛支原体和牛无乳支原体还未可知；并且，选用的菌株为丝状支原体山羊亚种pg3、绵羊肺炎支原体y98、牛鼻气管炎病毒、大肠杆菌、牛型分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌，其中丝状支原体山羊亚种pg3、绵羊肺炎支原体y98是不会感染牛的，因此选用这两种菌株根本无实际意义；该专利采用sybrgreeni染料进行染色，但是，申请人根据大量实验发现，该方法特异性不强，阴性和阳性结果区分很不明显，不管肉眼还是紫外光下观察都没有明显区别，因为sybrgreeni染料是结合于所有的双链dna双螺旋区域，具有绿色激发波长的染料，而dna浓度实验过程中的改变对荧光的强度影响肉眼无法准确区分，因此该方法结果有时无法判定。

发明专利cn104651519a公开了一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括lamp引物、2×反应缓冲液、bstdna聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体dna模板，所述的lamp引物包括外引物f3与b3和内引物fip与bip。特异性检测和敏感性检测证实，该专利申请提供的lamp检测方法可实时监测反应并且定量检测出牛支原体的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测牛支原体带来便利。但是，该专利在结果检测中采用的对照菌株没有无乳支原体，因此，该套引物能否区分和牛支原体相似性最高的牛无乳支原体未知，所以其结果的特异性就有待考证；并且，申请人通过大量实验发现钙黄绿素荧光试剂的结果特异性不高，肉眼无法区分，且结果不稳定，不适合实际应用，并且，

也不推荐临床使用。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足和缺陷，本发明提供了一种牛支原体环介导等温扩增检测方法，该方法在牛支原体检测中快速、灵敏、特异而又简单实用。

一种牛支原体环介导等温扩增检测方法，具体包括以下步骤：

(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因p81设计两对特异性引物，所述引物组成的dna序列如下：

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(2)配置pplo液体培养基；

(3)培养牛支原体：取pplo液体培养基接种牛支原体菌液，在含有5％co2、37℃温箱中培养3天，待pplo液体培养基由红色变为橙色并液体透亮后停止培养，使用dna提取试剂盒提取dna；

(4)环介导等温扩增反应：以fip、bip为内引物，f3、b3为外引物对牛支原体dna进行等温扩增，其反应体系为：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和内引物各0.8μm，ddh2o补齐至25μl，置于64℃水浴锅中40min，80℃10min终止反应；

(5)环介导等温扩增反应产物分析：步骤(4)的反应产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳30min，在凝胶成像系统中成像。

凝胶成像结果中，产物为梯形条带证明为牛支原体阳性，反之，为牛支原体阴性。

优选的，步骤(2)pplo液体培养基的配置中，取肉汤粉4.2g，酵母提取物5g，1％酚红指示剂0.4ml，葡萄糖1g，加水至200ml，高压灭菌后冷却至后加入40ml马血清，100mg/ml的青霉素200μl。

进一步，步骤(3)中，按照1:1000的比例将牛支原体菌液接种至pplo液体培养基上。

优选的，步骤(3)中，所述dna提取试剂盒为血液dna提取试剂盒或组织dna提取试剂盒。

进一步，本发明的牛支原体环介导等温扩增检测方法在牛支原体检测中的应用。

本发明方法具有如下优点：

(1)与传统的普通pcr方法相比，本发明的牛支原体环介导等温扩增检测方法经济实用，不需要昂贵的pcr仪器，水浴锅即可；本发明的方法灵敏度高，可检测到10³拷贝数的牛支原体目的基因，普通pcr只能检测到10⁴拷贝数，灵敏度高10倍；本发明采用4条引物，特异性强，识别6个位点，增加了与牛支原体目的基因结合的特异性。

(2)与现有的牛支原体环介导等温扩增方法相比，本发明采用的牛支原体p81基因与牛无乳支原体同源性74％，比uvrc基因的同源性更低，并且，通过特异性检测实验可以证明，本发明的引物能够准确区分牛支原体和牛无乳支原体，检测过程中能够把最有可能干扰检测结果的菌株排除。

(3)与现有的牛支原体环介导等温扩增方法相比，本发明在结果检测中采用的菌株为无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌，其中，无乳支原体和牛支原体基因相似度高，并且，其他菌株也都是能引起牛肺炎的病原，与牛支原体引起的主要症状一致，较说服力更强，因此，本发明具有更强的实用性能。

综合上述，本发明根据牛支原体特异性基因p81设计两对特异性引物建立的牛支原体环介导等温扩增方法，快速、简单、灵敏，能够特异的检测出牛支原体感染。

附图说明

序列表seqidno：1是本发明牛支原体特异性基因p81的核苷酸序列；

图1为lmap扩增目的片段，下划线序列为引物结合区域；

图2为lamp检测牛支原体试验流程；

图3为组织样本检测；其中，泳道m：dl2000dnamarker，泳道1-6：阳性组织、阴性组织、阴性组织、阳性组织、阳性组织、阴性对照；

图4为牛支原体特异性检测；其中，泳道m：dl2000dnamarker，泳道1-8分别为：牛支原体、无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌、阴性对照；

图5为p81基因pcr电泳；其中，泳道m：dl2000dnamarker，泳道1：p81基因；

图6为牛支原体灵敏度检测；其中，泳道m：dl2000dnamarker，泳道1-9：依次阳性质粒拷贝数为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10；

图7为普通pcr灵敏度检测；其中，泳道m：dl2000dnamarker，泳道1-9：依次阳性质粒拷贝数为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10；

图8为牛支原体菌落镜检图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1对临床分离到的牛支原体进行检测

1、牛支原体的分离及培养

将病牛肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌后，切取一小块深层病变组织，接种pplo固体培养基(配方：pplo肉汤粉4.2g，酵母提取物5g，1％酚红指示剂0.4ml，葡萄糖1g，加水至200ml，高压灭菌后冷却至后加入40ml马血清，100mg/ml的青霉素200μl，琼脂粉3g)。在含有5％co2的37℃温箱培养3天，置于40×显微镜下观察有煎蛋样支原体菌落，挑取单菌落接种pplo液体培养基，5％co2的37℃温箱培养3天，液体由红色变为橙色透明液体表明仅有支原体生长。

2、lamp扩增

如图1所示，根据牛支原体特异性基因p81通过lamp在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)及primerexplorerv5设计引物，最终确定71bp-296bp的碱基序列之间的6个不同区域设计lamp扩增反应所需要的两对特异性引物，其中，内引物为fip和bip，外引物为f3和b3，且引物组成的dna序列如下：

fip

5’-tgaccagatgaaaagctaacaccttatgaagatctaggaaaagatgca-3’，

bip

5’-tgaggctcacaaaaatgataaacactcagggtaacctgaaccta-3’，

f35’-ctaagtgtggtggaactgta-3’，

b35’-tttaattcagtgatgactgtgt-3’；

提取牛支原体总dna：使用商品化试剂盒提取dna，-20℃保存。该dna提取试剂盒为血液dna提取试剂盒或组织dna提取试剂盒均可。

如图2所示，环介导等温扩增反应：以fip、bip为内引物，f3、b3为外引物对牛支原体dna进行等温扩增，反应体系为：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和内引物各0.8μm，ddh2o补齐至25μl。置于64℃水浴锅中40min，80℃10min终止反应。

环介导等温扩增反应产物分析：其反应产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳30min，在凝胶成像系统中成像。如图3所示，产物为梯形条带证明为牛支原体阳性，反之，为牛支原体阴性。

实施例2牛支原体lamp检测方法特异性实验

培养表1所列菌株：无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌。

表1牛支原体lamp检测方法特异性实验(验证实验)

注：“+”表示可以检测到有梯形条带，“-”表示不能检测到。

环介导等温扩增反应：以fip、bip为内引物，f3、b3为外引物分别对从牛支原体、无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌的dna进行等温扩增，反应体系为：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和内引物各0.8μm，ddh2o补齐至25μl，置于64℃水浴锅中40min，80℃10min终止反应。

环介导等温扩增反应产物分析：其反应产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳30min，在凝胶成像系统中成像。如图4所示，产物为梯形条带证明为牛支原体阳性，反之，为牛支原体阴性。

实施例3牛支原体lamp检测方法灵敏度实验

用牛支原体p81基因的阳性质粒作模板，检测牛支原体lamp方法的灵敏度。方法如下：

按照实施例1的方法培养牛支原体并提取牛支原体总dna。

用普通pcr扩增出目的片段：用p81全长引物扩增出牛支原体总dna中目的基因，反应体系：ex-taq酶1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，10×buffer4μl，dntp4μl，ddh2o27μl，模板dna2μl。将上述试剂混匀放置于pcr仪中，反应参数设置为：

pcr产物分析：取50μlpcr产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120v电泳30min，凝胶成像系统中成像。如图5所示，可以看到2100bp片段。

阳性质粒构建：将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段(购自tiangen公司)。将回收目的产物与pmd-18t载体连接，连接体系为：pmd-18t载体1μl，目的片段5μl，solutioni4μl，16℃连接8h。将连接产物转化dh5ɑ感受态，37℃摇床培养12h，提取质粒，通过测序的方法鉴定重组质粒。

将阳性质粒通过紫外分光光度计测定浓度，计算质粒拷贝数。公式为：

经计算阳性质粒拷贝数为：2.33×10¹⁰。用ddh2o将上述质粒进行倍比稀释，使其终浓度10⁹copies/μl，10⁸copies/μl，10⁷copies/μl，10⁶copies/μl，10⁵copies/μl，10⁴copies/μl，10³copies/μl，10²copies/μl，10copies/μl。

lamp灵敏度实验：以fip/bip为内引物，以f3/b3为外引物对阳性质粒进行扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10。体系中其它试剂为1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和内引物各0.8μm，ddh2o补齐至25μl。置于64℃水浴锅中40min，80℃10min终止反应。

结果分析：其反应产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳30min，在凝胶成像系统中成像。如图6所示，结果lamp对阳性质粒的扩增下限为10³个。

对阳性质粒进行普通pcr扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10。如图7所示，普通pcr对阳性质粒的扩增下限为10⁴个。

实施例4：对牛支原体肺炎病变肺脏检测

对临床三份牛支原体阳性肺脏和两份牛支原体阴性肺脏进行lamp检测。

牛支原体培养方法如下：将病牛肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌后，切取一小块深层病变组织，接种pplo固体培养基。在含有5％co2的37℃温箱培养3天，置于40×显微镜下观察有煎蛋样支原体菌落，挑取单菌落接种pplo液体培养基，5％co2的37℃温箱培养3天，液体由红色变为橙色透明液体表明仅有支原体生长。显微镜下观察结果如图8，可见典型的煎蛋样菌落。

lamp检测程序如下：取出1g左右组织，放置高压灭菌后的玻璃研磨器中，加入1mlpbs研磨，5000rpm离心1min，取上清，使用dna提取试剂盒提取dna。

环介导等温扩增反应：以fip、bip为内引物，f3、b3为外引物对牛支原体dna进行等温扩增，反应体系为：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和内引物各0.8μm，ddh2o补齐至25μl。置于64℃水浴锅中40min，80℃10min终止反应。

环介导等温扩增反应产物分析：其反应产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，120v电压电泳30min，在凝胶成像系统中成像。如图3所示，三份为牛支原体阳性肺脏和两份为牛支原体阴性肺脏，与事实相符。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>吉林省凯博生物技术有限公司

<120>一种牛支原体环介导等温扩增检测方法及其应用

<130>2017-08-03

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2080

<212>dna

<213>牛支原体(mycoplasmabovis)

<400>1

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gcagtgtctgctaagtgtggtggaactgtaaattatgaagatctaggaaaagatgcaaaa120

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